抗病毒生防菌f01菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1、抗病毒生防菌F-01菌株發(fā)酵條件優(yōu)化摘要：以高氏1號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過(guò)單因素分析和正交試驗(yàn)，對(duì)抗病毒生防菌F-01 菌株最佳培養(yǎng)基和最優(yōu)培養(yǎng)、條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：適宜FX05產(chǎn)抑綠膿桿菌活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為小米粉（2g）、酪蛋白胨（0.1g ）、K2HP040.05g）、MgSO4.7H2Q0.05g）、NaCI （0.05g）、FeS04.7H20（0.001g）。發(fā)酵條件為初始 pH為8.0,培養(yǎng)溫度為28 C ,培養(yǎng) 120 h產(chǎn)抑菌物質(zhì)達(dá)最大值。關(guān)鍵詞：抗病毒生防菌；活性物質(zhì)；培養(yǎng)條件優(yōu)化第一章緒論1.1鏈霉菌活性產(chǎn)物鏈霉菌是放線菌目的一科?；鶅?nèi)菌絲不斷裂，氣生菌絲通常發(fā)育

2、良好，形成 長(zhǎng)（有時(shí)短）的抱子絲。抱子不能運(yùn)動(dòng)，外鞘上常有疣、刺或毛發(fā)等狀飾物。鏈 霉菌是抗生素產(chǎn)生最豐富最多的放線菌種屬， 長(zhǎng)期以來(lái)一直被開(kāi)發(fā)各種用途的抗 生素，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和病理學(xué)研究的不斷深入，人們從鏈霉菌中逐漸發(fā)現(xiàn)的 生物活性物質(zhì)除了抗生素外，還有酶制劑、免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)、藥理活性物質(zhì)、抗菌 劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、殺蟲(chóng)殺螨和除草劑等多種物質(zhì)。鏈霉菌是天然活性物質(zhì)與 藥物的重要微生物資源，是研究微生物生長(zhǎng)、發(fā)育和次生代謝功能的良好材料。 由于其復(fù)雜的形態(tài)、獨(dú)特的代謝途徑及次生代謝產(chǎn)物的多樣性，鏈霉菌已成為人 們關(guān)注和研究的重點(diǎn)對(duì)象，顯示了鏈霉菌在科學(xué)、經(jīng)濟(jì)以及社會(huì)領(lǐng)域巨大的研究 價(jià)值。放線

3、菌中以鏈霉菌合成抗生素次生代謝產(chǎn)物的能力最強(qiáng)，鏈霉菌可產(chǎn)生多 種次生代謝產(chǎn)物，包括水解酶與抗生素等物質(zhì)，其在醫(yī)藥、飼料添加劑等領(lǐng)域有 廣泛的應(yīng)用，而且在植物保護(hù)方面發(fā)揮了相當(dāng)大的作用。 鏈霉菌基因組是目前己 知的最大的原核生物基因組，其基因組染色體呈線狀，而且具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)?；?因組中GC含量平均為73%。天藍(lán)色鏈霉菌假（Streptomy-ces.coelicolor ）作 為鏈霉菌屬的典型代表種，其全基因組序列已于2001年7月在英國(guó)劍橋Sanger 中心測(cè)序完成，這是第一個(gè)完成的全基因組測(cè)序的鏈霉菌，也是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的放線菌。鏈霉菌染色體富含次生代謝基因簇和調(diào)控基因，鏈霉菌中某

4、一特定次生代謝途徑相關(guān)的基因通常以基因簇 7VK6MAI#勺形式存在線狀染色體 上,鏈霉菌基因組富含次生代謝物合成基因簇鏈霉菌基因組同樣富含編碼調(diào)控 蛋白的基因，鏈霉菌這種基因組構(gòu)成特點(diǎn)與其生存在高度競(jìng)爭(zhēng)的土壤環(huán)境中相適 應(yīng)。土壤中存在各種脅迫壓力（化學(xué)、物理和生物的），而鏈霉菌是靜止生物， 面對(duì)脅迫相對(duì)被動(dòng)。因此，鏈霉菌除產(chǎn)生抗生素抑殺“異己”外，其基因組富含 編碼調(diào)控、轉(zhuǎn)錄蛋白的基因也有利于其感應(yīng)各種環(huán)境信號(hào)和生理信息并作出反 應(yīng)，行使各種復(fù)雜功能，從而在具有高度競(jìng)爭(zhēng)的土壤環(huán)境得以良好的生存。放線菌產(chǎn)生的抗生素中有90%是以鏈霉菌作為生產(chǎn)菌種生產(chǎn)的現(xiàn)已從鏈霉菌中得 到土霉素、金霉素，氯霉素

5、、紅霉素等氨基糖苷類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)，多烯類(lèi)、聚醚類(lèi)抗生素。由于抗生素的廣泛及長(zhǎng)期應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重， 因此迫切要進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)新型、高效、低毒的抗耐藥菌抗生素。隨著抗生素 數(shù)量的不斷增加，從鏈霉菌中篩選到的新抗生素就變得越來(lái)越困難， 篩選得到的 化學(xué)物質(zhì)重復(fù)率非常高。然而這并不意味著鏈霉菌中可發(fā)掘的資源沒(méi)有了，根據(jù)天然產(chǎn)物趨勢(shì)推測(cè)，鏈霉菌中還存在大量未知的抗生素有待進(jìn)一步挖掘。作為一種很有潛力的發(fā)掘新抗生素的途徑，共培養(yǎng)誘導(dǎo)方法為現(xiàn)有微生物資源的開(kāi)發(fā)與 利用揭示了新思路。鏈霉菌是存在于土壤當(dāng)中的一類(lèi)重要的微生物類(lèi)群，其可以產(chǎn)生豐富的次生 代謝產(chǎn)物，是重要的天然抗生素來(lái)源，一

6、些鏈霉菌代謝產(chǎn)生的抗生素類(lèi)的次生代 謝產(chǎn)物可以有效抑制水稻紋枯病的發(fā)生。拮抗放線菌生物防治病害的途徑主要有 兩種途徑：一是寄生在植物組織體內(nèi)，誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗病性或代謝出一些具 有抑菌作用的活性物質(zhì)（抗生素）影響病原菌的新陳代謝過(guò)程，從而達(dá)到防病治 病的目的；二是在寄主體外利用。鏈霉菌是具有復(fù)雜生活周期的革蘭氏陽(yáng)性放線菌，系統(tǒng)生物學(xué)上歸于鏈霉菌 屬，該屬的許多成員都能產(chǎn)生對(duì)人類(lèi)具有重要意義的天然代謝物，如目前臨床上應(yīng)用的抗生素約三分之二來(lái)源于鏈霉菌（該屬產(chǎn)生的代謝物還包括抗腫瘤劑）免 疫抑制劑，抗蟲(chóng)劑以及其他胞外水解酶！如淀粉酶，幾丁質(zhì)酶，纖維素酶，果膠 酶，木聚糖酶和蛋白酶等。鏈霉菌對(duì)植物

7、病害的生防作用機(jī)制包括拮抗作用、競(jìng)爭(zhēng)作用和誘導(dǎo)植物抗性作用等方面， 其生防效果往往不是單方面的，而是以上幾 種方式作用的綜合結(jié)果，不同生防機(jī)制之間往往存在著協(xié)同作用。 由于鏈霉菌防 治植物病害時(shí)存在防治效果難以穩(wěn)定、持久等缺點(diǎn)，尋找提高鏈霉菌防治植物病 害效果的途徑顯得十分重要。提高鏈霉菌防治植物病害效果的途徑有誘變育種、 固定化技術(shù)和改良發(fā)酵工藝等，其目標(biāo)是為了提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度， 減少 副產(chǎn)物，改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品。人們經(jīng)常通過(guò)種內(nèi)融合或者 紫外誘變等方式提高鏈霉菌分泌抗生素的能力，以提高其抑菌能力。1.2病毒危害病毒（virus）由一個(gè)核酸分子（DNA或RNA與蛋白

8、質(zhì)（Protein ）構(gòu)成或僅由 蛋白質(zhì)構(gòu)成（如朊病毒）。病毒個(gè)體微小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。病毒沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由于 沒(méi)有實(shí)現(xiàn)新陳代謝所必需的基本系統(tǒng)， 所以病毒自身不能復(fù)制。但是當(dāng)它接觸到 宿主細(xì)胞時(shí)，便脫去蛋白質(zhì)外套，它的核酸（基因）侵入宿主細(xì)胞內(nèi)，借助后者 的復(fù)制系統(tǒng)，按照病毒基因的指令復(fù)制新的病毒。約75%的傳染病是由病毒引起的，其中動(dòng)物病毒是引起人類(lèi)疾病的重要病原。 病毒的結(jié)構(gòu)、酶和復(fù)制機(jī)制是 抗病毒藥物的作用靶點(diǎn)，所以抗病毒藥物在攻擊病毒的同時(shí)， 往往對(duì)宿主產(chǎn)生毒 性反應(yīng)。病毒是一類(lèi)形態(tài)最小，結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的細(xì)胞內(nèi)寄生微生物。 病毒利用宿主 細(xì)胞的酶系統(tǒng)進(jìn)行代謝活動(dòng)，其復(fù)制周期與宿主細(xì)胞的代謝密切

9、相關(guān)。植物病毒是一類(lèi)侵染被子植物、裸子植物和蕨類(lèi)植物的重要病原微生物。 植 物病毒種類(lèi)多、繁殖速率快、傳播途徑廣，并且缺少有效的防治藥劑和應(yīng)對(duì)措施， 植物病毒病一旦發(fā)生流行，就會(huì)造成嚴(yán)重的損失。植物病毒病的危害，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn) 超過(guò)真菌、細(xì)菌病害，而且近些年來(lái)由于全球一體化進(jìn)程的發(fā)展，國(guó)際商品貿(mào)易日趨發(fā)達(dá)，農(nóng)產(chǎn)品流通迅速，加快了植物病毒病在世界范圍內(nèi)的傳播。植物病毒在全世界范圍內(nèi)引起農(nóng)作物、果樹(shù)、花卉、牧草、藥用植物的病害，造成產(chǎn)量和 品質(zhì)的下降，嚴(yán)重影響到人類(lèi)的生產(chǎn)生活。煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus ， TMV是人類(lèi)最早進(jìn)行科學(xué)研究的一類(lèi)植物病毒，但因?yàn)閷?duì)其特性了解仍不夠

10、充 分，只歸類(lèi)到屬，沒(méi)有科的分類(lèi)。植物病毒病有“植物癌癥”之稱(chēng)，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上重要病害之一。由于植物病 毒屬絕對(duì)內(nèi)寄生生物，自身無(wú)能量代謝系統(tǒng)，對(duì)寄主植物細(xì)胞具有高度依賴(lài)性， 因而植物病毒病的防治一直是植物病害防治中的一大難題。為控制植物病毒病造 成的危害，人們對(duì)其防治進(jìn)行了許多有益的嘗試。煙草花葉病毒病是全世界煙草 栽培地區(qū)普遍發(fā)生的一類(lèi)病害，也是我國(guó)各煙區(qū)的重要病害。煙草花葉病流行年 份田間發(fā)病率一般在30-50 %，通常受TMV侵染的煙草植株體內(nèi)代謝會(huì)受到嚴(yán) 重影響，葉片不均勻地褪綠、枯黃，光合速率下降，這使得植株生長(zhǎng)矮小，干物 質(zhì)積累減少，一般年份減產(chǎn)20-30 %，流行年份則毀種甚至絕

11、收，不僅造成煙草 的產(chǎn)量損失，而且使煙葉的質(zhì)量嚴(yán)重下降，特別是中上等煙葉比例和內(nèi)在質(zhì)量下 降使得煙草花葉病已成為煙葉優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)栽培的重大障礙，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失， 挫傷了煙農(nóng)的生產(chǎn)積極性。由于植物病毒對(duì)寄主細(xì)胞具有絕對(duì)寄生性，以及植物缺乏與動(dòng)物類(lèi)似的免疫代謝系統(tǒng)，使得植物一旦被感染就處于終身受害的狀態(tài)， 這給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)相當(dāng)大的破壞。因此，控制煙草花葉病的危害已成為當(dāng)前煙草 生產(chǎn)中急需解決的冋題。病毒感染是許多傳染病和菲傳染病甚至癌癥的病因，由于其特殊的生存方 式，人類(lèi)在對(duì)付病毒性疾病的過(guò)程中還沒(méi)有找到有效的方法。天然產(chǎn)物是研究開(kāi) 發(fā)薪藥的重要資源，自19831994年間約60%被批準(zhǔn)應(yīng)用的抗癌

12、和抗感染藥 物來(lái)源于天然產(chǎn)物“。藍(lán)藻是地球上最早出現(xiàn)的光合自養(yǎng)生物，在長(zhǎng)期的演化 過(guò)程中形成了廣泛的適應(yīng)性。從藍(lán)藻中分離具有不同生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物， 并以此為先導(dǎo)化合物進(jìn)行新藥物開(kāi)發(fā)，已引起藥學(xué)工作者極大的關(guān)注。TMV是煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)的代表種。該屬病毒為正義單鏈 RNA(positiveSENSE sin gle-stra ndedRNA ，+ssRNA病 毒，病毒復(fù)制時(shí)正鏈基因 組RNA首先復(fù)制出負(fù)鏈 RNA(negmive senseRNA. RNA，再以負(fù)鏈RNA為模版 產(chǎn)生正鏈基因組及亞基因組RNA病毒粒子為剛直的長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)300hm直徑18nm 螺旋對(duì)稱(chēng)

13、結(jié)構(gòu)，有2130個(gè)蛋白亞基以右手螺旋排列，螺距為 2. 3nm負(fù)染色后 在電鏡下中央軸槽清晰可見(jiàn)。1.3抗病毒活性成分植物病毒是危害農(nóng)作物的一類(lèi)重要病原，因其危害大、防治困難，俗有植物 癌癥之稱(chēng)。由于植物病毒對(duì)植物細(xì)胞的絕對(duì)寄生性，病毒復(fù)制所需要的物質(zhì)、能 量場(chǎng)所等完全由寄主提供，病毒能夠脅迫寄主細(xì)胞的生化機(jī)理，使其與病毒本身 的生化機(jī)理糾纏在一起難以識(shí)別，所以藥物難以只對(duì)病毒進(jìn)行選擇性攻擊而不傷 害寄主細(xì)胞，導(dǎo)致研究高選擇性的化學(xué)抗病毒制劑面臨極大的困難，至今仍未取得重大突破。對(duì)煙草花葉病(Tobacco Mosaic Virus ，簡(jiǎn)稱(chēng)TMV的防治，國(guó)內(nèi)外 已做了大量的研究，特剃是在植物抗

14、病毒基因研究上取得了一系列進(jìn)展，但是由于遠(yuǎn)緣雜交的不親和性，使由抗性基因轉(zhuǎn)移翡難度很大。 其次，農(nóng)業(yè)栽培措施壺 于受耕作制度和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的限制， 在生產(chǎn)中有效的實(shí)施仍有一定難度， 使用 化學(xué)或生物制劑防治煙草花葉病不失為一種經(jīng)濟(jì)有效的措施?，F(xiàn)有的藥劑菌奇 演、寧南霉素、病毒A、病毒必克有一定防效(防效大多在30, . -60 %)，但藥劑 防治效果還不理想。植物病毒病是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，全世界每年因植物病毒病害所 造成的產(chǎn)量損失大約占糧食總產(chǎn)量的 10% (Fraser ,1985)。有效地控制病毒的 為害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的當(dāng)務(wù)之急。迄今為止，幾乎沒(méi)有能有效地從感染病毒的植物 上除去病

15、毒的化學(xué)藥劑。有些化學(xué)藥劑(如嘌呤、嘧啶類(lèi)似物)能減緩病毒的增殖， 但無(wú)根除之效，而且常常比病毒更易傷害作物。近年來(lái)，植物源抗病毒制劑(生物源農(nóng)藥)由于其高效、低毒、無(wú)殘留的特 點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，在植物病毒病害防治過(guò)程中發(fā)揮出越來(lái)越重要的作用。自1925年Duggur等從商陸(phytolacca)上發(fā)現(xiàn)第一個(gè)植物病毒抑制物以來(lái) 網(wǎng)，陸續(xù)開(kāi)發(fā)了 很多抗病毒制劑，像病毒A、植病靈、金葉寶等。目前研究發(fā)現(xiàn)的抗病毒活性物 質(zhì)，既有生物小分子的次生代謝產(chǎn)物，也有大分子的多糖、核酸和蛋白質(zhì)等。其 中蛋白質(zhì)類(lèi)活性物質(zhì)廣泛存在于自然界各種生物體內(nèi)，包括植物、微生物、動(dòng)物等，最受關(guān)注，同時(shí)也是研究較多的一類(lèi)活性物質(zhì)。

16、動(dòng)物病毒廣泛侵襲各類(lèi)動(dòng)物，對(duì)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物也不例外，在家禽家畜養(yǎng)殖中屢見(jiàn) 不鮮。在如今的抗動(dòng)物病毒活性成分化合物中，主要都是黃酮類(lèi)相關(guān)的化合物。 黃酮類(lèi)化合物泛指具有15個(gè)碳原子(C6-C3 C6)的多元酚化合物，廣泛存在于 自然界中。按結(jié)構(gòu)可分為黃酮和黃酮醇類(lèi)、雙黃酮類(lèi)、二氫黃酮及二氫黃酮醇類(lèi)、 查耳酮類(lèi)、異黃酮類(lèi)以及其它黃酮類(lèi)等。許多中草藥的抗病毒活性成分都是黃酮 類(lèi)化合物，如從甘草中分離出的黃酮類(lèi)成分甘草素與異甘草素有很強(qiáng)的抑制艾滋 病病毒(HIV)能力，甘草香豆素屬于異黃酮類(lèi)的衍生物，甘草吡喃香豆素等多種 甘草黃酮類(lèi)成分可抑制H1V誘導(dǎo)的巨細(xì)胞形成，且未見(jiàn)細(xì)胞毒性。自從 1993年 首次從短

17、葉紅豆杉的韌皮部分分離到一株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌后，研究者就開(kāi)始不斷地從內(nèi)生菌中分離出各種活性代謝產(chǎn)物 ？，這其中就包括抗病毒活性代謝產(chǎn) 物。目前臨床上常用的藥物主要有如下幾種：抗流感病毒及呼吸道病毒藥物：抗 皰疹病毒藥物：抗巨細(xì)胞病毒藥物；抗肝炎病毒藥物：抗人類(lèi)免疫缺陷病毒藥物。 抗病毒藥物的治療已有近30年的歷史，由于病毒進(jìn)入機(jī)體后，模仿宿主的生化 機(jī)理在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和繁殖，因此，能抑制病毒繁殖的藥物對(duì)宿主細(xì)胞或 機(jī)體有不同程度的損害，使得抗病毒藥的發(fā)展與抗生素相比較為緩慢。到目前為止，尚無(wú)令人完全滿意的抗病毒藥。1.4目的意義在農(nóng)藥的投入上，生物農(nóng)藥的比重越來(lái)越小，工業(yè)化生產(chǎn)出的化學(xué)

18、農(nóng)藥卻逐 年增加。但是化學(xué)農(nóng)藥的大量使用和長(zhǎng)期延續(xù)， 已給人類(lèi)帶來(lái)了不利的影響，它 不僅嚴(yán)重破壞了人們賴(lài)以生存的自然環(huán)境， 影響了正常的生態(tài)循環(huán)，還危及到人 類(lèi)的健康。如土壤的嚴(yán)重板結(jié)和酸化，既造成農(nóng)藥浪費(fèi)，又破壞土壤結(jié)構(gòu)，降低 農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)；還會(huì)污染水源，造成江河湖泊水華現(xiàn)象和海洋赤潮； 而水的 負(fù)營(yíng)養(yǎng)化，對(duì)水生動(dòng)植物的生存造成極大的威脅： 地下水與地表水的污染，使農(nóng) 作物的品質(zhì)下降，嚴(yán)重影響到人類(lèi)的生存與健康。盡量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用成為 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中人們所十分關(guān)心的問(wèn)題。 因此如何研究出高效，高質(zhì)，高優(yōu)的化 學(xué)產(chǎn)品，減少化學(xué)藥品的使用量，采用生物農(nóng)藥，生物防治至關(guān)重要。從而在未 來(lái)的

19、抗病毒，抗真菌，細(xì)菌的舞臺(tái)上，更多的需要依靠生物菌來(lái)防治病害，病毒等，這其中最主要的就是放線菌。放線菌在自然界的分布極為廣泛，存在于各種不同的自然生態(tài)環(huán)境里，其 種類(lèi)繁多，代謝功能各異，是一類(lèi)有著廣泛實(shí)際用途的生物資源。放線菌所產(chǎn)生 的抗生素能有效地防治人類(lèi)和牲畜的多種傳染性疾病。目前人們?cè)谏矬w內(nèi)發(fā)現(xiàn) 的6 000多種抗生素中,約60%來(lái)自放線菌,其中包括許多在醫(yī)藥上有重要作用 的抗生素，因而成為近代抗生素等制藥工業(yè)的最重要的微生物資源之一。微生物 發(fā)酵的生產(chǎn)水平最基本的是取決于生產(chǎn)菌種的性能，但有了優(yōu)良的菌種之后， 還需要有最佳的環(huán)境條件即發(fā)酵工藝加以配合，才能使其生產(chǎn)能力充分表現(xiàn)出 來(lái)。

20、因此必須研究生產(chǎn)菌種的最佳發(fā)酵工藝條件，如營(yíng)養(yǎng)要求、培養(yǎng)溫度、pH 條件、對(duì)氧的需求等，據(jù)此設(shè)計(jì)出合理的發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于最佳的產(chǎn)物 合成條件，進(jìn)而取得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的效果。本實(shí)驗(yàn)采用抗病毒生防菌F-01菌株，以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，作為菌株 碳氮源及實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件的篩選準(zhǔn)則， 采取單因素變化，采用梯度實(shí)驗(yàn)初步確定最 優(yōu)原料比例和條件。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，分別用各種單糖代替 2%勺淀粉選出較優(yōu)碳源， 同理用氮源代替0.1%硝酸鉀選出較優(yōu)碳源，然后用較優(yōu)碳源和氮源進(jìn)行正交實(shí) 驗(yàn)，得到最優(yōu)碳源，氮源。利用最優(yōu)碳源，氮源對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。最終 得出最適合F-01生長(zhǎng)的發(fā)酵條件。第一章材料和方法2.1實(shí)驗(yàn)

21、菌株F-02菌株；F-07菌株；F-12菌株；F-ZH菌株。（實(shí)驗(yàn)室保存菌株）2.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑2.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器精密電子天平，立式電熱壓力蒸汽滅菌器，數(shù)顯酸度計(jì)，凈化工作臺(tái)，移液 槍?zhuān)F形瓶，研缽，恒溫培養(yǎng)箱，搖床，量筒，冰箱2.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑淀粉，果糖，麥芽糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖，玉米粉，小米粉，大米粉，黃 豆粉，蛋白胨，大豆蛋白胨，酪蛋白胨，硝酸鉀，硫酸銨，K2HPO，MgSO4 7H2O NaCI; FeS（4 7H2O;氯化鉀，TMV病毒液。O Q嚴(yán)并甘2.3培養(yǎng)基放線菌培 養(yǎng)基 （高氏1號(hào)培 養(yǎng)基）:淀粉(2g)KNO3(0.1g)K2HPO4 (0.05g)MgSO4.

22、7H2O (0.05g)NaCl (0.05g)FeSO4.7H2O (0.001g) 水 100mL2.4實(shí)驗(yàn)方法2.4.1 菌株培養(yǎng)方法：以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為菌株提供生長(zhǎng)環(huán)境，采用統(tǒng)一規(guī)格的錐形瓶(250mL，由于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中才用碳源十種(淀粉，果糖，麥芽糖， 甘露糖，半乳糖，葡萄糖，玉米粉，小米粉，大米粉，黃豆粉)，氮源五種(蛋 白胨，大豆蛋白胨，酪蛋白胨，硝酸鉀，硫酸銨)，在做碳源篩選的時(shí)候，分別 用所選碳源代替高氏一號(hào)中的碳源淀粉；同理，在做氮源的時(shí)候，用所選氮源代替高氏一號(hào)培養(yǎng)基中的氮源硝酸鉀。用精準(zhǔn)天平分別稱(chēng)取高氏一號(hào)培養(yǎng)基中所需 試劑分量，稱(chēng)取完畢后，分別加入100ml的蒸餾水，并

23、將其密封，將培養(yǎng)基放入 滅菌框中在立體式電熱壓力蒸汽滅菌器中滅菌 30分鐘(120C)，滅菌完成后， 取出滅菌后的培養(yǎng)基，冷卻至室溫，在超凈工作臺(tái)里將菌株接種培養(yǎng)基中并密封， 將接種的培養(yǎng)基放在搖床(28C，180rpm)環(huán)境下培養(yǎng)7天，7天后取出培養(yǎng)基， 在超凈工作臺(tái)中，用移液槍從培養(yǎng)基中取菌液于2ml離心管中，菌液培養(yǎng)完成。2.4.2 TMV 病毒液制作：取癥狀明顯感染 TMV病毒的煙草葉片，并稱(chēng)取其質(zhì)量，將病毒葉放入研缽中，加入少量的石英砂和PBS( Phosphate Buffered Sal ine)進(jìn)行研磨，研磨大概30分鐘，按照1g病毒葉配100mLpbs配置病毒液，完成 后再加

24、入適量的石英砂(有利于在接種的時(shí)候損傷葉片，從而更好的使煙草葉片 感染TMV，完成后將病毒液放入冰箱保存。 PBS( Phosphate Buffered Saline)PBS 1L配方 pH7.4:磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.24g,磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1.44g, 氯化鈉(NaCI)8.0g，氯化鉀(KCI)0.2g，加水至1000mL2.4.3 ELISA:酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(Enzyme-Linked ImmunosorbnentAssay ): ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽 9體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底 物的高效催化作用相結(jié)合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于

25、抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體一一聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育 后，可通過(guò)洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。 在實(shí)際應(yīng)用中，通過(guò)不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測(cè)抗體 的間接法、用于檢測(cè)抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測(cè)小分子抗原或半抗原的抗原競(jìng)爭(zhēng)法等等。比較常用的是 ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法：1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110卩g/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加 0.1ml , 4C過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（

26、簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同）。2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37C 孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔）。3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體 （經(jīng)滴定后的稀 釋度）0.1ml。37C孵育0.51小時(shí)，洗滌。4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml ,37C1030分鐘。5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入 2M硫酸0.05ml。6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“ - ”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在E

27、LISA檢測(cè)儀上，于450nm若以ABTS顯色，則410nm） 處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔 O- D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照 OD值的2.1 倍，即為陽(yáng)性。2.4.4 半葉枯斑法：挑選健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的心葉煙，將事先提取的TMV病毒液 混勻，并取出適量病毒液，采用摩擦接種的方法，將TMV病毒液接種到心葉煙的 葉片上，由于接種損傷葉片，因此接種后葉片會(huì)有短暫的萎焉現(xiàn)象，將其放置 3-4小時(shí)，即待葉片基本恢復(fù)正常狀態(tài)，用毛筆將菌液均勻的涂在接種TMV病毒葉片的左半部分，每種菌液設(shè)置重復(fù) 2-3次，菌液涂抹完成，做好標(biāo)簽，涂上菌 液后4-5天統(tǒng)計(jì)結(jié)果，分別統(tǒng)計(jì)葉片左右的病斑數(shù)，并算出抑制率，可得出菌

28、液 的效果，通過(guò)活性得較優(yōu)碳源，氮源組分。抑制率=（對(duì)照枯斑數(shù)一處理枯斑數(shù)）/對(duì)照枯斑數(shù)X 100%第二章培養(yǎng)基優(yōu)化3.1菌株優(yōu)化3.1.1菌株培養(yǎng)基：以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，所選碳源麥芽糖，甘露糖， 半乳糖，葡萄糖，果糖代替原培養(yǎng)基中的 2%粉，制作培養(yǎng)基，通過(guò)高溫滅菌， 冷卻至常溫，并接種F-02菌株；F-07菌株；F-12菌株；F-ZH菌株四種菌株在 搖床（28C, 180rpm）中培養(yǎng)七天。3.1.2活性測(cè)定：取出各個(gè)培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康, 長(zhǎng)勢(shì)基本一樣的心葉煙做活性測(cè)定。3.1.3結(jié)果及分析單糖重復(fù)2#菌株平均抑制率%重復(fù)1重復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%麥芽糖2

29、8372424302022甘露糖12214315264242半乳糖14315510256057葡萄糖29361916140612果糖8195812275657單糖 重復(fù)7#菌株平均抑制率%重復(fù)1重復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%麥芽糖781385013甘露糖67149143625半乳糖41573792247葡萄糖2231298195843果糖59446166353單糖 重復(fù)12#菌株平均抑制率%重復(fù)1重復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%麥芽糖6933109033甘露糖8102386241半乳糖4850245050葡萄糖760354040果糖9174712130828單糖 重復(fù)ZH菌株平均抑制率%重復(fù)1重

30、復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%麥芽糖18201013161915甘露糖19273014171824半乳糖2128257196344葡萄糖2728313224122果糖121383132035通過(guò)五種不同的碳源培養(yǎng)基對(duì)4種菌株抗病毒活性測(cè)定的結(jié)果可以看出，F(xiàn)-02 , F-07兩種菌株的效果較好。3.2碳源優(yōu)化3.2.1菌株培養(yǎng)基：以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，所選碳源麥芽糖，甘露糖， 果糖。葡萄糖，半乳糖，淀粉，黃豆粉，大米粉，小米粉，玉米粉。代替原培養(yǎng) 基中的2%粉，制作培養(yǎng)基，通過(guò)高溫滅菌，冷卻至常溫，并接種F-02菌株；F-07菌株2種菌株在搖床(28C, 180rpm)中培養(yǎng)七天。3.1.2活

31、性測(cè)定：取出各個(gè)培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康, 長(zhǎng)勢(shì)基本一樣的心葉煙做活性測(cè)定。3.1.3結(jié)果及分析單糖重復(fù)2#菌株平均抑制率%重復(fù)1重復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%淀粉5617525329.5玉米粉256020241738.5小米粉51155693344大米粉55013182828黃豆粉23261217191111.5麥芽糖28372424302022甘露糖12214315264242半乳糖14315510256057葡萄糖29361916140612果糖8195812275657單糖重復(fù)7#菌株平均抑制率%重復(fù)1重復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%淀粉891111337543玉米粉9

32、143626373033小米粉172119354030大米粉682527423630.5黃豆粉10174115202533麥芽糖781385013甘露糖67149143625半乳糖41573792247葡萄糖2231298195843果糖59446166353通過(guò)對(duì)十種碳源的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析可得較優(yōu)碳源四種：果糖，淀粉，小米粉，玉米粉。3.3氮源優(yōu)化3.3.1菌株培養(yǎng)基：以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，所選氮源：硝酸鉀，硫酸 銨，大豆蛋白胨，蛋白胨，酪蛋白胨。代替原培養(yǎng)基中的0.1%硝酸鉀，制作培養(yǎng)基，通過(guò)高溫滅菌，冷卻至常溫，并接種 F-02菌株；F-07菌株2種菌株在搖 床(28C, 180rpm

33、)中培養(yǎng)七天。3.3.2活性測(cè)定：取出各個(gè)培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康, 長(zhǎng)勢(shì)基本一樣的心葉煙做活性測(cè)定。3.3.3結(jié)果及分析氮源 重復(fù)2#菌株平均抑制率%重復(fù)1重復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%硝酸鉀2431232219023硫酸銨252774307蛋白胨37603844038大豆蛋白胨6145715212943酪蛋白胨15335514244248.5氮源 重復(fù)7#菌株平均抑制率%重復(fù)1重復(fù)2左右抑制率%左右抑制率%硝酸鉀1118399154039.5硫酸銨9246315274453.5蛋白胨20215171605大豆蛋白胨46334147152酪蛋白胨13265013325954

34、.5通過(guò)對(duì)五種氮源的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)分析可得較優(yōu)碳源三種：硝酸鉀，大豆蛋白胨，酪蛋白胨。3.4碳氮源組合優(yōu)化3.4.1 菌株培養(yǎng)基：以高氏一號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)。所選碳源：果糖，淀粉，小米粉，玉米粉；所選氮源：硝酸鉀，大豆蛋白胨，酪蛋白胨。兩兩組合制作培養(yǎng)基，通 過(guò)高溫滅菌，冷卻至常溫，并接種F-02菌株；F-07菌株2種菌株在搖床(28C, 180rpm)中培養(yǎng)七天。碳氮源組合表碳源果糖淀粉小米粉玉米粉氮源硝酸鉀果糖/硝酸鉀淀粉/硝酸鉀小米粉/硝酸鉀玉米粉/硝酸鉀大豆蛋白胨果糖/大豆蛋白胨淀粉/大豆蛋白胨小米粉/大豆蛋白胨玉米粉/大豆蛋白胨酪蛋白胨果糖/酪蛋白胨淀粉/酪蛋白胨小米粉/酪蛋白胨玉米粉/酪

35、蛋白胨342活性測(cè)定：取出各個(gè)培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康, 長(zhǎng)勢(shì)基本一樣的心葉煙做活性測(cè)定。3.4.3 結(jié)果及分析正交 重復(fù)2#菌株平均 抑制率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制率%左右抑制率%左右抑制 率%淀/鉀1726352230278133833淀/豆212722594414233935淀/酪11204530392327352331果/鉀25291421333614233930果/豆9154014192616253634果/酪27352317263527433732玉/鉀12141419273033412021玉/豆9195316304719262742玉/酪232818141

36、92629382423小/鉀32473217334818365043小/豆693318304029453636小/酪11245423424517375451正交 重復(fù)7#菌株平均 抑制 率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制 率%左右抑制率%左右抑制 率%淀/鉀7113615192117242929淀/豆11204521323439淀/酪131724594420272631果/鉀232921583721251625果/豆17201513161920272620果/酪1217298154727342132玉/鉀1422368133829372232玉/豆13193221282514274835玉/酪19

37、27309174712234842小/鉀12204091540594441小/豆2528111623309133024小/酪8266910184456.5碳源（淀-淀粉；果果糖；玉-玉米粉；小-小米粉）氮源（鉀-硝酸鉀；豆-大豆蛋白胨;酪-酪蛋白胨）通過(guò)對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)的分析，可得出當(dāng)碳源為小米粉，氮源為酪蛋白胨的組合時(shí)，其對(duì)煙草TMV病毒的活性最好，因此，得出最優(yōu)組合為碳源為小米粉，氮源為酪蛋白胨4.培養(yǎng)基條件優(yōu)化4.1溫度的優(yōu)化：4.1.1 菌株培養(yǎng)基：利用最優(yōu)碳氮源（碳源一小米粉；氮源一酪蛋白胨）組合制作 培養(yǎng)基，121C高溫高壓滅菌 30分鐘，冷卻至室溫后，分別接種 F-01 （2#

38、, 7#,） 2種菌種, 然后 26C, 28C, 30C, 32C、180rpm 搖床培養(yǎng) 7 天。4.1.2活性測(cè)定：取出各個(gè)培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康, 長(zhǎng)勢(shì)基本一樣的心葉煙做活性測(cè)定。4.1.3結(jié)果及分析溫度重復(fù)2#菌株平均 抑制 率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制率%左右抑制率%左右抑制 率%26 C3948192329211824252228 C304533213946618674930 C1124541825283245293732 C2942311724299133130溫度 重復(fù)7#菌株平均 抑制 率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制 率%左右抑制率%左右抑制 率%26

39、 C2232314152213039232528 C1221431932411728394130 C816503348312439384032 C18304022312925383434在對(duì)培養(yǎng)條件溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)所得菌液對(duì)煙草TMV病毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在溫度為28C時(shí)，抗煙草 TMV病毒活性最高4.2 pH的優(yōu)化：4.2.1 菌株培養(yǎng)基：利用最優(yōu)碳氮源（碳源一小米粉；氮源一酪蛋白胨）組合制作培養(yǎng)基，分別用 ph計(jì)將培養(yǎng)基的ph調(diào)至ph6，ph7, ph8，ph9四個(gè)不同的pH值，121C高 溫高壓滅菌30分鐘，冷卻至室溫后，分別接種F-01 （2# ,7# ,）2種菌種，然后28C

40、、180rpm 搖床培養(yǎng)7天。4.2.2活性測(cè)定：取出各個(gè)培養(yǎng)基中的對(duì)應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康， 長(zhǎng)勢(shì)基本一樣的心葉煙做活性測(cè)定。4.2.3結(jié)果及分析ph 重復(fù)2#菌株平均 抑制 率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制 率%左右抑制率%左右抑制 率%6.0222719344117192524207.0153253213743244951498.0263933102864163858529.033412025281114192619ph重復(fù)7#菌株平均 抑制 率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制率%左右抑制率%左右抑制 率%6.0121729243123212825267.031493729504218

41、3040408.0283936203238132752429.07113641481535442024在對(duì)培養(yǎng)條件pH優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)所得菌液對(duì)煙草TMV病毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在pH為8.0時(shí)，抗煙草TMV病毒活性最高。4.3培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化：4.3.1 菌株培養(yǎng)基：利用最優(yōu)碳氮源（碳源一小米粉；氮源一酪蛋白胨）組合制作培養(yǎng)基，用ph計(jì)將培養(yǎng)基的ph調(diào)至pH為8.0, 121 C高溫高壓滅菌 30分鐘，冷卻至室溫 后，分別接種F-01 （2#，7#，） 2種菌種，然后28C、180rpm搖床培養(yǎng)，分別在第 4天, 第5天，第6天，第7天同一時(shí)間段采集菌液。4.3.2活性測(cè)定：取出各個(gè)培養(yǎng)基中

42、的對(duì)應(yīng)菌液，以半葉枯斑法，采用健康, 長(zhǎng)勢(shì)基本一樣的心葉煙做活性測(cè)定。4.3.3結(jié)果及分析重復(fù) 時(shí)間2#菌株平均 抑制率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制率%左右抑制率%左右抑制率%4d314835253119112861385d153050305343324935436d233839283520193241337d33432326383219293430重復(fù) 時(shí)間7#菌株平均 抑制率%重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3左右抑制率%左右抑制率%左右抑制率%4d284639354929365737355d254544132854345336456d365939274945193241427d1221433346283

43、4574037在對(duì)培養(yǎng)基條件優(yōu)化培養(yǎng)時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)所得菌液對(duì)煙草 TMV病毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在溫度為28 C, ph值為8.0時(shí)，120h左右抑菌物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)最高峰。5結(jié)論與展望5.1結(jié)論不同的菌種能夠利用的碳源和氮源往往不同，同一個(gè)菌種對(duì)不同碳源和氮源的利用速度也不同，碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能源，組成菌體細(xì)胞成分的碳架，構(gòu)成代謝產(chǎn)物，氮源物質(zhì) 也是構(gòu)成菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物質(zhì) ，在碳源不足的情況下也可為微生物提供能源。各種微生物在生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物中，除了需要碳源和氮源物質(zhì)，還需要磷、鎂、硫、鐵、鉀、鈉等 無(wú)機(jī)鹽和微量元素作為酶的激活劑、生理活性物質(zhì)的組成或生理活性作用的調(diào)節(jié)劑。這些物質(zhì)一般

44、在較低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成有促進(jìn)作用，而在高濃度時(shí)常表現(xiàn)出顯著的抑制作用。通過(guò)對(duì)放線菌F-01菌株培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的研究 ，得出F-01菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基 的組分為淀粉(2g)、酪蛋白胨(0.1g)、K2HPO4 (0.05g)、MgSO4.7H2O (0.05g) 、NaCI (0.05g)、FeSO4.7H2O (0.001g)、水 100mL=發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始 pH 為8.0, 28 C培養(yǎng),120 h左右抑菌物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)最高峰。小米粉是一種成本廉價(jià)的物質(zhì)，含有豐富的還原糖、氨基酸、磷、微量元素、生長(zhǎng)素及有機(jī)酸,它作為F-01菌株的能源物質(zhì)，達(dá)到了降低成本提高效價(jià)的目的 ，為

45、進(jìn)一步放大試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。5.2論文工作的不足521實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在F-01菌系中從四種菌株篩選出F-02菌株、F-07菌株，通 過(guò)五種不同的碳源篩選結(jié)果可能存在偏差。同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行F-02菌株、F-07菌株兩種菌株的培養(yǎng)基碳氮源和培養(yǎng)條件的篩選，雖然兩種菌株的性質(zhì)， 功能相似，但也存在細(xì)小的差異，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)存在許多的誤差和結(jié)果偏 差。5.2.2由于本身能力因素，對(duì)于正交實(shí)驗(yàn)理解不夠，因此只能進(jìn)行碳氮源的簡(jiǎn)單 組合實(shí)驗(yàn)，這樣對(duì)于實(shí)驗(yàn)工作量大大的提高，同時(shí)也遠(yuǎn)遠(yuǎn)的降低了實(shí)驗(yàn)的精確度。523在培養(yǎng)基條件的篩選中，溫度，pH,培養(yǎng)時(shí)間的梯度較大。在培養(yǎng)條件 pH 篩選中，選取pH6.0、7.0、8.0、9.0。在