現(xiàn)代微生物遺傳學(xué)---第四授課單元-課件

1、第四授課單元 第三章第三章 質(zhì)粒質(zhì)粒 第一節(jié) 質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)和命名 質(zhì)粒： 存在于細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞中、獨(dú)立于染 色體外、能進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。 對(duì)于宿主，一般是非必需的 通常是共價(jià)(covalent)、閉合(closed)、環(huán)狀 (circular)雙鏈DNA.(但也有例外：線狀DNA， RNA) 附加體：整合在染色體上，或游離，并能攜帶 宿主的染色體基因。 一、質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn) F質(zhì)粒(1946年)，第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒 20世紀(jì)50-70年代：抗性質(zhì)粒的大量研究，以 及其他質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn) 20世紀(jì)70年代后，質(zhì)粒廣泛應(yīng)用于遺傳工程和 分子生物學(xué)研究中。 二、質(zhì)粒的命名原則 最初發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒由研究者

2、根據(jù)表型、大小等特征自 行命名。(F因子、R質(zhì)粒、Col質(zhì)粒等) 1976年Novick提出了質(zhì)粒命名原則： 質(zhì)粒名稱一般由三個(gè)英文字母及編號(hào)組成； 第一個(gè)字母一律小寫p表示（plasmid） 后兩個(gè)字母要大寫，可以采用發(fā)現(xiàn)者人名、實(shí)驗(yàn)室名 稱、表型性狀或其他特征的英文縮寫。 編號(hào)為阿拉伯?dāng)?shù)字，用于區(qū)分同一類型的不同質(zhì)粒。 (pUC18, pUC19等) 第二節(jié) 質(zhì)粒編碼的遺傳表型 大多數(shù)質(zhì)粒均控制著宿主細(xì)胞的一種或幾種特 殊性狀，具有一定的表型，質(zhì)?？梢罁?jù)其表型 不同可劃分為以下幾類： 1.致育質(zhì)粒 2.抗藥性質(zhì)粒 組成：轉(zhuǎn)移區(qū)和抗性決定子 抗藥的機(jī)制：改變抗生素作用的靶點(diǎn)；修飾抗生素； 組

3、織抗生素進(jìn)入；產(chǎn)生一種酶能代替宿主細(xì)胞中被 抗生素作用的靶點(diǎn)。 3.產(chǎn)生抗生素的質(zhì)粒 細(xì)菌素：細(xì)菌產(chǎn)生的一般只能抑制或殺死種內(nèi)不同亞 種或菌株中敏感細(xì)菌的特殊多肽類多肽類代謝產(chǎn)物。 Col質(zhì)粒：10種，有非接合型和接合型之分。 4.產(chǎn)生毒性的質(zhì)粒(BT) 5.降解質(zhì)粒： 假單胞菌屬假單胞菌屬是一類能廣泛利用有機(jī)化合物進(jìn)行生長的 細(xì)菌。其體內(nèi)含有大量的降解質(zhì)粒。 6.致病性質(zhì)粒： 根癌土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒；以及破傷風(fēng)梭菌、肉毒梭 菌和大腸桿菌等都存在致病性質(zhì)粒。 7. 共生固氮質(zhì)粒 根瘤菌普遍喊有該類質(zhì)粒。 包括共生質(zhì)粒和非共生質(zhì)粒，非共生質(zhì)粒對(duì)共生作用 可有正或負(fù)的調(diào)節(jié)作用。 8. 隱蔽質(zhì)粒(

4、cryptic plasmid) 酵母的2m質(zhì)粒（p171） 長為2m的6kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子 位于酵母細(xì)胞核內(nèi)，50100拷貝 只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4 個(gè)基因，無遺傳表型 質(zhì)粒上有兩個(gè)600bp長的IR，被一個(gè)2.7kb區(qū)域和一個(gè) 2.3kb小區(qū)域所間隔 兩個(gè)IR上都有一個(gè)專一重組位點(diǎn)(FRT)，經(jīng)過重組，可使 質(zhì)?；プ儺悩?gòu)成A型和B型。 第三節(jié) 質(zhì)粒的檢測 檢測質(zhì)粒的方法主要根據(jù)質(zhì)粒的（遺傳學(xué)特性） 和（分子結(jié)構(gòu)特性）。 遺傳特性：獨(dú)特的表型、轉(zhuǎn)移、人為消除等。 分子結(jié)構(gòu)：cccDNA和染色體相比對(duì)理化因子 有更強(qiáng)的抗性。 一、質(zhì)粒消除（理化因子和生物學(xué)方法） 理化因子消除法 消除

5、劑：吖啶類，EB，某些抗生素，高溫，UV等 如何判斷某一遺傳性狀的喪失是質(zhì)粒消除的結(jié)果還是 染色體基因突變的結(jié)果呢？ 回復(fù)突變情況 突變率 理化因子消除質(zhì)粒的作用機(jī)制： 對(duì)質(zhì)粒本身的復(fù)制和分離產(chǎn)生抑制作用，在生長中被淘汰 選擇性抑制帶有質(zhì)粒的菌的生長。 2.原生質(zhì)體消除法 使待消除質(zhì)粒的菌株在一定條件下形成原生質(zhì)體， 在再生后生長的菌株中可出現(xiàn)高頻率質(zhì)粒消除菌。 二、遺傳轉(zhuǎn)移 將質(zhì)粒導(dǎo)入已經(jīng)消除了該質(zhì)粒的原宿主細(xì)胞， 比較導(dǎo)入前后表型性狀的差異或恢復(fù)程度。 三、分子雜交 在初步確定某菌株可能含有質(zhì)粒的情況下，利 用已知表型性狀的基因片段作探針進(jìn)行分子雜 交，來檢測其菌株是否含有該種質(zhì)粒。 四、

6、質(zhì)粒的分離、檢測與純化 質(zhì)粒分離方法：堿變性法 菌體的培養(yǎng)和收集 溶菌 堿變性處理 離心分離 有時(shí)為了快速提取質(zhì)粒DNA，可以在提取液堿變性后， 用pH4.8的醋酸鈉高鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH到中性，這時(shí)染 色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而即使變 性的質(zhì)?？梢曰謴?fù)到原來的構(gòu)型，再通過離心，這樣 可以縮短提取質(zhì)粒的時(shí)間。 純化和檢測方法 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳(質(zhì)粒質(zhì)粒3種構(gòu)型泳動(dòng)速度不同，瓊種構(gòu)型泳動(dòng)速度不同，瓊 脂糖濃度，脂糖濃度，EB染色，分子量的判斷染色，分子量的判斷) 氯化銫-EB密度梯度離心 電鏡觀察 第四節(jié) 質(zhì)粒的復(fù)制與調(diào)節(jié) 一、質(zhì)粒的大小和拷貝數(shù) 1.大小測定 表示方式：

7、MD或kb，1MD的雙鏈DNA1.65kb。 測定方法：電泳、電鏡、測序。 大小范圍：1200kb，個(gè)別8001000。 2.質(zhì)粒的拷貝數(shù) 嚴(yán)緊型質(zhì)粒(stringent plasmid)或低拷貝質(zhì)粒； 松弛型質(zhì)粒(relaxed plasmid)或高拷貝質(zhì)粒。（氯霉 素可抑制細(xì)胞分離，終止染色體復(fù)制，但松弛型質(zhì)粒 可持續(xù)復(fù)制，其拷貝數(shù)可達(dá)到10003000）。 二、質(zhì)粒的復(fù)制 1.質(zhì)粒復(fù)制的方式 (P120) 質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)稱為 oriV,大腸桿菌為oriC。 復(fù)制主要通過型復(fù) 制和滾環(huán)復(fù)制之一進(jìn) 行。其中以型復(fù)制 為主（包括單向和雙 向）。 質(zhì)粒只編碼一種或少 數(shù)幾種與復(fù)制有關(guān)的 蛋白質(zhì)，

8、其他復(fù)制蛋 白都來自宿主。 2.復(fù)制起點(diǎn)區(qū)oriV 的功能和pBR322 質(zhì)粒 復(fù)制起點(diǎn)區(qū)oriV 功能與質(zhì)粒載體 的構(gòu)建、寄主范 圍 pBR322質(zhì)粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白對(duì)質(zhì)粒的復(fù) 制負(fù)調(diào)控）區(qū)；pSC101的tetr；Tn3的ampr。屬中等拷 貝質(zhì)粒，1030個(gè)/細(xì)胞 pUC類：高拷貝質(zhì)粒（100300個(gè)/細(xì)胞），也是pMB1 的ori，但是沒有rop。 質(zhì)粒的寄主范圍和質(zhì)粒的拷貝數(shù)均決定 于質(zhì)粒的ori區(qū)域。 三、質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控 質(zhì)粒的調(diào)控一般采用直接或間接的負(fù)調(diào)控負(fù)調(diào)控機(jī)制。 負(fù)調(diào)控因子可是蛋白質(zhì)、RNA或DNA重復(fù)序 列。 調(diào)控類型可分兩類： 抑制物-靶位調(diào)控(i

9、nhibitor-target regulation) 重復(fù)子-競爭結(jié)合調(diào)控(iteron-binding regulation) 1.抑制物-靶位調(diào)控 依賴一小段反向轉(zhuǎn)錄 的RNA作為抑制物， 通過它與質(zhì)粒DNA復(fù) 制引物或編碼Rep蛋 白（復(fù)制蛋白）的 mRNA的互補(bǔ)結(jié)合以 阻止質(zhì)粒復(fù)制的起始。 (1) ColE1質(zhì)粒復(fù)制調(diào) 控（P122圖5-7） 抑制物（負(fù)調(diào)控 因子）：反義 RNA、Rop蛋白 靶位：質(zhì)粒復(fù)制 的前提引物 機(jī)制：反義RNA 和引物RNA互補(bǔ) 結(jié)合，阻止其發(fā) 揮作用；Rop 蛋 白具有強(qiáng)化反義 RNA和引物RNA 結(jié)合的作用。是是 抑制物對(duì)靶位的抑制物對(duì)靶位的 直接調(diào)控模

10、型。直接調(diào)控模型。 (2)R1質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控 抑制物通過抑制 Rep蛋白的形成而 阻止了該蛋白對(duì) oriV的激活作用。 是間接調(diào)控模型。 抑制物： CopB蛋白：是 PrepA啟動(dòng)子的 阻遏蛋白； copA基因轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物RNA：Rep 蛋白mRNA互補(bǔ)， 抑制其合成 靶位：Rep蛋白的 合成 2.重復(fù)子-競爭結(jié)合調(diào)控 采用該機(jī)制進(jìn)行調(diào)控的質(zhì)粒為重復(fù)子質(zhì)粒。 在復(fù)制起始位點(diǎn)ori和復(fù)制基因rep附近存在著多個(gè) 長度為1722bp的DNA短片段。這些短片段叫重重 復(fù)子。復(fù)子。 重復(fù)子能與復(fù)制必需的Rep蛋白競爭性結(jié)合，從而 抑制了質(zhì)粒的復(fù)制和拷貝數(shù)的增加。 pSC101、F、P1等都屬于重復(fù)子質(zhì)粒

11、。 重復(fù)子質(zhì)粒復(fù)制調(diào)控機(jī)制（兩種,p124-125） (1)轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控轉(zhuǎn)錄自體調(diào)控：RepA蛋白通過與自身啟動(dòng)子區(qū) 的某些序列（如pSC101中的反向重復(fù)序列IR1和 IR2）的結(jié)合而抑制自身的合成，這種方式叫做轉(zhuǎn) 錄自體調(diào)控。 (2)偶聯(lián)模型調(diào)控偶聯(lián)模型調(diào)控： 由于重復(fù)子序列間 的相互作用使兩個(gè) 質(zhì)粒偶聯(lián)在一起， 從而抑制了質(zhì)粒復(fù) 制的起始，該方式 即為偶聯(lián)模型。 質(zhì)粒濃度低時(shí)， RepA蛋白只與一個(gè) 質(zhì)粒結(jié)合； 質(zhì)粒濃度高時(shí)， RepA蛋白通過與重 復(fù)子序列的結(jié)合使 兩個(gè)質(zhì)粒聯(lián)結(jié)在一 起，阻止質(zhì)粒的復(fù) 制。 F質(zhì)粒的復(fù)制調(diào)控 F質(zhì)粒的復(fù)制區(qū)也含有1922bp的重復(fù)序列，repE 基因編碼

12、的RepE蛋白也是質(zhì)粒復(fù)制所必需的。 RepE蛋白是一種自體調(diào)控蛋白，可能也是通過與 自身啟動(dòng)子結(jié)合對(duì)自身濃度進(jìn)行調(diào)控。 RepE蛋白 通過與重復(fù)子序列結(jié)合抑制質(zhì)粒復(fù)制。 四、質(zhì)粒之間的不相容性 不相容性(incompatibility): 親緣關(guān)系相近的兩 種質(zhì)粒，在非選擇性條件下不能穩(wěn)定存在于同 一個(gè)細(xì)胞中，該種特性為質(zhì)粒的不相容性。與 質(zhì)粒的復(fù)制起始的控制密切相關(guān)。 同種質(zhì)粒的衍生物總是不相容的； 不同質(zhì)粒的衍生物可能相容，也可能不相容。 不相容群(incompatibility group)：不能在同 一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)穩(wěn)定存在的質(zhì)粒屬于一個(gè)不相 容群。因此，不同的不相容群的質(zhì)粒能同時(shí)穩(wěn)

13、定存在于一個(gè)細(xì)胞中。 五、質(zhì)粒的穩(wěn)定性 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性包括：分離的不穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu) 的不穩(wěn)定性。 質(zhì)粒分配到子細(xì)胞中的途徑包括：主動(dòng)分配 (active distribution)和隨機(jī)分配(random distribution)兩種方式。 1.主動(dòng)分配機(jī)理 該類質(zhì)粒一般為低拷貝質(zhì)粒。其穩(wěn)定性通過質(zhì)粒編 碼的基因產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)，包括編碼主動(dòng)分配體系的 par區(qū)和致死基因。 par區(qū)：即分配區(qū)partition region，指在細(xì)胞分裂 過程中使質(zhì)?？截悢?shù)均等分配到子細(xì)胞中的質(zhì)粒 DNA序列。 質(zhì)粒的復(fù)制與分配是分開獨(dú)立進(jìn)行的。 F質(zhì)粒的par區(qū)結(jié)構(gòu)和分配機(jī)理 結(jié)構(gòu)（p128圖5-13）：反式作用基因(sopA, sopB)， 順式作用位點(diǎn)(sopC)。 機(jī)理： sopC區(qū)的功能類似于真核染色體上的著絲粒， 所以又稱為類著絲粒位點(diǎn)(centromete-like site)。反式 作用蛋白SopB與順式作用位點(diǎn)sopC區(qū)結(jié)合形成成為分分 配復(fù)合體配復(fù)合體的蛋白-核酸復(fù)合物。該復(fù)合物參與質(zhì)粒的分 配。如缺