PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用[特制材料]

1、PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用技術(shù)的原理及應(yīng)用 1專業(yè)課 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 解旋酶解鏈酶 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 2專業(yè)課 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 引物酶 引物酶 RNA引物

2、 RNA引物 3專業(yè)課 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 53 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 35 DNA 解旋解鏈 合成引物 子鏈延長 GGAUCG 5 AUCGCG 5 TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3 ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3 DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 4專業(yè)課 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性， 與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引 物，并不斷重

3、復(fù)該過程便可克隆tRNA 基因。 但由于測序和引物合成的困難，以及 70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基 因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被 人們遺忘了 5專業(yè)課 PCR技術(shù)簡史 DNA的復(fù)制 核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想 聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明 1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚 合酶鏈反應(yīng)（PCR） 基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制 最初采用E-coli DNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐 熱，使這一過程耗時，費(fèi)力，且易出錯 耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨 后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀 1993年，Mullis等因此

4、項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎 6專業(yè)課 7專業(yè)課 8專業(yè)課 9專業(yè)課 引物引物 10專業(yè)課 引物引物 引物引物 11專業(yè)課 XX 12專業(yè)課 13專業(yè)課 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 14專業(yè)課 15專業(yè)課 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 4種dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0. .12ug Taq DNA聚合酶 2. .5u Mg2+ 1. .5mmol/L 16專業(yè)課 12345 22 55 72 94 時間（min） 溫度 （）

5、PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù)13步 2530輪 目的DNA片段 擴(kuò)增100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 DNA變性 形成2條單鏈 子鏈延伸 DNA加倍 17專業(yè)課 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 12345 22 55 72 94 時間（min） 溫度 （） 適溫延伸 3 高溫變性 1 低溫退火 2 重復(fù)13步 2530輪 目的DNA片段 擴(kuò)增100萬倍以上 DNA雙螺旋 DNA單鏈 與引物復(fù)性 子鏈延伸 DNA加倍 DNA變性 形成2條單鏈 模板DNA 95 18專業(yè)課

6、 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 9550 引物1 引物2 DNA引物 19專業(yè)課 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 50 引物1 引物2 DNA引物 72 Taq酶 Taq酶 20專業(yè)課 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 72 第1輪結(jié)束 95 第2輪開始 21專業(yè)課 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 955072 Taq Taq Taq Taq 22專業(yè)課 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點(diǎn) 72 第2輪結(jié)束 23專業(yè)課 PCR的基本原理 PCR反應(yīng)條件 PCR

7、過程 PCR的特點(diǎn) 模板DNA 第1輪擴(kuò)增 第2輪擴(kuò)增 第3輪擴(kuò)增 第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增 24專業(yè)課 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR原理原理 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR在醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和科研中的應(yīng)用 提提 綱綱 25專業(yè)課 在在PCRPCR反應(yīng)體系中加入反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)熒光基團(tuán)，利用熒光，利用熒光 信號累積信號累積實(shí)時監(jiān)測實(shí)時監(jiān)測整個整個PCRPCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)進(jìn)程，最后通過標(biāo) 準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光

8、定量PCR定義定義 26專業(yè)課 常常 規(guī)規(guī) PCRPCR技術(shù)：技術(shù)： 對對PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。進(jìn)行定量和定性分析。 無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時檢無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無法對擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時檢 測。測。 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 27專業(yè)課 實(shí)時定量實(shí)時定量PCR技術(shù)：技術(shù)： 利用利用熒光信號的變化實(shí)時檢測熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中 每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過，通過Ct值值和標(biāo)準(zhǔn)曲和標(biāo)準(zhǔn)曲 線的分析對線的分析對起始模板起始模板進(jìn)行進(jìn)行定量分析。定量分析。 2

9、8專業(yè)課 如何對起始模板定量？如何對起始模板定量？ 通過通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對起始模板起始模板進(jìn)行定量分析進(jìn)行定量分析 三個概念：三個概念： 擴(kuò)增曲線、熒光閾值、擴(kuò)增曲線、熒光閾值、CtCt值值 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 29專業(yè)課 30專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線 擴(kuò)增曲線圖：擴(kuò)增曲線圖： 橫坐標(biāo)：橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（CycleCycle）；）；縱坐標(biāo)：縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)熒光強(qiáng) 度度 每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號的收集 熒光基團(tuán)熒光基團(tuán) 熒光檢測元件熒光檢測元件 31

10、專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 -熒光閾值熒光閾值 熒光信號閾值熒光信號閾值 （threshold threshold ）： q 前15個循環(huán)信號作為熒光本底信號 （baseline），即樣本的熒光背景值和 陰性對照的熒光值 q 熒光域值的缺省設(shè)置是315個循 環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍 q 手動 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光 背景值和陰性對照的熒光最高值，同 時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段， 并且保證回歸系數(shù)大于0.99 q 真正的信號:熒光信號超過域值 32專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值 CtCt值的定義值的定義： PCR擴(kuò)增

11、過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定 的閾值時所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。 C(t) value 33專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的重現(xiàn)性 橫軸：橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù) 縱軸：熒光信號量縱軸：熒光信號量 CtCt值的特點(diǎn)值的特點(diǎn)： 相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不 恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性 34專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理 理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n 非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率 35

12、專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 定量原理定量原理 在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個常數(shù),我們設(shè)為M 方程式(1)兩邊同時取對數(shù)得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: lg X0= - Ct lg(1+Ex) + lg M (3) Lg Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域域 值的循環(huán)數(shù)即值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。就可計(jì)算出樣品中所含的模板量

13、。 36專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 - - 標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 q 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越 小。 q Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo) 準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中 所含的模板量。 37專業(yè)課 Sample 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR原理原理 絕對定量絕對定量 25 38專業(yè)課 提提 綱綱 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR原理原理 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 q

14、 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR原理原理 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 39專業(yè)課 非特異性熒光標(biāo)記：非特異性熒光標(biāo)記： 1、 SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記：特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 原理原理 - DNA - DNA 產(chǎn)物的熒光標(biāo)記產(chǎn)物的熒光標(biāo)記 QQ R 40專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 方法方法 1 1 SYBR Green 法 41專

15、業(yè)課 SYBR Green 法 q SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位 q SYBR Green 只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 q 變性時，DNA雙鏈分開，無熒光 q 復(fù)性和延伸時，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒 光，在此階段采集熒光信號（一般設(shè)置在復(fù)性階段）。 SYBR Green 42專業(yè)課 53 53 SG No Emission SG SG SG ExcitationExcitation SG SG SGSGSG SGSG 53 53 Emission ExcitationExcitation 43專業(yè)課 溫度溫度 熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度 Tm 44專業(yè)課 -

16、dI dT Tm 45專業(yè)課 SYBR Green SYBR Green 法法 融解曲線分析融解曲線分析 融解曲線分析，單一峰 無非特異性熒光 定量準(zhǔn)確 融解曲線分析，有雜峰 其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性 熒光，因此定量不準(zhǔn)確 非特異性產(chǎn)非特異性產(chǎn) 物物 46專業(yè)課 Cycle number Flourescenc 104 102 Sample Cycle number Lg of DNA concentration SYBR Green 法 定量原理 q 模板DNA量越多，熒光達(dá) 到域值的循環(huán)數(shù)越少。 q Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān) 系，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì) 算出樣品中所含的模板量。 47專業(yè)課

17、SYBR Green 法 -PCR反應(yīng)的建立 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化: : 1. 1.SYBR Green SYBR Green 使用濃度使用濃度: :太高抑制太高抑制TaqTaq酶活性，太低，熒酶活性，太低，熒 光信號太弱，不易檢測光信號太弱，不易檢測 2.2. PrimerPrimer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn)：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn) 3.3. MgClMgCl2 2的濃度的濃度: :可以降低到可以降低到1.5mM,1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物以減少非特異性產(chǎn)物 4.4. 反應(yīng)反應(yīng)Buffer Buffer 體系的優(yōu)化體系的優(yōu)化 5.5

18、. 反應(yīng)溫度和時間參數(shù)反應(yīng)溫度和時間參數(shù): :由酶和引物決定由酶和引物決定 6.6. 其他與常規(guī)其他與常規(guī)PCRPCR相同相同 48專業(yè)課 SYBR Green SYBR Green 法法 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 q 起始模板的測定 q 基因型的分析 q 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對 常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對primer的評價；可以 區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn) 物。 49專業(yè)課 SYBR Green SYBR Green 法法 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) q 對DNA模板沒有選擇性 -適用于任何DNA q 使用方便 -不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 q 非常靈敏 q 便宜 優(yōu) 點(diǎn) q 容易與非特

19、異性雙鏈DNA 結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過融解曲線的分 析，優(yōu)化反應(yīng)條件 q 對引物特異性要求較高 缺 點(diǎn) 50專業(yè)課 本單位目前開展的工作 多種病原體定量和定性多種病原體定量和定性 細(xì)胞因子檢測（人，小鼠，大鼠等）細(xì)胞因子檢測（人，小鼠，大鼠等） 基因表達(dá)水平檢測基因表達(dá)水平檢測 PCR芯片芯片 51專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 方法方法2 2 -TaqMan -TaqMan法法 52專業(yè)課 與目標(biāo)序列互補(bǔ) TaqMan-TaqMan-水解型雜交探針?biāo)庑碗s交探針 v 55端標(biāo)記有報告基團(tuán)端標(biāo)記有報告基團(tuán)(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FA

20、MFAM、VICVIC等等 v 33端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)(Quencher, Q) v 探針完整，探針完整，R R所發(fā)射的熒光能量被所發(fā)射的熒光能量被QQ基團(tuán)吸收基團(tuán)吸收 ，無熒光，無熒光， R R與與QQ分開，發(fā)熒光分開，發(fā)熒光 （熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，（熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，F(xiàn)RETFRET） v TaqTaq酶有酶有 5353外切核酸酶活性，可水解探針外切核酸酶活性，可水解探針 53專業(yè)課 TaqManTaqMan法法 工作原理工作原理 每擴(kuò)增一條 DNA分子，釋 放一個熒光信號， 可以在循環(huán)過程 中任一點(diǎn)檢測熒 光 54專業(yè)課 TaqMa

21、n TaqMan 法法 PCRPCR反應(yīng)的建立反應(yīng)的建立 1 1、引物、探針的設(shè)計(jì)：、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針探針TmTm為為68-70 68-70 ，30 bp, 530 bp, 5不能有不能有G G，G G可能會淬滅熒光素，可能會淬滅熒光素， 引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段400 bp400 bp，引物，引物TmTm為為59-60 59-60 2 2、反應(yīng)參數(shù)的確定：、反應(yīng)參數(shù)的確定： 一般為：一般為：94 94 ，10-20S10-20S 60 60，30-60S30-60S（TaqTaq酶酶5353外切核酸酶活性在外切核酸酶活性在60 60 最高）最高） 也可通過

22、溫度梯度優(yōu)化退火溫度也可通過溫度梯度優(yōu)化退火溫度 72 72 ，45 S45 S， 3 3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小CtCt值，最大信號值，最大信號/ /背景比值背景比值 引物濃度：引物濃度：50-900nM50-900nM 探針濃度：探針濃度：50-250nM50-250nM 4 4、其他與常規(guī)、其他與常規(guī)PCRPCR相同相同 55專業(yè)課 已肝病人血液中已肝病人血液中HBVHBV的絕對定量的絕對定量 q目的：利用核酸檢測，縮短檢驗(yàn)時間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù)目的：利用核酸檢測，縮短檢驗(yàn)時間，提高靈敏度，為診斷用藥提供依據(jù) q方法：從血液中提取病毒方法

23、：從血液中提取病毒DNADNA，擴(kuò)增病毒基因，以，擴(kuò)增病毒基因，以TaqManTaqMan探針進(jìn)行檢測探針進(jìn)行檢測 q設(shè)置對照：濃度為設(shè)置對照：濃度為10106 6、10105 5 、10104 4 、10103 3 的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個，設(shè)陰性和空白的標(biāo)準(zhǔn)樣品各一個，設(shè)陰性和空白 對照對照 q實(shí)驗(yàn)步驟：提取實(shí)驗(yàn)步驟：提取HBV DNAHBV DNA 設(shè)計(jì)特異引物設(shè)計(jì)特異引物 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)TaqManTaqMan探針并標(biāo)記探針探針并標(biāo)記探針 擴(kuò)增程序擴(kuò)增程序 q結(jié)果：獲取血液樣品中結(jié)果：獲取血液樣品中HBV DNAHBV DNA的精確的精確copycopy數(shù)數(shù) 利用利用TaqManTaqMan法法 檢

24、測血液中的檢測血液中的HBVHBV 56專業(yè)課 數(shù)據(jù)分析 分析結(jié)果： HBV DNA的精確copy數(shù)為 3.7X105 利用利用TaqManTaqMan法法 檢測血液中的檢測血液中的HBVHBV sample sample 57專業(yè)課 TaqManTaqMan法法 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 q 起始模板的定量 q 基因型分析 q 產(chǎn)物鑒定 q 單核苷酸多態(tài)性分析 (single nucleotide polymorphism ， SNP) 58專業(yè)課 TaqManTaqMan法法 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) q 對目標(biāo)序列的高特異性 -陰性結(jié)果確定 q 設(shè)計(jì)相對簡單 -與目標(biāo)序列某一區(qū) 域互補(bǔ) q重復(fù)性比較好 優(yōu)

25、點(diǎn) q 只適合一個特定的目標(biāo) q 委托公司標(biāo)記，價格較高 q 不易找到本底低的探針 缺 點(diǎn) 59專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR PCR 方法方法 3 3 - Molecular beacon - Molecular beacon 法法( (分子信標(biāo)分子信標(biāo)) ) 60專業(yè)課 標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針 環(huán)與目標(biāo)序列互補(bǔ) 莖由互補(bǔ)配對序列組成 環(huán) 莖 熒光素 淬滅劑 發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針 61專業(yè)課 Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標(biāo)分子信標(biāo)) ) 工作原理工作原理 q 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRETFRET） q 探針與探針與

26、DNADNA雜交時產(chǎn)生熒光雜交時產(chǎn)生熒光 -延伸過程：不產(chǎn)生熒光延伸過程：不產(chǎn)生熒光 -退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光退火過程：產(chǎn)生特異性熒光，檢測熒光 信號信號 62專業(yè)課 Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標(biāo)分子信標(biāo)) ) 應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 q 起始模板的定量 q 基因型分析 q 產(chǎn)物鑒定 q SNP分析 63專業(yè)課 Molecular beacon (Molecular beacon (分子信標(biāo)分子信標(biāo)) ) 優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn) q高特異性：高特異性：對目標(biāo) 序列 檢測SNP最靈敏的試 劑之一 q熒光背景低熒光背景低 優(yōu) 點(diǎn) q 只能用于一個特

27、定目標(biāo) q 設(shè)計(jì)困難 q 價格比較高 缺 點(diǎn) 64專業(yè)課 幾種方法總結(jié)幾種方法總結(jié) 化學(xué)試劑化學(xué)試劑工作原理工作原理有否淬滅劑有否淬滅劑信號檢測信號檢測主要應(yīng)用范主要應(yīng)用范 圍圍 SYBR Green I 結(jié)合于雙鏈結(jié)合于雙鏈DNADNA 的小溝中的小溝中 否否復(fù)性復(fù)性/ /延伸延伸 熔解曲線分析熔解曲線分析 定量和檢測目標(biāo)定量和檢測目標(biāo) 基因基因 Molecul ar Beacon 發(fā)夾型雜交探針發(fā)夾型雜交探針 有有 復(fù)性復(fù)性SNPSNP分析分析 定量和檢測目標(biāo)定量和檢測目標(biāo) 基因基因 TaqMan 水解型雜交探針?biāo)庑碗s交探針 （5 5-3-3外切）外切） 有有任何步驟任何步驟SNPSNP

28、分析分析 定量和檢測目標(biāo)定量和檢測目標(biāo) 基因基因 65專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理 絕對定量與相對定量絕對定量與相對定量 66專業(yè)課 絕對定量與相對定量絕對定量與相對定量 絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板 濃度（濃度（DNA，RNA） 病毒病毒DNA或或RNA的拷貝數(shù)的拷貝數(shù) 轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù) 相對定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含相對定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含 量量 差異表達(dá)分析差異表達(dá)分析 芯片評估芯片評估 轉(zhuǎn)基因生物的檢測轉(zhuǎn)基因生物的檢測 基因型檢測基因型檢測 67專業(yè)課 實(shí)時熒光實(shí)時熒光P

29、CR絕對定量方法絕對定量方法 unknown 104 103 標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線 已知濃度的相應(yīng)已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋模板，按不同濃度稀釋 根據(jù)實(shí)時根據(jù)實(shí)時PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲 線線 樣品樣品 與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的反應(yīng)得到未知濃度樣品的 C(t)值值 68專業(yè)課 使用實(shí)時熒光定量使用實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行絕對定量的優(yōu)勢進(jìn)行絕對定量的優(yōu)勢 敏感性高敏感性高 檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝 區(qū)分小差異樣品：區(qū)分小差異樣品：24，48，96， 大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢

30、測大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢測 100 1010 省時有效省時有效 69專業(yè)課 實(shí)時熒光相對定量實(shí)時熒光相對定量 相對定量的相對定量的目的目的 比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系） 相對定量的問題相對定量的問題 解決樣品材料不均一造成的差別解決樣品材料不均一造成的差別 解決加樣過程中的差別解決加樣過程中的差別 內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)基因 內(nèi)標(biāo)通常是內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 它們在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒它們在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒 定，受環(huán)境因素影響較小定，受環(huán)境因素影響較小 對目的基因進(jìn)行均一

31、化：目的基因拷貝每一個對目的基因進(jìn)行均一化：目的基因拷貝每一個 內(nèi)標(biāo)基因拷貝內(nèi)標(biāo)基因拷貝 70專業(yè)課 提提 綱綱 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR原理原理 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR的幾種方法介紹的幾種方法介紹 q 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及應(yīng)用 71專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR法法 標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品 相對定量中的內(nèi)標(biāo)相對定量中的內(nèi)標(biāo) 內(nèi)標(biāo)通常是內(nèi)標(biāo)通常是-actin、GAPDH基因等看家基因基因等看家基因 在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素 影響小影響

32、小 內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量 絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNADNA和體外轉(zhuǎn)錄的和體外轉(zhuǎn)錄的RNA RNA 72專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR法法標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)樣品 用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品如何設(shè)定？ 含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒 含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNAcDNA 紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測定濃度紫外分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)測定濃度 根據(jù)質(zhì)?；蚋鶕?jù)質(zhì)粒或cDNAcDNA分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀分子量換算成拷貝數(shù)，做系列稀 釋釋 73專業(yè)課 實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR法法 定量方法定量方法 q 絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn)絕對定量檢測起始模板數(shù)的精確拷貝數(shù)，通常用到標(biāo)準(zhǔn) 曲線曲線 q 相對定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因相對定量確定經(jīng)過不同處理的樣本目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本之間基因 的表達(dá)差異（不同時相）的表達(dá)差異（不同時相） v 2 2- - C C（t t） v 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 74專業(yè)課 TaqManTaqMan法舉例法舉例 標(biāo)記探針標(biāo)記探針 使用 TaqMan 探針進(jìn)行雙通道熒光定量 q Fa