代謝工程與合成生物學(xué)作業(yè)-生物元件

1、.合成生物學(xué)之生物部件622（山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南，250100）摘要：合成生物學(xué)強(qiáng)調(diào)“設(shè)計(jì)”和“重設(shè)計(jì)”，其目的是通過人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建自然界中不存在的生物系統(tǒng)來解決能源、材料、健康和環(huán)保等問題，其工程化的思想和標(biāo)準(zhǔn)化的工具一經(jīng)興起變得到全世界范圍的廣泛關(guān)注。生物系統(tǒng)的層次化結(jié)構(gòu)是合成生物學(xué)本質(zhì)化的典型體現(xiàn)，合成生物學(xué)系統(tǒng)中最簡單最基本生物模塊被稱為生物部件（part），它是自下而上的研究策略中基礎(chǔ)部分，本文回顧了合成生物學(xué)中常用的生物部件級標(biāo)準(zhǔn)化使用方法，著重介紹了啟動子和核糖開關(guān)的相關(guān)研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：合成生物學(xué) 生物部件 生物元件1953年，年輕的j.d.watson和f. cric

2、k從dna的x射線的x衍射圖上解讀了雙螺旋結(jié)構(gòu)，隱藏了幾十億年的生物密碼逐漸露出端倪。2003年人類基因組計(jì)劃順利完成，此后包括人類在內(nèi)的各種生物的圖譜紛紛出爐，生物遺傳密碼的神秘面紗正在被迅速揭開。生物學(xué)由定性描述轉(zhuǎn)向定量計(jì)算，從分析到設(shè)計(jì)，進(jìn)入系統(tǒng)和合成生物學(xué)（synthetic biology）的的時(shí)代。目前合成生物學(xué)的定義還處于多元化階段，比較全面地可以概括為：合成生物學(xué)是指按照一定的規(guī)律和現(xiàn)有的知識，設(shè)計(jì)和建造新的生物部件、裝置和系統(tǒng)，或重新設(shè)計(jì)已有的天然系統(tǒng)為人類的特殊目的服務(wù)。從這個(gè)定義來看，合成生物學(xué)包含自下而上的研究策略和自上而下的研究策略，對于前者的探索是艱深而富有劃時(shí)代意

3、義的。合成生物學(xué)最終期望是借鑒電子學(xué)的方法能能像“搭積木”一樣構(gòu)建基因線路，而這最基本的就是模塊化元件。我們稱具有標(biāo)準(zhǔn)接口、功能相對獨(dú)立生物大分子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑、基因線路等為“模塊”（module）或生物積塊（biobrick），模塊的規(guī)?？纱罂尚?，大致可分為部件（part）、裝置（device）、系統(tǒng)（system）及多細(xì)胞體系等幾個(gè)層次，其中最基礎(chǔ)的就是生物部件。模塊化設(shè)計(jì)體現(xiàn)了合成生物學(xué)的精髓，模塊往往具有信息隱藏，內(nèi)聚耦合，封閉性開放性的特性。常見的生物部件按照功能可以分為啟動子（promoter）、核開關(guān)（riboswithch）、rbs、終止子、操縱子、蛋白編碼基因（cds）、報(bào)告

4、基因、標(biāo)簽組件、操縱子等，當(dāng)然這些分類層側(cè)不是絕對的。1. 啟動子1.1 啟動子的結(jié)構(gòu)啟動子是rna聚合酶特異性識別和結(jié)合的dna序列，在原核生物和真核生物中是有差別的。1.1.1 原核生物中的啟動子原核生物中的啟動子通常，rna聚合酶是依靠因子識別dna上的特定序列，70是發(fā)現(xiàn)比較早也是比較常見的因子，它通常特異識別啟動子的-10和-35兩個(gè)保守dna盒子（如圖 1）。精品.圖 1 原核生物中的啟動子模式圖1.1.2真核生物中啟動子結(jié)構(gòu)相比原核生物的啟動子，真核生物的啟動子比較復(fù)雜，rna聚合酶核心啟動子是一個(gè)在轉(zhuǎn)錄過程中關(guān)鍵的但又容易被忽略的元件。核心啟動子被定義為dna的延伸，它涵蓋了r

5、na的起始位點(diǎn)，典型的核心啟動子大約有40到50核苷酸的長度，它指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的起始。在過去，人們推測核心啟動子在功能上是通用的，轉(zhuǎn)錄起始是通過一種共享通用的機(jī)制進(jìn)行的。最近的研究表明，各種核心啟動子在結(jié)構(gòu)和功能上都存在相當(dāng)多的差異。存在大量的dna元件作用于核心啟動子的活性，給定核心啟動子的特定性能是由這些核心啟動子修飾因子的有無決定的。已知的核心啟動子元件包括tata盒子、inr（起始子）、breuata盒子的上游的bre tfb（rna聚合酶的轉(zhuǎn)錄因子）識別元件和bred（tata盒子下游的bre）、mte（十基序元件）、dce（下游核心元件）和dpe（下游核心啟動子元件）（如圖 2）。圖

6、 2 真核生物中啟動子模式圖1.2啟動子的種類在合成生物學(xué)以及以前的生物學(xué)研究中，我們已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化了許多啟動子元件（如表格 精品.1）。最經(jīng)典的啟動子是乳糖操縱子中的乳糖啟動子，它可以被乳糖誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)中我們常用iptg誘導(dǎo)；色氨酸啟動子引人注意的特性是有一段弱化子，可以根據(jù)細(xì)胞環(huán)境中色氨酸的濃度調(diào)控后續(xù)基因的表達(dá)；tac啟動子則是上述兩種啟動子的融合啟動子，是典型常用的強(qiáng)啟動子；pl、pr是噬菌體溶源和裂解生長狀態(tài)轉(zhuǎn)化及維持中的重要啟動子，阻遏蛋白的溫度敏感突變可以使其收溫度誘導(dǎo)；pteta基因也是很常用啟動子之一，可以被脫水四環(huán)素誘導(dǎo)；t7啟動子則是比較特殊一種啟動子，對rna聚合酶的種類有特

7、異性。表格 1 常見啟動子的概述啟動子名稱英文表示調(diào)節(jié)基因誘導(dǎo)物備注乳糖啟動子placzlaci異丙基硫代半乳糖苷(iptg)可誘導(dǎo)負(fù)反饋色氨酸啟動子ptrptrpr - trp可阻遏負(fù)反饋（！弱化子）tac啟動子ptaclaciq iptg、乳糖、溫度敏感拼合啟動子啟動子pl、prpl/prcits857溫度敏感可誘導(dǎo)負(fù)反饋四環(huán)素溢出泵基因啟動子ptetatetr蛋白家族四環(huán)素（tc）脫水四環(huán)素（atc）可誘導(dǎo)負(fù)反饋t7啟動子pt7大腸桿菌的rna聚合酶不能識別，但噬菌體及真核生物的rna聚合酶可以1.3啟動子的調(diào)控及意義為實(shí)現(xiàn)一些特定目的，微生物系統(tǒng)工程需要一些設(shè)計(jì)工具，這些工具以某種可預(yù)

8、測的、定量的方式起作用。在合成生物學(xué)的領(lǐng)域，基因之間級聯(lián)調(diào)控很多都是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平（如圖 3），而這些往往是在轉(zhuǎn)錄起始階段起作用，也就是說與啟動子有關(guān)，因此標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)啟動子對整個(gè)系統(tǒng)的運(yùn)轉(zhuǎn)有重要意義。精品.圖 3 在轉(zhuǎn)錄水平控制基因表達(dá)的設(shè)計(jì)工具在自下而上的研究策略中，我們往往用基因線路模擬一些電子學(xué)上的邏輯開關(guān)，從簡單邏輯或與非，到雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)，再到震蕩子（如圖 4）實(shí)質(zhì)上都是上面提到的啟動子及其調(diào)控基因按照一定次序設(shè)計(jì)排列的結(jié)果。此外，在合成生物學(xué)學(xué)術(shù)比賽igem中，相當(dāng)多的隊(duì)伍作品的關(guān)鍵都是發(fā)現(xiàn)或者標(biāo)準(zhǔn)化了一些有特殊功能啟動子及其相關(guān)組件，比如感光、溫度敏感、感受重金屬離子等。圖 4 雙穩(wěn)

9、態(tài)開關(guān)（左）及震蕩子（右）的邏輯結(jié)構(gòu)2核糖開關(guān)在1991年，人們就發(fā)現(xiàn)e.coli的btub基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5-utr存在高度保守序列，并發(fā)現(xiàn)ado-cbl和b12可以使btnb基因表達(dá)，但沒有發(fā)現(xiàn)可以與ado-cbl結(jié)合的蛋白因子；1990年，andrew從隨即合成的rna序列中篩選出特異性結(jié)合有機(jī)染料配體的rna，并命名為“aptamer”（適體）；2002年，breaker受到適體的啟發(fā)，證明了這種天然適體的存在，命名為“核糖開關(guān)”。到目前（2009年）為至已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少于 12 個(gè)核糖開關(guān)（如表格 2），大部分是抑制性的（當(dāng)存在相應(yīng)代謝物時(shí)基因關(guān)閉）。主要參與氨基酸、核苷酸、維生素等基礎(chǔ)物

10、質(zhì)的代謝。表格 2 一些已知的riboswithch的名稱、調(diào)節(jié)小分子和功能精品.核糖開關(guān)中，mrna 本身作為傳感器 ,直接感受環(huán)境中相應(yīng)代謝物的變化 ,結(jié)合代謝物后發(fā)生構(gòu)象變化 ,在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。核糖開關(guān)也是一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制 ,與以往發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)機(jī)制的區(qū)別是：它不需要任何蛋白質(zhì)（乳糖操縱子）或核糖體（色氨酸弱化子）作為中介 ,由 rna 直接感受環(huán)境中代謝物的變化 ,通過形成選擇性莖環(huán)結(jié)構(gòu) ,在轉(zhuǎn)錄延伸和翻譯起始水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。2.1核糖開關(guān)的作用機(jī)制已發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌核糖開關(guān)均位于代謝相關(guān)基因mrna的 5utr，由 2 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成 :適體結(jié)構(gòu)域(aptamer domain

11、，ad) 和 表 達(dá) 結(jié) 構(gòu) 域 ( expression domain, epd)。ad 直接結(jié)合小分子代謝物，是rna 傳感器. 序列分析表明，在不同細(xì)菌的同類核糖開關(guān)中，ad 序列保守，形成高度相似的二級結(jié)構(gòu)。與配體結(jié)合后，ad 發(fā)生構(gòu)象變化，信息傳遞至 epd ，后者通過形成選擇性莖環(huán)結(jié)構(gòu)，直接調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。不同核糖開關(guān)的 epd 可能利用不同的機(jī)制調(diào)節(jié)基因表達(dá)。（如圖 5）目前發(fā)現(xiàn)的真核生物的核糖開關(guān)位于 3utr 或內(nèi)含子，也具有相似的 ad 和 epd，可能在多個(gè)環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)真核生物基因表達(dá)。圖 5 核糖開關(guān)的作用機(jī)制為研究核糖開關(guān)的作用機(jī)制，f.j.isaacs等構(gòu)建了人工的ri

12、boswithch（如圖 6），這種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控比轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控更加迅速?；蛘１磉_(dá)時(shí)，啟動子p控制gfp的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄形成的mrna的rbs暴露在外，一旦核糖體識別并與之結(jié)合以后，mrna既可以翻譯成蛋白質(zhì)。而在人工構(gòu)建riboswithch中，在啟動子pcr和rbs中間插入一段與rbs互補(bǔ)的cr序列。轉(zhuǎn)錄后mrna5與rbs結(jié)合形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，將rbs掩蓋阻止核糖體與之結(jié)合，從而組織翻譯的進(jìn)行。另一個(gè)啟動子pta啟動后表達(dá)一個(gè)短鏈非編碼rnatarna。tarna能以高度特異性優(yōu)先定位于crrna，共經(jīng)過線性-環(huán)相互作用將crrna的發(fā)卡環(huán)解開，tarna的尾部與crrna互補(bǔ)配對。此時(shí)，cr

13、rna的rbs位點(diǎn)暴露在外，核糖體可與之結(jié)合重新激活翻譯。2.2核糖開關(guān)的應(yīng)用2.2.1小分子抗菌藥物riboswitch 在人類細(xì)菌性病原體內(nèi)分布廣泛（如），預(yù)示著將riboswitch 作為藥靶將會有廣闊的應(yīng)用前景。臨床上一些常用抗菌藥物的毒性機(jī)制已經(jīng)被證實(shí)是以riboswitch 為藥靶的例如吡啶磺胺(pyrithiamine，pt)，一種常用的硫胺代謝對抗物，是維生素b1 （thiamine ，硫胺素）的類似物。它在細(xì)胞內(nèi)很容易磷酸化成吡啶磺胺焦磷酸鹽ptpp)。ptpp 可以與許多tpp riboswitch 結(jié)合(其親和性與tpp 類似)，從而抑制由tpp riboswitch 控

14、制的基因表達(dá)。精品.圖 6 用于控制轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的人工riboswithch系統(tǒng)表格 3 一些含有riboswithch調(diào)控的人類細(xì)菌性病原體2.2.2細(xì)菌趨向運(yùn)動細(xì)菌的趨向運(yùn)動的研究在生物降解、生物納米、合成生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要意義。shana topp等人在大腸桿菌中設(shè)計(jì)一個(gè)通過小分子和mrna來指導(dǎo)細(xì)菌運(yùn)動的系統(tǒng)。在野生型的大腸桿菌中，鞭毛馬達(dá)的旋轉(zhuǎn)方向有蛋白chey控制，當(dāng)chey沒有被磷酸化時(shí)，鞭毛馬達(dá)逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)；當(dāng)chey被磷酸化后，chey-p可以和鞭毛馬達(dá)蛋白flim結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞滾動；因此野生型大腸桿菌可以在半固體瓊脂上遷移。然而，在chez蛋白缺失時(shí)，chey-p不能去磷

15、酸化，細(xì)胞只能翻滾不能遷移。（如圖 7）研究人員在chez蛋白的編碼基因前設(shè)計(jì)了核糖開關(guān)（如圖 8左），它只有和茶堿結(jié)合后才能改變構(gòu)型與核糖體結(jié)合翻譯出chez使細(xì)胞運(yùn)動。所以導(dǎo)致了改造后的大腸桿菌只會在有茶堿存在的區(qū)域遷移（如精品.圖 8右）。圖 7 大腸桿菌chey與其運(yùn)動的關(guān)系圖 8 riboswithch設(shè)計(jì)（左）與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（右）3.生物部件的討論生物部件是最簡單、最基本的生物積塊，能有通過標(biāo)準(zhǔn)化的組裝方法與其他part組裝成更加復(fù)雜的模塊。目前，生物部件的數(shù)量和質(zhì)量都達(dá)不到合成生物學(xué)所期望的要求。部件的開發(fā)存在一些問題。如此龐大的部件庫需要對每個(gè)部件進(jìn)行恰當(dāng)?shù)拿?，這一點(diǎn)通過嚴(yán)格統(tǒng)一

16、規(guī)范去實(shí)現(xiàn)并不難。生物部件之間的連接之前也是一個(gè)大問題，往往通過復(fù)雜的酶切位點(diǎn)的設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)，但隨著一些新的組裝手段的出現(xiàn)，這變得很容易。比較難以解決的問題是標(biāo)準(zhǔn)定量機(jī)制，雖然已經(jīng)有了pops（rna polymerase per second）、rips（ribosonmal initiations per secon）的概念，但是這只是具有一定量化作用的抽象概念，合成生物學(xué)基因部件定量的標(biāo)準(zhǔn)化還遠(yuǎn)不及模塊本身的進(jìn)程那么快速普遍，許多研究者正在尋找更加通用、更加直觀的衡量方法和更直接的測量手段。精品.參考文獻(xiàn)1.molecular biology of the gene sixth editi

17、on2.合成生物學(xué)導(dǎo)論 宋凱編著3. perspectives on the rna polymerase ii core promoter biochemical society transactions, 2006, 34(pt 6): 1047-1050.4. seo s w, yang j, min b e, et al. synthetic biology: tools to design microbes for the production of chemicals and fuelsj. biotechnology advances, 2013, 31(6): 811-817.5.趙文超, 薛永常, 王雪霞. 核糖開關(guān)一種基因表達(dá)調(diào)控元件j. 生命的化學(xué), 2009 (1): 56-59.6.趙謹(jǐn), 楊克恭, 張學(xué). 一種新發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制核糖開關(guān)j. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2005, 21(2): 151-157.7.