動(dòng)物病毒滅活驗(yàn)證報(bào)告教材

1、病毒滅活驗(yàn)證報(bào)告文件編號(hào)：編 制：審 核：批 準(zhǔn)：日 期：1、目的：確認(rèn)病毒滅活參數(shù)的有效性。2、范圍：原料。3、驗(yàn)證依據(jù)：血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原 貝!I4、驗(yàn)證項(xiàng)目：在工藝過(guò)程中病毒滴定驗(yàn)證結(jié)果：病毒檢驗(yàn)5、驗(yàn)證結(jié)論：病毒滅活參數(shù)有效。1. 目的：所有用于醫(yī)療器械生產(chǎn)的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，為驗(yàn)證 “”的生物原材料-種豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒病毒的感染情況，特進(jìn)行 下述實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證確保主物原材料的安全性。驗(yàn)證依據(jù)：血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則2. 范圍:適用于本公司產(chǎn)品。3 職責(zé)：3.1技術(shù)部負(fù)責(zé)對(duì)病毒滅活驗(yàn)證的組織與實(shí)施。3. 2檢測(cè)中心負(fù)

2、責(zé)產(chǎn)品的驗(yàn)收及計(jì)量、檢驗(yàn)器具的檢定。3. 3生產(chǎn)部負(fù)責(zé)協(xié)助驗(yàn)證工作的實(shí)施。3. 4質(zhì)量部負(fù)責(zé)驗(yàn)證檔案的存檔。3. 5驗(yàn)證小組成員：3. 5. 1人員姓名部門(mén)職責(zé)管理者代表批準(zhǔn)方案、批準(zhǔn)報(bào)告；技術(shù)部長(zhǎng)負(fù)責(zé)制定驗(yàn)證方案和形成報(bào)告；生產(chǎn)部長(zhǎng)負(fù)責(zé)試驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備；質(zhì)量部長(zhǎng)負(fù)責(zé)計(jì)量器具的確認(rèn)；負(fù)責(zé)對(duì)產(chǎn)品性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，并提供檢測(cè)報(bào)告；3. 5. 2時(shí)間安排2014年9月10日開(kāi)始4. 程序：4.1 -一”生物原材料的病毒污染驗(yàn)證文獻(xiàn)綜述根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果，豬的病毒包括豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬瘟、圓環(huán)病毒、 口蹄疫、水泡、乙腦等病毒，其中豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒可感染人類(lèi)。以下按 豬源性病毒的來(lái)源、種類(lèi)及分布

3、；理化特性；檢測(cè)方法的次序?qū)Ω鞑》质鋈缦拢?附表1 豬源性病毒的特征病毒名稱(chēng)病毒的分類(lèi)核酸類(lèi)型囊膜病毒顆粒大小(nm)豬細(xì)小病毒 B19DNA無(wú)20偽狂犬病毒 HBVDNA有45附表2 豬源性病毒的理化性質(zhì)病毒名稱(chēng)溫度耐受性化學(xué)物質(zhì)敬感性豬細(xì)小病毒可耐70C能抵抗脂溶劑、酸、甲醛蒸汽和 紫外線，對(duì)漂口粉或氫氧化鈉敬 感，具有良好的血凝活性。偽狂犬病毒在37C下的半病毒在pH49之間保持穩(wěn)定。衰期為7h, 8C5 %石炭酸經(jīng)2min滅活，但0.5 %可存活46天，石炭酸處理32天后仍具有感染而在25 C干性。對(duì)乙醍、氯仿等脂溶劑以及草、樹(shù)枝、食福爾馬林和紫外線照射敬感。物上可存活1030天。附表

4、3豬源性病毒的檢測(cè)方法病毒名稱(chēng)血清抗體檢測(cè)方法病毒抗原檢測(cè)組織樣品方法豬細(xì)小病毒血凝抑制新鮮臟器間接免疫熒光技術(shù)偽狂犬病毒中和試驗(yàn)患病動(dòng)物的病料如腦或扁桃體的壓片或冰凍切片直接免疫熒光技術(shù)參考文獻(xiàn)1、豬細(xì)小病毒病及其防制一丁壯畜禽流行病防治叢書(shū) 金盾出版社2、冼瓊珍;黃良宗;彭啟明;王淑敏;顧萬(wàn)軍;豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒二聯(lián)PCR 診斷方法的建立A;中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)成立20周年慶典暨第十次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（上）C;2003年3、周泰沖;豬偽狂犬病毒對(duì)人的感染性問(wèn)題（綜述）J;獸醫(yī)藥品通訊;1986年03 期4. 2試驗(yàn)材料試驗(yàn)指示病毒為水皰性口炎病毒、偽狂犬病毒、脊髓灰質(zhì)炎病

5、毒和豬細(xì)小病毒。 培養(yǎng)病毒用細(xì)胞株為Ver。和pk- 15細(xì)胞（由中國(guó)藥品生物制品檢定所引 入），培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的M E M o實(shí)驗(yàn)用膠原貼敷料樣品共3批 次，為有效期內(nèi)產(chǎn)品；抗熒光抗體購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。4. 3試驗(yàn)方法：4. 3. 1細(xì)胞毒性測(cè)定，用2 m o 1 / L氫氧化鈉溶液把酸性液態(tài)膠原p H調(diào)至 中性，將pH3. 0的酸性溶液和中性溶液進(jìn)行倍比稀釋后加入到細(xì)胞中，用 M T T染色法測(cè)定其對(duì)細(xì)胞的毒性作用。4. 3.2酸性酶解溶液滅活病毒工藝 取定量的酸性液態(tài)膠原，按9： 1的 比例分別加入P R V、V S V、P V 1和P P V指示病毒，混勻后立 即取部分

6、樣品用2m o 1 / L氫氧化鈉溶液進(jìn)行中和，根據(jù)細(xì)胞毒性測(cè) 定結(jié)果選擇樣品稀釋度作為病毒滅活的起始病毒滴度。其余樣品分別于0 . 5、 2、6、24、48、72h取樣測(cè)病毒殘留滴度，計(jì)算病毒滅活對(duì)數(shù)值（L g T C I D 50 / m 1 ）。4. 3.3 60Co- Y射線輻照滅活病毒工藝 取定量的液態(tài)膠原蛋白，按9: 1的比例分別加入P R V、V S V、P V 1和P P V指示病毒，混勻后先取 出部分樣品作為液體對(duì)照，并測(cè)定起始病毒滴度。剩余樣品分裝成5ml/瓶 進(jìn)行冷凍干燥，取出2瓶?jī)龈善纷鳛閷?duì)照。將冷凍干燥的瓶裝膠原蛋口經(jīng) 10-15 k G y劑量的電子束射線輻照滅活病

7、毒處理（紹興華能電子加速器有限 公司）。輻照后的樣品溶解后測(cè)病毒殘留滴度，對(duì)照樣品則根據(jù)細(xì)胞毒性測(cè)定 結(jié)果選擇樣品稀釋度作為病毒滅活的起始病毒滴度，計(jì)算病毒滅活對(duì)數(shù)值。4. 3.4 存活病毒滴度測(cè)定 采用微量細(xì)胞病變法。試驗(yàn)樣品經(jīng)1 0倍系列 稀釋后加入已接種細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度做8孔重復(fù)。將培養(yǎng) 板置3VC二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)72 h （接種P P V的P K-15培養(yǎng)1 20h）, 在光鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）,根據(jù)K a r b e r氏法計(jì) 算病毒滴度。4. 3. 5免疫熒光染色法檢測(cè)P P V 將P P V接種于P K- 15細(xì)胞中，培 養(yǎng)120 h后，用抗P P V

8、熒光抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行直接免疫熒光抗體試驗(yàn)，按照 抗體說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。4. 3.6 細(xì)胞盲傳 病毒滅活后的樣品均以高濃度加入細(xì)胞中做細(xì)胞盲傳3 代培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變。在細(xì)胞盲傳3代的全過(guò)程中，任何時(shí)段 出現(xiàn)細(xì)胞病變均視為陽(yáng)性（+ ）,說(shuō)明病毒未被完全滅活；未出現(xiàn)細(xì)胞病變視 為陰性（-），說(shuō)明樣品中病毒已被完全滅活。4、4效果的判定判斷病毒去除/滅活的有效性須綜合考慮，不能僅以病毒去除/滅活的量來(lái)確 定。在確定有效之前，必須考慮如下因素，審慎評(píng)價(jià)每次驗(yàn)證結(jié)果。4.4.1.驗(yàn)證試驗(yàn)所選擇的病毒是否適宜，病毒驗(yàn)證的設(shè)訃是否合理。4.42病毒降低量（loglO） 4 logs,表示該步驟去除/

9、滅活病毒有效。如因檢測(cè) 方法造成病毒降低量4 logs時(shí)，應(yīng)盲傳三代，如無(wú)病毒檢出，可認(rèn)定是有效的滅活病毒 方法。4.4.3. 病毒滅活動(dòng)力學(xué)可更好的顯示病毒滅活的效果。病毒滅活通常不是簡(jiǎn)單 的一級(jí)反應(yīng)。往往是起始反應(yīng)速率快，其后變慢。如果病毒滅活速率隨時(shí)間明顯 降低，表示該方法可能無(wú)效，或者殘留的指示病毒對(duì)該滅活方法有抵抗力，說(shuō)明 該步病毒滅活方法無(wú)效。4.4.4. 病毒實(shí)際滴度為基礎(chǔ)病毒，指示病毒與樣品1:9的比例混勻后零點(diǎn)取樣的 病毒滴度，通過(guò)與經(jīng)去除/滅活病毒后的測(cè)定的實(shí)際病毒殘留量的比較，作為該 病毒去除/滅活方法（步驟）實(shí)際的滅活病毒的量。5. 驗(yàn)證要求5. 1達(dá)到病毒滅活的有效性

10、。5. 2得出病毒滅活速率和滅活曲線。5. 3確定預(yù)定去除/滅活病毒效果的參數(shù)及允許變化的幅度。5. 4確定指示病毒滴度。5. 5加入的病毒與待驗(yàn)證樣品體積比不高于1 : 9o5. 6驗(yàn)證過(guò)程中每步取出的樣品直接進(jìn)行病毒滴定。6. 工藝參數(shù)的確定6.1對(duì)確定的參數(shù)進(jìn)行試模。6. 2確認(rèn)的工藝參數(shù)及相關(guān)文件山技術(shù)部匯總存檔。7. 記錄7.1記錄歸檔質(zhì)量管理部。病毒滅活驗(yàn)證最終報(bào)告1、目的：所有用于醫(yī)療器械生產(chǎn)的生物性原材料等都有受到病毒污染的可能性，為驗(yàn)證”的生物原材料-種豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒病毒的感染情況，特進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證確保生物原材料的安全性。驗(yàn)證依據(jù)：血液制品去除/滅活病毒技術(shù)方法及

11、驗(yàn)證指導(dǎo)原則2、范圍：適用于本公司產(chǎn)品。3、試驗(yàn)結(jié)果如下：3.1酸性酶解洛液工藝滅活效果接種在膠原蛋口中病毒經(jīng)酸性酶解溶液處理2h以上，連續(xù)3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)V SV、PRV、PV I和PPV的 滅活對(duì)數(shù)值分別為5.54、5.71、6.30和5.13（表1）。處理后的樣品經(jīng) 細(xì)胞盲傳3代培養(yǎng)，均未出現(xiàn)細(xì)胞病變。結(jié)果顯示，酸性酶解溶液對(duì)膠原蛋 口中的病毒具有良好的滅活效果。表1酸性匪解溶液對(duì)膠原蛋白中的病毒滅活效果（匚3）組別處理吋何（h）VSVPRVIVPN對(duì)照組05. 04+Q 195.21ft 145. 80 二 Q 144.630.13處理組0.5Q 17+Q 19-Q50. 34 二 Q 360.55+0.142W-Q5-Q5W-Q5一Q 54-Q5-Q5W-Q5-0.56-Q5-0 5-Q5-Q524-Q5-0 5-Q5-Q548-(15-Q5-Q5-0.572一05-Q5-Q56.00和5.00 （表2）。滅活后的樣品經(jīng)細(xì)胞盲傳3代均未見(jiàn)細(xì)胞病變出現(xiàn)。耒2戕翩朋屣葩斛購(gòu)幀堿果Ml旦里 劑G