發(fā)酵法生產(chǎn)維生素c

1、發(fā)酵工藝學(xué)課程論文題目名稱：發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C姓名：張曉偉所在學(xué)院：食品學(xué)院電話師：陳玉剛導(dǎo)師所在單位:石河子大學(xué)食品學(xué)院 專業(yè)：食品加工與安全發(fā)酵法生產(chǎn)維生素 C摘要：維生素C又稱L-抗壞血酸是高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物與其他少數(shù)生物的必需營(yíng)養(yǎng)素。抗壞血酸在大多的生物體可借由新陳代謝制造出來(lái)， 但是人類是最顯著的例外。 最廣為人知的是缺 乏維生素 C 會(huì)造成 壞血病。在生物體內(nèi)，維生素 C 是一種抗氧化劑，保護(hù)身體免于自由基的 威脅，維生素 C 同時(shí)也是一 種輔酶。其廣泛的食物來(lái)源為各類新鮮蔬果。維生素 C 為酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸內(nèi)酯， Vc 主要來(lái)源新鮮水果和蔬菜，

2、是高等靈長(zhǎng)類動(dòng)物與其他 少數(shù)生物的 必需營(yíng)養(yǎng)素。 Vc有L-型和D-型兩種異構(gòu)體，只有 L-型的才具有生理功能，還原 型和氧化型都有生理活性。 其結(jié)構(gòu)是一種含有 6 個(gè)碳原子的酸性多羥基化合物， 分子式為 C6H8O6 分子量為 176.1 。天 然存在的抗壞血酸有 L型和D型2種，后者無(wú)生物活性。維生 素C是呈無(wú)色無(wú)臭的片狀晶體，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。 在酸性環(huán)境中穩(wěn)定， 遇空氣中 氧、熱、光、堿性物質(zhì)，特別是由氧化酶及痕 量銅、鐵等金屬離子存在時(shí)，可促進(jìn)其氧化破 壞。氧化酶一般在蔬菜中含量較多， 故蔬菜儲(chǔ)存過(guò)程中 都有不同程度流失。 但在某些果實(shí)中 含有的生物類黃酮，能保護(hù)其穩(wěn)定性。維

3、生素 C 是生命的必需營(yíng) 養(yǎng)元素 , 具有多種生理功 能, 因而改進(jìn)維生素 C 生產(chǎn)工藝、 提高產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量成為目前維生素 C 研究的熱點(diǎn)。 目 前, 國(guó)內(nèi)維生素 C 最主要的生產(chǎn)方式是二步發(fā)酵法。 本文對(duì)維生素 C 二步發(fā)酵法的 生產(chǎn)過(guò) 程及目前對(duì)這一生產(chǎn)工藝改進(jìn)的主要技術(shù)措施和研究方向作一介紹 關(guān)鍵詞：維生素 C 生產(chǎn)工藝 二步發(fā)酵法 主要技術(shù)前言維生素 C 是簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物 , 與單糖有密切關(guān)系。研究表明植物中含有抗壞血酸 氧化酶， 能催化維生素 C 氧化，維生素 C 廣泛分布在植物組織中 , 新鮮水果及蔬菜中含量 尤多。多數(shù)哺乳類 和禽類也都能由葡萄糖合成足夠數(shù)量的 L- 抗壞

4、血酸。 但人、 豚鼠、 猴子、 蝙蝠、某些爬行動(dòng)物及大多數(shù)人工養(yǎng)殖的魚(yú)類甲殼類體內(nèi)缺乏古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶 , 不能將 古洛糖酸 內(nèi)酯轉(zhuǎn)化成 L- 抗壞血酸， 不能生物合成維生素 C, 動(dòng)物體內(nèi)貯藏維生素 C 量不大， 它們必須經(jīng)常從 環(huán)境或食物中攝取維生素 C 補(bǔ)充。維生素 C 廣泛存在于新鮮水果及綠葉蔬 菜中，尤以獼猴桃、板栗 （生） 、草莓、橘子、刺梨及辣椒等含量豐富。中草藥如醋柳果、 蒼耳子等也含有很多維生素 C 。維生素 C 純品為白色單斜晶系的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無(wú)臭味酸，久置色微黃。易溶于 水，略溶于 乙醇，不溶于乙醚、氯仿。它是一種不飽和的多羥基六碳化合物，以內(nèi)酯形式存 在，在 2

5、 ，3 位碳原 子之間烯醇式羥基上的氫可游離出來(lái)，故具有酸性。維生素 C 具有很 強(qiáng)的還原性，故極不穩(wěn)定，容易為熱或氧化劑所氧化，在中性或堿性溶液中尤甚；光、微量 重金屬（特 別是 Fe2+ 、Cu2+ ）或熒光物質(zhì)（如核黃素）更能促進(jìn)其被氧化。微量金屬元素對(duì)維生素 C 的氧化分解的催化作用，以銅離子為甚，其順序?yàn)?Cu2+ Co2+ Mn2+ Zn2+ Fe2+ 。在低于 p H5.5 的溶液中，維生素 C 較為穩(wěn)定；所以提取維生素 C 時(shí)，草酸和偏 磷酸是較好 的穩(wěn)定劑維生素C的發(fā)酵是指通過(guò)發(fā)酵作用將原料轉(zhuǎn)化為維生素C,再通過(guò)生物分離技術(shù)將其從發(fā)酵液中分離提純，獲取滿足要求的維生素C 產(chǎn)品

6、。維生素 C 的發(fā)酵過(guò)程中包含菌種的培育、 菌種的保藏、 種子的制備、 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、 發(fā)酵環(huán)節(jié)的控制和染菌及防治六個(gè)方面。概括地說(shuō)，在發(fā)酵的整個(gè)過(guò)程中要選育出優(yōu)秀的發(fā)酵菌種并采取合理有效的方法予以保藏，保持其優(yōu)良性狀； 在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)要對(duì)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)， 滿足生產(chǎn)上對(duì)發(fā)酵菌的數(shù)量要求；對(duì)于發(fā)酵還應(yīng)全面的考慮發(fā)酵的消耗、 產(chǎn)率問(wèn)題， 并通過(guò)適當(dāng)?shù)目刂品椒ㄌ岣咝剩?染菌和污染是發(fā)酵 過(guò)程中 的一個(gè)非常嚴(yán)重的問(wèn)題， 需要嚴(yán)格控制， 頻繁檢測(cè)確保發(fā)酵罐安全， 避免或較小損失。 v C 自四十 年代開(kāi)始工業(yè)化生產(chǎn) ，其生產(chǎn)技術(shù)是德國(guó)人 R eichstdn 于 1933 年發(fā)明的 （簡(jiǎn)稱萊 氏珠）,

7、即以 0 一 山梨醇為原料 ,經(jīng)過(guò)醋酸菌發(fā)酵生成山梨糖 ,再經(jīng)過(guò)酮化、 化學(xué)氧化 和水解 得 到 2 一酮基一 L 一古 龍酸 ， 再經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化得到 v C. 其工藝比較復(fù)雜 ， 而且消耗大量苯、丙 硯和發(fā)煙硫酸等易燃易爆和 有毒原料，此法至今仍被延用。維生素C 是生命的必需營(yíng)養(yǎng)元素， 具有多種生理功能 ， 隨著維生素 C 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用范圍的增加 ， 市場(chǎng)需求量日益增大 ， 人們 對(duì)維 生素 C 實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)行研究改進(jìn)。維生素 C 實(shí)驗(yàn)的生產(chǎn)技術(shù)經(jīng)歷了濃縮提取、 化學(xué)合成和生物 發(fā)酵三個(gè)階段。以前， 維生素 C 實(shí)驗(yàn)是從檸檬、 辣椒等天然植物中提取的 ，價(jià)格昂貴且生產(chǎn)量低 ， 遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)

8、需求 ， 現(xiàn)已退出工業(yè)生產(chǎn)。化學(xué)合成法主要是萊氏法， 該法工藝路線成熟 ， 原料簡(jiǎn)單易得 ， 產(chǎn)品質(zhì)量好收率高 ， 但此法工藝路線長(zhǎng) ， 難以連續(xù) 化操 作 ， 且需耗費(fèi)大量有毒、易燃易爆的化學(xué)藥品 ， 既危險(xiǎn)又污染環(huán)境。微生物二步發(fā)酵法 具有工藝路 線短、 “三廢”少、原料單耗低和對(duì)設(shè)備腐蝕性小等優(yōu)點(diǎn)。本文就微生物二步發(fā)酵法合成維生素 C 實(shí)驗(yàn)的生產(chǎn)工藝改進(jìn)過(guò)程及新的研究方向作介紹。1 Vc 的性質(zhì)、功能和用途1.1 性質(zhì) 純 Vc 在常溫下為無(wú)色晶體 ， 味酸 ， 易溶于水。 Vc 在結(jié)晶狀態(tài)尚穩(wěn)定 ， 而在水溶液中則很不穩(wěn) 定,容易為加熱、氧化所破壞。L抗壞血酸具有較強(qiáng)的還原性 ，在體內(nèi)

9、經(jīng)抗壞血酸氧化酶的作 用可脫 氫氧化成L脫氫抗壞血酸，該脫氫反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)。還原型的L抗壞血酸和氧化 型的L脫氫抗壞血酸均具有生理活性 ，它們構(gòu)成的一對(duì)氧化 -還原系統(tǒng) ，在細(xì)胞代謝中起著 重要的生理作用。1.2 功能與用途Vc 在人體中具有廣泛的生理作用 :1參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng) ;2 對(duì)抗自由基損傷 ;3 改善機(jī)體免疫功能；4參與膠原蛋白和細(xì)胞間質(zhì)的合成;5參與神經(jīng)遞質(zhì)的合成;6參與氨基酸代謝與 鐵代謝；7抑制血小板及白細(xì)胞活化；等等。因此，Vc在壞血病、感冒、心血管缺陷、高膽固醇、糖尿病、精神抑郁癥、危重型克山病等疾病的臨床治療中均具有重要的用途。此外,Vc還可以用作食品添加劑、飼料

10、添加劑、某些農(nóng)作物的催熟劑、化妝品工業(yè)防銹劑，等等。2 Vc的生產(chǎn)技術(shù)2.1 生產(chǎn)工藝方法的演變過(guò)程2.1.1濃縮提取本世紀(jì)的二、三十年代，人們對(duì)于維生素C的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)還不了解，獲取其產(chǎn)品的途徑只是經(jīng)驗(yàn)性地由富含“還原性因子”的生物組織如檸檬、胡桃、野薔薇、辣椒、腎上腺等遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類社會(huì)日益增長(zhǎng)的物質(zhì)需求。C。直至提取獲得。 此法生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量有限， 五十年代，仍有企業(yè)使用此法生產(chǎn)維生素2.1.2 化學(xué)合成1933 年， Reichstein 等和 Ault等兩個(gè)研究小組分別獨(dú)立發(fā)表了維生素法。從1937年開(kāi)始，以 Reichstein和Grussner的發(fā)明為基礎(chǔ)，建立了以C的合成方D

11、-葡萄糖為原料，加氫還原成 D-山梨醇， 然后利用一步發(fā)酵方法和化學(xué)方法合成維生素C的“萊氏法”Reichstein Procedure )，維生素C生產(chǎn)開(kāi)始進(jìn)入化學(xué)合成階段?！叭R氏法”生產(chǎn)的工藝流程主要包括以下五個(gè)步驟：1) D-葡萄糖在鎳的催化作用下，高溫高壓，加氫還原成D-山梨醇；2) D-山梨醇經(jīng)微生物如生黑葡萄糖酸 桿菌(Gluconobacter melanogenus )或弱氧化醋酸桿菌(Acetobater suboxydans )發(fā)酵氧化成 L-山梨糖；3) L-山梨糖在丙酮和硫酸的作用下，經(jīng)酮化生成雙丙酮-L-山梨糖(Diacetone-L-sorbose 簡(jiǎn)稱雙酮糖)，生

12、產(chǎn)上俗稱丙酸化。再用苯或甲苯提取，提取液經(jīng)水法除去單酮山梨糖后，蒸去溶劑而后分離出雙酮糖；4) 雙酮糖在高錳酸鈉氧化，鉑催化下，經(jīng)水解生成2-酮基-L-古龍酸(2-Keto-L-gulonic acid)；5) 2-酮基-L-古龍酸通過(guò)烯醇化和內(nèi)酯化，在酸性或堿性條件下，轉(zhuǎn)化生 成維生素C。萊氏法生產(chǎn)的Vc產(chǎn)品質(zhì)量好、收率高，而且生產(chǎn)原料(葡萄糖)便宜易得，中間產(chǎn)物(如雙 丙酮 _L_山梨糖)化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，但是萊氏法也存在著不少缺陷 ，諸如生產(chǎn)工序繁多、勞動(dòng)強(qiáng)度 較大，容 易造成環(huán)境污染，等等。為此，自上世紀(jì)60年代起，各國(guó)學(xué)者一直致力于萊氏法的改 進(jìn)7,20,并 取得了很多成果，有的已用于V

13、c工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐。2.1.3微生物發(fā)酵法六十年代以后，各國(guó)生產(chǎn)企業(yè)及科學(xué)家開(kāi)始探索以細(xì)菌生物酶轉(zhuǎn)化的方法來(lái)取代“萊氏法”，相繼提出了諸多反應(yīng)路線，并在此基礎(chǔ)上對(duì)有關(guān)反應(yīng)工藝的問(wèn)題進(jìn)行了探索。已成功應(yīng)用于大生產(chǎn)的細(xì)菌發(fā)酵法是我國(guó)七十年代初開(kāi)發(fā)的“二步發(fā)酵法”。由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、北京制藥廠、東北制藥總廠尹光琳、寧文珠等人發(fā)明的“二步發(fā)酵法”從七十年代后期開(kāi)始正式投產(chǎn)，逐漸在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)普遍采用，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)四大維生素C生產(chǎn)企業(yè)都采用此法。二步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素 C的新工藝1980年獲得國(guó)家級(jí)二等獎(jiǎng)?！岸桨l(fā)酵法”已 經(jīng)在中國(guó)、歐洲、日本和美國(guó)申請(qǐng)了專利，上海三維制藥有限公司當(dāng)時(shí)具有堅(jiān)實(shí)的科研開(kāi)發(fā)力

14、量，1985年成功地將維生素 C二步發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)讓給F Hoffmann-la Roche Ltd. ， Switzorland(瑞士豪大邁-羅氏公司)，成為建國(guó)以來(lái)最大的一項(xiàng)醫(yī)藥技術(shù)出口項(xiàng)目。該法應(yīng)用于大生產(chǎn)初時(shí)，從 D-山梨醇到維生素C的總收率平均為百分之四十多，但經(jīng)過(guò)近幾年的激烈市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)后，一些廠家可超過(guò)百分之六十五，最高為72%。“二步發(fā)酵法”的工 藝路線與“萊氏法”不同之處在于采用大、 小混合菌發(fā)酵法代替化學(xué)法轉(zhuǎn)化 L- 山梨糖合成 2- 酮基 -L- 古龍酸。簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，減少了生產(chǎn)設(shè)備投資，降低生產(chǎn)成本，去除了大量有機(jī) 溶媒等有毒物品的使 用，極大地減少了“三廢”的排放。2.2

15、微生物發(fā)酵法的研究進(jìn)展嚴(yán)格地講 , 二步發(fā)酵法也是一種半微生物發(fā)酵半化學(xué)合成方法。該工藝方法的發(fā)酵原料 仍為 D- 山 梨醇,而非葡萄糖 ；并且，第二步發(fā)酵過(guò)程中涉及 2 株菌的混合發(fā)酵 ，其詳細(xì)消長(zhǎng)機(jī) 制尚未完全明 了。這些都需要人們進(jìn)一步研究和探索。2.2.1 二步發(fā)酵法“二步發(fā)酵法” 是唯一應(yīng)用于大生產(chǎn)化的細(xì)菌發(fā)酵途徑。 采用生物技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵生成維 生素 C 的重要中間體2-酮基-L-古龍酸的工藝，使我國(guó)二步發(fā)酵法處于世界領(lǐng)先水平。目前，通過(guò)細(xì)胞固定化，原生質(zhì)融合， 遺傳工程等新技術(shù)的使用，如中國(guó)科學(xué)院等離子體物理 研究所采用離子束注入技術(shù) 作為新誘變?cè)春Y選出 2- 酮基 -L- 古龍酸

16、高產(chǎn)菌系 IPPM-1028 、中 國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所的新 型微生物蛭弧菌J26轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn) 2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵條件的研究，使“二步發(fā)酵法”工藝研究更加具有國(guó)際先進(jìn)水平?！岸桨l(fā)酵法”經(jīng)過(guò)的是 L 一山梨糖途徑 ，即 D 一葡萄糖加氫生成的 D 一山梨醇先經(jīng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化為 L 一山梨糖 ，后者 再經(jīng) 過(guò)細(xì)菌發(fā)酵生成維生素C 前體一 2 一酮基一 L 一古龍酸 (2 一 keto L 一 gulonie aeid,ZKLG) 。這兩步反應(yīng)是在不同微生物一t 進(jìn)行的。2.2.1.1 大、小菌的相互關(guān)系二步發(fā)酵法的第二步發(fā)酵是采用大菌、小菌 2 株菌的混合發(fā)酵過(guò)程 ，2 株菌缺一不可。

17、Vc 工業(yè) 生產(chǎn)中常采用的小菌為氧化葡萄糖酸桿菌，大菌為巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌或條紋假單孢桿菌。研究發(fā)現(xiàn) ， 在大、小菌的混合培養(yǎng)中 ， 兩者的增殖是同步進(jìn)行的。小菌是 2- KLG 合成的主體 ， 大 菌一方面直接參與 2- KLG 的合成過(guò)程 ， 一方面對(duì)小菌的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用6 。小菌合成的 2- KLG對(duì)大菌的生長(zhǎng)增殖有明顯的抑制作用，而大菌的存在卻是小菌的 生長(zhǎng)增殖和合成 2- KLG 所必需的12。深入研究發(fā)現(xiàn) ，大菌的胞內(nèi)液和胞外液均可促進(jìn)小菌的生長(zhǎng) ，大菌胞外液中具有該作用的組分的分子量在100kD 以上。此外 ,胞外液還具有促進(jìn)小菌轉(zhuǎn)化I-山梨糖生成2- KLG的作用，具有

18、該作用的組分包括30- 50kD和大于100kD兩部分，其中前者系一種含鐵和鋅的蛋白質(zhì) 13 。目前， 這方面研究仍在繼續(xù)。2.2.1.2 新菌種的選育優(yōu)良的菌種對(duì)于 Vc 產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的提高具有特殊重要意義。焦鵬等 (1997)14 運(yùn)用 SMA 探針 技術(shù)與 HB- HG 影印技術(shù)篩選得到了一株蛭弧菌J26, 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)生 2- KLG 的發(fā)酵單位為 50- 60mg/ml 。通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件 ，該菌株的發(fā)酵單位已達(dá)到83.9- 91.7%15 。許安等(1998)16 利用離子注入技術(shù)選育出的2- KLG 高產(chǎn)菌系 IPPM- 1028 的山梨糖轉(zhuǎn)化率比由氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌

19、組成的出發(fā)菌系高出18.8%。搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)表明 ，該菌系的發(fā)酵周期為 60_64h ，2_KLG 濃度可達(dá) 76g/L17 。陳建華等 (2002)18 篩選得到的優(yōu)良伴生 菌 短小 芽孢桿菌 ( Bacillus pumilus) 與氧化葡萄糖酸桿菌混合發(fā)酵生產(chǎn)2_KLG 的山梨糖轉(zhuǎn)化率高達(dá) 90%尹光琳等 (1997)19 選育得到的新組合菌系 SCB329_SCB933 勺發(fā)酵周期 僅為 40_50h,2_KLG 的發(fā)酵單位高達(dá) 115- 130mg/ml 。2.2.1.3 工程菌的構(gòu)建為了克服傳統(tǒng)二步發(fā)酵法的缺點(diǎn)，人們開(kāi)始嘗試構(gòu)建優(yōu)良的產(chǎn)2- KLG 工程菌。工程菌的構(gòu)建主要建立在人們

20、對(duì)二步發(fā)酵法菌種相關(guān)關(guān)鍵酶的研究基礎(chǔ)之上。1974年,Markover等提出了微生物合成 2-KLG的山梨酮途徑學(xué)說(shuō)，認(rèn)為L(zhǎng)-山梨糖在微生 物體內(nèi)先由L-山梨糖脫氫酶(SDH)催化生成I-山梨酮，爾后再由L-山梨酮脫氫酶(SNDH)催化 生成2- KLG后來(lái)，人們從氧化葡萄糖酸桿菌、 生黑葡萄糖酸桿菌等中陸續(xù)分離純化出了 SDH 研究發(fā)現(xiàn)，SDH的分子量為46- 60kD,系一個(gè)典型的米氏酶,對(duì)L-山梨糖的Km值為5.27 X 102 mol/L 0 SDH 的活力與 2- KLG 的合成呈正相關(guān) ，伴生菌的存在能提高 SDH 的比活力。 Shinjoh 等(1994) 首先從液化醋桿菌中克隆

21、了SDH 基因和 SNDH 基因。關(guān)于 SDH SNDH 及其編碼基因的研究為構(gòu)建優(yōu)良的產(chǎn) 2- KLG工程菌奠定了基礎(chǔ)。1998年,Saito等將SDH基因和SNDH基因?qū)胙?化葡萄糖酸桿菌 , 結(jié)果發(fā)現(xiàn) , 轉(zhuǎn)化菌株的 2- KLG 產(chǎn)量比出發(fā)菌株有較大提高。這方 面研究尚待繼續(xù) 深入。2.2.2 葡萄糖直接發(fā)酵法國(guó)外較早就開(kāi)始了細(xì)菌串聯(lián)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生 2- KLG 的研究。我國(guó)的尹光琳等 (1987) 采 用歐文氏 菌和棒桿菌以葡萄糖為發(fā)酵原料串聯(lián)發(fā)酵產(chǎn)生2- KLG 獲得成功。后來(lái) ,她們又通過(guò)原生質(zhì)體融合技術(shù)得到了歐文氏菌和棒桿菌的融合細(xì)胞。搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)表明, 細(xì)胞融合所得的 38

22、 株融合子中約有 40%能將葡萄糖轉(zhuǎn)化成 2_KLG 氧化葡萄糖酸桿菌與棒桿菌的休止細(xì)胞 共固定化 串聯(lián)發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生 2- KLG 工藝的最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到 37.72% 。1985年,Anderson等將棒桿菌的2,5-酮-D-葡萄糖酸(2,5- DKG)還原酶基因轉(zhuǎn)入歐文氏菌 ,所得工程菌的葡萄糖轉(zhuǎn)化率可達(dá)到47.7% 。后來(lái) ,又有一些學(xué)者進(jìn)行了類似試驗(yàn),并取 得初步成果。但是他們所獲得的工程菌都存在著一定的問(wèn)題 , 因此至今未見(jiàn)到用于生產(chǎn)實(shí)踐 的報(bào)道。2.2.3 2- KLG 的分離提純二步發(fā)酵法兩次發(fā)酵以后 , 發(fā)酵液中僅含 8%左右的 2- KLG, 而殘留菌絲體、蛋白質(zhì)、多 糖或懸

23、 浮微粒等雜質(zhì)的含量卻很高。這給 2- KLG 的分離提純帶來(lái)了很大困難 ，致使后處理費(fèi)用占總成本的比例較大。目前 ,Vc 工業(yè)生產(chǎn)中常用的 2-KLG 的分離提純方法有 :1 加熱沉淀 法;2 化學(xué) 凝聚法 ;3 超濾法。2.2.3.2 化學(xué)凝聚法同加熱沉淀法相比 , 化學(xué)凝聚法采用化學(xué)絮凝劑沉淀各種雜質(zhì) , 從而避免了前者能耗較 多的問(wèn) 題。季光輝等 (1997) 研制的新型化學(xué)絮凝劑能使 Vc 的總收率提高 2.5%。張秋榮等 (1999) 通過(guò)摸索 絮凝處理的最佳條件， 使 2-KLG 的提取收率比加熱沉淀法高出 4.49%。但是發(fā)酵液經(jīng)化學(xué)絮凝劑處理以后,離心所得的上清液中仍含有一定

24、量的蛋白質(zhì)等雜質(zhì),這些雜 質(zhì)可能影響2- KLG 的質(zhì)量。此外 ,該方法所使用的化學(xué)絮凝劑也可能對(duì)環(huán)境造成污染。2.2.3.3 超濾法超濾法是一種新興的膜處理技術(shù)。由于該方法在提高 2- KLG 收率、改善生產(chǎn)環(huán)境、減 少離子交 換樹(shù)脂損耗、實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化連續(xù)化生產(chǎn)等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，因此在 2- KLG 分離提純中的應(yīng)用日益廣泛。 1995 年,我國(guó)的東北制藥廠從丹麥引進(jìn)了目前全國(guó)最大膜面積的平板超 濾裝置。采用這套設(shè)備后 ,2- KLG 的分離提純成本比原先的化學(xué)凝聚法節(jié)約了 600 萬(wàn)元 ,并 且大大提高 了 2- KLG 的收率和生產(chǎn)的自動(dòng)化、連續(xù)化程度 34 。但是超濾法也具有一定的 缺

25、陷。 例如 ,設(shè)備一 次性投資較大 ,超濾裝置的通量、 抗污染能力尚待提高,等等。 目前 ,國(guó)內(nèi) 外學(xué)者正在探索反滲透、納濾等新的超濾法工藝。2.2.4 2- KLG 的化學(xué)轉(zhuǎn)化由于至今未能找到使葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)生 Vc 的微生物菌種 , 因此發(fā)酵產(chǎn)生的重要中間 產(chǎn)物 2- KLG必須通過(guò)化學(xué)方法轉(zhuǎn)化成Vc。根據(jù)所用化學(xué)試劑不同將化學(xué)轉(zhuǎn)化方法分為酸轉(zhuǎn)化法和堿轉(zhuǎn)化法。 由于前者所用的濃鹽酸對(duì)設(shè)備腐蝕較嚴(yán)重 , 且易造成環(huán)境污染 , 因此逐漸為 后者所 取代。堿轉(zhuǎn)化法的2- KLG 轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 92.6%, 并且操作簡(jiǎn)便 ， 對(duì)設(shè)備的腐蝕較輕 ， 所以適于 Vc 的規(guī)模化生產(chǎn)。2.2.5 2-

26、KLG 廢液處理二步發(fā)酵法發(fā)酵液經(jīng)分離提純后 , 仍含有大量的 2- KLG 。如果將其直接排放 , 不僅浪費(fèi) 了寶貴 的 2- KLG 資源,而且會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染。王輝等 (1998)運(yùn)用離子交換樹(shù)脂處理廢液,可大大降低其中的雜質(zhì) (如色素 )含量,從而從廢液中再結(jié)晶出 2- KLG 合格產(chǎn)品。王燕等 (1999) 則對(duì)利用 2- KLG 廢液生產(chǎn)草酸進(jìn)行了小試和中試。3 結(jié)語(yǔ)目前，維生素 C 混合生產(chǎn)菌的基礎(chǔ)研究中，由于二步發(fā)酵混合大小菌株的作用關(guān)系還 沒(méi)有較科學(xué) 論證，混合菌發(fā)酵L-山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸的機(jī)制只有宏觀的研究，在工業(yè)化生產(chǎn)中， 糖酸轉(zhuǎn)化率受培養(yǎng)外界環(huán)境因子的影

27、響很不穩(wěn)定， 因其內(nèi)在微妙機(jī)制還沒(méi)有 研究成 果， 這給穩(wěn)定單罐糖酸轉(zhuǎn)化率的高水平帶來(lái)困難。 外界環(huán)境因子的進(jìn)一步優(yōu)化組合技 術(shù)對(duì)工業(yè)化生產(chǎn) 的進(jìn)一步發(fā)展顯得尤其重要。Vc用途廣泛，是我國(guó)醫(yī)藥出口創(chuàng)匯的最重要產(chǎn)品之一。大力提高 Vc 的生產(chǎn)技術(shù)水平 ，提高 Vc 產(chǎn)品的產(chǎn)量與質(zhì)量 ，降低生產(chǎn)成本 ，不僅有利 于我 國(guó) Vc 生產(chǎn)工業(yè)的發(fā)展 ，而且對(duì)整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)都具有積極的作用。從技術(shù)上講，根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外 Vc 工業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)狀 ，我國(guó)應(yīng)注重以下幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題：3.1 利用基因工程等先進(jìn)手段選育優(yōu)良的微生物菌種二步發(fā)酵法是我國(guó) Vc 工業(yè)生產(chǎn)的當(dāng)家工藝方法。然而，該方法涉及二步三種菌 ，操作工序繁瑣

28、 ， 菌種傳代困難 ， 不能直接把葡萄糖作為發(fā)酵原料。 如果能選育出直接以葡萄糖為發(fā)酵 原 料的優(yōu)良菌株并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐 ，那么無(wú)疑會(huì)對(duì) Vc 生產(chǎn)工業(yè)帶來(lái)巨大的推動(dòng)力。理論分析 和初步實(shí)驗(yàn) 證明 ， 上述設(shè)想是切實(shí)可行的。 在長(zhǎng)期的菌種選育實(shí)踐中 ， 基因工程這一新興技術(shù) 顯示出良好的 應(yīng)用前景。今后 ， 應(yīng)當(dāng)廣泛采用基因工程等先進(jìn)手段 ， 爭(zhēng)取早日選育出適于 Vc 工業(yè)生產(chǎn)的優(yōu)良菌 種。由于“二步發(fā)酵法”的現(xiàn)有轉(zhuǎn)化率己經(jīng)達(dá)到相當(dāng)高的水平，因此想繼續(xù)提高 Vc 的生產(chǎn)效率應(yīng)該篩選新的菌株 ，來(lái)簡(jiǎn)化現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝。3.2 影響發(fā)酵工藝的因素微生物發(fā)酵是一個(gè)極為復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程。 基質(zhì)、 溫度

29、、等因素對(duì)微生物的代謝以及 菌體生 長(zhǎng)和產(chǎn)酸的形成都會(huì)產(chǎn)生影響。維生素“二步發(fā)酵法”是我國(guó)獨(dú)特的生產(chǎn)工藝， 技術(shù)路線成熟，工人操作熟練，發(fā)酵產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量均己達(dá)到國(guó)際水平。但維生素C二步發(fā)酵法”過(guò)程十分復(fù)雜 ， 干擾因素多 ， 再加之生長(zhǎng)自動(dòng)化、連續(xù)化程度差 ， 因而造成生產(chǎn)穩(wěn)定性不夠 ， 勞動(dòng)生戶 ;率較低。此外由于發(fā)酵基質(zhì)濃度低， 設(shè)備利用率差 ， 這就導(dǎo)致工廠的生產(chǎn)成本偏高。 為了解決以上問(wèn)題 ， 對(duì)該發(fā)酵工藝動(dòng)力學(xué)的研究是非常必要的。邵軍等和魏東芝等分別于1989 年和1992 年報(bào)道了對(duì)維生素 c 二步發(fā)酵過(guò)程動(dòng)力學(xué)的研究。 他們通過(guò)測(cè)定發(fā)酵體系中 大小菌生長(zhǎng)規(guī)律 ， 以及基質(zhì)和產(chǎn)酸的變化 ， 建立了簡(jiǎn)化的動(dòng)力學(xué)模型 ， 不僅從一定程度上揭示 了 ZKLG 發(fā)酵系統(tǒng)的 本質(zhì)特征 ，而且可用于分析發(fā)酵過(guò)程并指導(dǎo)生產(chǎn)。同時(shí)，動(dòng)力學(xué)模型的建立也為維生素 C 二步發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)連續(xù)自動(dòng)化奠定了理論基礎(chǔ)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)部分科研單位和制藥廠對(duì)于第二步發(fā)酵混合菌株