牙髓間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)

1、牙髓間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)I 目的： 建立牙髓間充質(zhì)干細胞制品生產(chǎn)規(guī)程。II 范圍： 適用于牙髓間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)； 適用于技術部和各中心技術組 的所有技術人員。III 職責：1. 生產(chǎn)主管負責本制度的執(zhí)行和監(jiān)督；2. 技術組的所有技術人員要嚴格按照本流程的要求進行操作；3. 監(jiān)督員負責全程監(jiān)督，并即時按要求填寫牙髓間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)記錄和 生產(chǎn)試劑耗材記錄表 。附表 1牙髓/骨髓/ 脂肪/胎盤/臍帶間充質(zhì)干細胞生產(chǎn)記錄附表 2 生產(chǎn)試劑耗材記錄表IV 規(guī)程：一、牙髓間充質(zhì)干細胞原代操作消化法：1. 儀器耗材1) 10ml 移液管2) 培養(yǎng)皿3) 50ml 離心管4) 100 m 篩網(wǎng)5) T75 培

2、養(yǎng)瓶6) 15ml 離心管2. 試劑1）生理鹽水2）培養(yǎng)基3）膠原酶3. 酶消化法操作流程3.1 將浸在含 1%雙抗的生理鹽水中的牙齒取出， 吸取運輸液 4ml 交給質(zhì)檢，并 填寫樣本取樣單， 牙齒置于 75%酒精中浸泡 30min；3.2 取出牙齒在含 10ml 生理鹽水的培養(yǎng)皿中清洗 2-3 遍，用止血鉗固定牙冠， 持骨鉗夾碎牙根部， 暴露出牙髓， 用鑷子取出牙髓并放入含有適量生理鹽水的培 養(yǎng)皿中；3.3 用剪刀將牙髓組織塊剪碎成 1mm3 ，轉(zhuǎn)移到 50ml 離心管中，加入生理鹽水至 30ml, 再加入 10ml 0.2% 膠原酶；3.4置于37C恒溫搖床，180rmp消化30min ;

3、3.5用100叩濾網(wǎng)過濾；3.6 1200 rpm離心10min，吸取洗滌液4ml交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單：附表 3 樣本取樣單3.7棄剩余上清，調(diào)整細胞濃度為107/ml,置于75亦培養(yǎng)瓶中,放入37C, CO 培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。4. 組織塊法操作流程：4.1 將浸在含 1%雙抗的生理鹽水中的牙齒取出，吸取運輸液 4ml 交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單 ， 牙齒置于 75%酒精中浸泡 30min；4.2取出牙齒在含10ml生理鹽水的培養(yǎng)皿中清洗2-3遍，用止血鉗固定牙冠， 持骨鉗夾碎牙根部， 暴露出牙髓， 用鑷子取出牙髓并放入含有適量生理鹽水的培養(yǎng)皿中；4.3 用剪刀將牙髓組織塊剪碎成 1mm

4、3 ，將組織塊均勻鋪到 T25 培養(yǎng)瓶(用適量FBS潤濕瓶底)瓶底；4.6 倒置培養(yǎng)瓶，并加入 5ml 培 養(yǎng)基， 放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4.7 12-24h 后，將培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，將牙髓組織塊浸入工作液中二、牙髓間充質(zhì)干細胞換液1. 耗材1) 10ml 移液管2) 15ml 離心管2. 試劑培養(yǎng)基3. 操作流程3.1 鏡下觀察狀態(tài)細胞；,并補充新的3.2 吸取上清液 4ml 交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單 ；3.3 吸取上清液于 50ml 離心管中留作精華液 (原代培養(yǎng)上清不留)培養(yǎng)基；3.4觀察細胞并將其置于37C, 5%CO孵箱中培養(yǎng)。、牙髓間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)1. 耗材1) 10ml 移液管2

5、) 50ml 離心管3）培養(yǎng)瓶4）15ml 離心管2. 試劑1）生理鹽水2）胰酶3）血清4）培養(yǎng)基3. 操作流程3.1 顯微鏡觀察，觀察培養(yǎng)瓶中的細胞密度到達80%90%，可進行傳代培養(yǎng)；3.2 吸取上清液于 50ml 離心管中留作精華液（原代培養(yǎng)上清不留） ，T75 培養(yǎng)瓶 中加入 10ml 生理鹽水洗滌貼壁細胞；3.3 吸取洗滌液 4ml 交給質(zhì)檢，并填寫樣本取樣單 ；3.4 倒出剩余洗滌液 （生理鹽水），再加入 10ml 生理鹽水 +0.05%胰酶，進行細胞 消化，消化的第一瓶鏡下觀察，細胞收縮即可加入等體積血清終止消化；3.5將細胞收集到50ml離心管中，1200rpm, 6min,棄

6、上清，重懸，加入培養(yǎng)基， 然后按照 1:2 或 1:3 進行傳代。四、牙髓間充質(zhì)干細胞成品制備1. 耗材1 ）10ml 移液管2）50ml 離心管3）15ml 離心管4）西林瓶 / 輸血袋2. 試劑1）生理鹽水2）胰酶3）血清4）干細胞保存液3. 操作流程3.1 待細胞擴增總數(shù)達所需細胞數(shù)量后，吸取上清液于 50ml 離心管中留作精 華液（原代培養(yǎng)上清不留）,T75培養(yǎng)瓶中加入10ml生理鹽水洗滌一遍；3.2 加入 10ml 生理鹽水 +0.05%胰酶，進行細胞消化，消化的第一瓶鏡下觀察， 細胞收縮即可加入等體積血清終止消化；3.3 將細胞收集到 50ml 離心管中， 1200rpm， 10m

7、in；3.4棄上清，細胞沉淀用30ml生理鹽水洗滌二次，1200rpm,室溫離心10min。3.5 取第二次洗滌離心后的上清 20ml 交給給質(zhì)檢部分，并填寫樣本取樣單 ；3.6 用干細胞保存液 / 生理鹽水重懸細胞，轉(zhuǎn)入專用的無菌西林瓶 /生理鹽水中， 封口，貼標簽，放置4C保存。3.7 完成初包裝后，操作員立即將成品送交包裝部門。五、牙髓間充質(zhì)干細胞的凍存1. 耗材1 ） 10ml 移液管2）50ml 離心管3）15ml 離心管4）凍存管2. 試劑1）生理鹽水2）胰酶3）血清4）凍存液3. 操作流程3.1 將制備好的 MSC于1200rpm室溫，離心10min。3.2 棄去上清， 將細胞懸

8、浮于適量凍存液中， 使細胞濃度在 107個細胞 /毫升， 置于低溫無菌凍存管中。3.3 將細胞交給庫管員經(jīng)過程控降溫后于液氮中冷凍保存，并填寫凍存樣 品交接單。附表 4 凍存樣品交接單六、牙髓干細胞的復蘇1. 耗材1）10ml 移液管2）50ml離心管3）15ml 離心管4）培養(yǎng)瓶2. 試劑1 ）生理鹽水2）培養(yǎng)液3. 操作流程3.1將液氮中的細胞取出于 37C水浴中迅速融化；3.2 將細胞置于裝有 1015倍ml生理鹽水無菌離心管中，1200rpm離心10min ;3.3 棄上清，加入 30ml 生理鹽水洗滌細胞兩次；3.4 取第一次洗滌離心后的上清 20ml 交給給質(zhì)檢部分， 并填寫樣本取

9、樣單；3.5 棄上清，重懸細胞，在細胞懸液中加入培養(yǎng)液，吹勻；3.6 將單細胞懸液種植于細胞培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。備注：1. 每次進行操作前，需將萬級車間和百級實驗臺照射紫外線 30min,風機開啟后 10-15min 后方可進入實驗場所進行操作；2. 進入GMP車間后，實驗人員先進入物品存放間取已經(jīng)表面消毒過的垃圾桶、 廢液缸、實驗耗材等進入相應操作間， 并從配液間取出相關使用試劑放于實驗操 作臺；3. 細胞的取出與放回：開啟培養(yǎng)箱前，需 75%擦拭手掌后方可取放細胞；4. 操作細胞過程，手臂盡量在實驗臺進行操作，不要將手臂反復拿出實驗臺， 如拿出手臂再進入需重新噴灑酒精，方可進入；5. 鏡下觀察，看是否有雜菌的感染，若有雜菌感染，立即封口后進行清理，不 做留用。6. 清場：擦拭操作臺，用酒精棉球擦拭每一個有操作接觸到過的地方；將廢液 缸和垃圾桶噴灑 75%酒精后放置于污物出口； 實驗臺內(nèi)未用完的耗材需全部放置 于不銹鋼推車上，臺內(nèi)不留