基于單克隆抗體的多元弧菌免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究

1、基于單克隆抗體的多元弧菌免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究基于單克隆抗體的多元弧菌免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研究 2 contents 抗抗ompw多克隆抗體的制備與特性分析多克隆抗體的制備與特性分析 4 研究背景及立論依據(jù)研究背景及立論依據(jù)1 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 2 副溶血弧菌副溶血弧菌ompw基因的克隆與表達(dá)基因的克隆與表達(dá) 3 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 5 多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立6 結(jié)論結(jié)論 7 3 第一章第一章 研究背景及立論依據(jù)研究背景及立論依據(jù) 1、形態(tài)：弧狀或短桿狀，有

2、鞭毛、形態(tài)：弧狀或短桿狀，有鞭毛 2、染色性：革蘭氏陰性菌、染色性：革蘭氏陰性菌 3、培養(yǎng)特性：營(yíng)養(yǎng)要求不高，嗜鹽，在、培養(yǎng)特性：營(yíng)養(yǎng)要求不高，嗜鹽，在 含有含有3.5%的的nacl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好， ph 7.0-9.5，tcbs培養(yǎng)基上易生長(zhǎng)。培養(yǎng)基上易生長(zhǎng)。 4、生化反應(yīng)：氧化酶陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖、生化反應(yīng)：氧化酶陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖、 麥芽糖，不發(fā)酵乳糖、蔗糖；吲哚、賴麥芽糖，不發(fā)酵乳糖、蔗糖；吲哚、賴 氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和硝酸鹽還氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶和硝酸鹽還 原試驗(yàn)均陽(yáng)性。原試驗(yàn)均陽(yáng)性。 1.1 1.1 弧菌生物學(xué)性狀弧菌生物學(xué)性狀 4 第一章第一章 研究背景

3、及立論依據(jù)研究背景及立論依據(jù) 1.2 1.2 研究背景研究背景及立論依據(jù)及立論依據(jù) 弧菌弧菌哈維氏弧菌哈維氏弧菌人畜共患病原菌人畜共患病原菌 引起魚體表出血性潰瘍，食欲引起魚體表出血性潰瘍，食欲 不振，嚴(yán)重時(shí)鱗片脫落，爛鰭，不振，嚴(yán)重時(shí)鱗片脫落，爛鰭， 眼內(nèi)出血或變渾濁，肝腎等內(nèi)眼內(nèi)出血或變渾濁，肝腎等內(nèi) 臟出血，腸道發(fā)炎充血。也可臟出血，腸道發(fā)炎充血。也可 感染蝦和貝類。感染蝦和貝類。 鰻弧菌鰻弧菌 溶藻弧菌溶藻弧菌 創(chuàng)傷弧菌創(chuàng)傷弧菌 副溶血弧菌副溶血弧菌 引起人類胃腸炎、傷引起人類胃腸炎、傷 口感染和原發(fā)性敗血口感染和原發(fā)性敗血 癥。癥。 鑒于國(guó)內(nèi)外對(duì)多種病原弧菌的重視，探討建立快速同時(shí)檢

4、測(cè)多種病原弧鑒于國(guó)內(nèi)外對(duì)多種病原弧菌的重視，探討建立快速同時(shí)檢測(cè)多種病原弧 菌的方法菌的方法, ,在海水水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的調(diào)查和防治、水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)和保護(hù)在海水水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的調(diào)查和防治、水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量檢驗(yàn)和保護(hù) 公眾健康等方面都具有十分重要的意義。公眾健康等方面都具有十分重要的意義。 5 第一章第一章 研究背景及立論依據(jù)研究背景及立論依據(jù) 篩選、克隆、表達(dá)和純篩選、克隆、表達(dá)和純 化制備多元弧菌高同源化制備多元弧菌高同源 性外膜蛋白性外膜蛋白 制備抗制備抗r-omp多克隆抗多克隆抗 體，并進(jìn)行特性分析體，并進(jìn)行特性分析 取其脾細(xì)胞與骨髓瘤取其脾細(xì)胞與骨髓瘤sp2/0細(xì)細(xì) 胞，進(jìn)行細(xì)胞融合胞，進(jìn)

5、行細(xì)胞融合 篩選分泌抗多元弧菌單克隆抗體篩選分泌抗多元弧菌單克隆抗體 的雜交瘤細(xì)胞株的雜交瘤細(xì)胞株，體內(nèi)法體內(nèi)法 生產(chǎn)單抗生產(chǎn)單抗 建立基于單抗的多元建立基于單抗的多元 弧菌免疫學(xué)檢測(cè)方法弧菌免疫學(xué)檢測(cè)方法 免疫免疫balb/c小鼠小鼠 1.3 1.3 技術(shù)路線技術(shù)路線 6 第二章第二章 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 外膜是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁特有的結(jié)構(gòu)，它位于細(xì)胞壁的最外層，厚外膜是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁特有的結(jié)構(gòu)，它位于細(xì)胞壁的最外層，厚810 nm， 約占細(xì)胞壁干重的約占細(xì)胞壁干重的80%，通常由磷脂、若干種外膜蛋白，通常由磷脂、若干種外膜蛋白(om

6、p)和脂多糖和脂多糖(lps)組成。組成。 2.1 2.1 革蘭氏陰性菌外膜的結(jié)構(gòu)革蘭氏陰性菌外膜的結(jié)構(gòu) 7 第二章第二章 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 2.2 2.2 多元弧菌多元弧菌ompk蛋白質(zhì)序列比對(duì)蛋白質(zhì)序列比對(duì) 對(duì)ncbi protein database中抽 取的3株溶藻弧菌（va）、3株副溶 血弧菌（vp）、3株哈維氏弧菌 （vh）和3株創(chuàng)傷弧菌（vv）的 ompk蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多重序列比對(duì) 分析，在不同弧菌種內(nèi)不同弧菌種內(nèi)ompk蛋白質(zhì) 序列的平均一致性（identity）分別 為：溶藻弧菌85%，副溶血弧菌 78%，哈維氏弧菌78

7、%，創(chuàng)傷弧菌 85.3%。 不同弧菌種間：不同弧菌種間：溶藻弧菌與副溶 血弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌 ompk蛋白質(zhì)序列的平均一致性分別 為76.5%、81.6%、79.8%；副溶血 弧菌與哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌ompk 蛋白質(zhì)序列的平均一致性78.1%、 72.5%；哈維氏弧菌與創(chuàng)傷弧菌 ompk蛋白質(zhì)序列的平均一致性 79.9%。 圖圖2- 1 四種弧菌四種弧菌ompk蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖 8 2.3 2.3 多元弧菌多元弧菌ompu蛋白質(zhì)序列比對(duì)蛋白質(zhì)序列比對(duì) 第二章第二章 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 通過(guò)對(duì)ncbi protein

8、 database 中抽取的3株溶藻弧菌（va）、3株 副溶血弧菌（vp）、2株哈維氏弧菌 （vh）和3株創(chuàng)傷弧菌（vv）的 ompu蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在 不同弧菌種內(nèi)不同弧菌種內(nèi)ompu蛋白質(zhì)序列的平 均一致性分別為：溶藻弧菌70.3%， 副溶血弧菌96.5%，哈維氏弧菌85%， 創(chuàng)傷弧菌89.3%。 不同弧菌種間：不同弧菌種間：溶藻弧菌與副溶 血弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌 ompu蛋白質(zhì)序列的平均一致性分別 為75.7%、71.7%、67%；副溶血弧 菌與哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌ompu蛋 白質(zhì)序列的平均一致性分別為82%、 75.4%；哈維氏弧菌與創(chuàng)傷弧菌 ompu蛋白質(zhì)序列的平均一致

9、性為 70.8%。 圖圖2- 2 四種弧菌四種弧菌ompu蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖 9 2.4 2.4 多元弧菌多元弧菌ompw蛋白質(zhì)序列比對(duì)蛋白質(zhì)序列比對(duì) 第二章第二章 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 對(duì)ncbi protein database中抽取的3株溶藻弧菌（va）、3株副溶血弧菌（vp）、3株哈維氏弧菌 （vh）的ompw蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，不同弧菌種內(nèi)不同弧菌種內(nèi)ompw蛋白質(zhì)序列的平均一致性分別為：溶藻 弧菌96.0%，副溶血弧菌100%，哈維氏弧菌95.3%。 不同種弧菌種間不同種弧菌種間：溶藻弧菌與副溶血弧菌、哈維氏弧菌

10、ompw蛋白質(zhì)序列的平均一致性為93%、 90.1%；副溶血弧菌與哈維氏弧菌ompw蛋白質(zhì)序列平均一致性為89%。 圖圖2- 3 三種弧菌三種弧菌ompw蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖 10 ompkompuompw 種類 溶藻 弧菌 副溶血 弧菌 哈維氏 弧菌 溶藻 弧菌 副溶血 弧菌 哈維氏 弧菌 溶藻 弧菌 副溶血 弧菌 哈維氏 弧菌 溶藻 弧菌 8576.581.670.375.771.7969390.1 副溶血 弧菌 7878.196.58210089 哈維氏 弧菌 788595.3 2.5 2.5 三種蛋白在多元弧菌種內(nèi)、種間的平均一致性比較（%） 第二章第二章 多元弧菌三種外膜

11、蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 綜合比較多種弧菌種內(nèi)、種間的三種外膜蛋白o(hù)mpk、ompu和ompw的序列一致性，ompw蛋白質(zhì)在 溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌種內(nèi)的序列一致性高于其他兩種外膜蛋白；而在不同弧菌種間，溶 藻弧菌與副溶血弧菌、哈維氏弧菌ompw蛋白質(zhì)序列的平均一致性為93%、90.1%；副溶血弧菌與哈維氏 弧菌ompw蛋白質(zhì)序列平均一致性為89%，均高于ompk和ompu在該三種弧菌種間的一致性。以上分析 結(jié)果表明，ompw是溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈維氏弧菌三種弧菌的高度保守外膜蛋白，是作為三種弧菌 的共同菌體表面抗原共同菌體表面抗原的較優(yōu)選擇。 1

12、1 菌株 與vp rimd 2210633 ompw蛋白質(zhì)序列的一致性 英文名稱中文名稱 1escherichia coli iai39大腸桿菌57% 2shigella dysenteriae sd197痢疾志賀菌57% 3citrobacter koseri atcc baa-895柯氏檸檬酸桿菌56% 4shewanella putrefaciens 200腐敗希瓦氏菌56% 5shewanella halifaxensis haw-eb4希瓦氏菌(halifaxensis)56% 7citrobacter youngae atcc 29220楊氏檸檬酸桿菌55% 8shigella s

13、onnei ss046索氏志賀菌55% 9citrobacter rodentium icc168檸檬酸桿菌(rodentium)53% 10klebsiella pneumoniae 342肺炎克雷伯菌53% 2.6 2.6 與vp rimd 2210633的ompw蛋白質(zhì)序列的一致性較高的非弧菌 第二章第二章 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 在ncbi網(wǎng)站中，使用protein blast程序，在ncbi nr database中搜索與副溶血弧 菌標(biāo)準(zhǔn)株vibrio parahaemolyticus rimd 221063的ompw蛋白質(zhì)序列的一致

14、性較高 的非弧菌菌株。 12 第二章第二章 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 圖2- 4 副溶血弧菌與大腸桿菌的ompw蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖 query:v. parahaemolyticus rimd 221063的ompw蛋白質(zhì)序列；sbjct: e.coli iai39的ompw蛋白質(zhì)序列 圖2- 5 副溶血弧菌與痢疾志賀菌的ompw蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖 query: v.parahaemolyticus rimd 221063的ompw蛋白質(zhì)序列；sbjct: c. shigella dysenteriae sd197的ompw蛋白質(zhì)序列 圖2- 6 副

15、溶血弧菌與嗜水氣單胞菌的ompw蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖 query: v.parahaemolyticus rimd 221063的ompw蛋白質(zhì)序列； sbjct: aeromonas hydrophila subsp. hydrophila atcc 7966的ompw蛋白質(zhì)序列； 圖2- 7 副溶血弧菌與syringae假單胞菌的ompw蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖 query: v.parahaemolyticus rimd 221063的ompw蛋白質(zhì)序列； sbjct: pseudomonas syringae pv. tomato ncppb 1108的ompw蛋白質(zhì)序列 13 多元弧菌種內(nèi)和種間

16、多元弧菌種內(nèi)和種間 ompw蛋白質(zhì)序列的蛋白質(zhì)序列的 高度保守性高度保守性 弧菌和非弧菌弧菌和非弧菌ompw 蛋白質(zhì)序列的較大差蛋白質(zhì)序列的較大差 異性異性 單克隆抗體本身具有單克隆抗體本身具有 的識(shí)別單一抗原決定的識(shí)別單一抗原決定 簇、特異性強(qiáng)的優(yōu)良簇、特異性強(qiáng)的優(yōu)良 特性特性 為后續(xù)工作篩選到可特異性識(shí)為后續(xù)工作篩選到可特異性識(shí) 別多元弧菌、而與非弧菌無(wú)交別多元弧菌、而與非弧菌無(wú)交 叉反應(yīng)的抗叉反應(yīng)的抗ompw單克隆抗體單克隆抗體 建立了理論基礎(chǔ)建立了理論基礎(chǔ) 第二章第二章 多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析多元弧菌三種外膜蛋白的生物信息學(xué)分析 14 第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌o

17、mpw基因的克隆與表達(dá)基因的克隆與表達(dá) 15 第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌ompw基因的克隆與表達(dá)基因的克隆與表達(dá) 3.2 ompw基因的克隆基因的克隆 圖圖3- 1 副溶血弧菌目的基因副溶血弧菌目的基因ompw的的pcr產(chǎn)物電泳圖產(chǎn)物電泳圖 1.dna marker；2,3,4. vp 1.1997、vp 86和vp 87的 ompw基因擴(kuò)增產(chǎn)物. 以提取的副溶血弧菌vp 1.1997，vp 86，vp 87基因組 dna為模板，分別擴(kuò)增ompw 成熟蛋白的編碼基因序列。將 pcr產(chǎn)物分別上樣1%瓊脂糖凝 膠，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系 統(tǒng)中觀察擴(kuò)增后的產(chǎn)物，結(jié)果顯 示三株菌株對(duì)應(yīng)的泳道

18、均出現(xiàn)了 約600bp的特異性擴(kuò)增條帶。 16 第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌ompw基因的克隆與表達(dá)基因的克隆與表達(dá) 3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 圖圖3- 2 重組質(zhì)粒的重組質(zhì)粒的pcr產(chǎn)物及雙酶切產(chǎn)物電泳圖產(chǎn)物及雙酶切產(chǎn)物電泳圖 1.dna marker; 2.重組pet28a-ompw質(zhì)粒的pcr產(chǎn)物； 3.重組pet28a-ompw質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；4. pet28a質(zhì) 粒雙酶切產(chǎn)物；5.dna marker 3.3.1 重組質(zhì)粒的重組質(zhì)粒的pcr和雙酶切驗(yàn)證和雙酶切驗(yàn)證: 分別雙酶切pet28a載體和pcr產(chǎn) 物，將二者進(jìn)行酶連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化感受態(tài)bl21

19、(de3)。提取重組菌的 質(zhì)粒經(jīng)pcr反應(yīng)后，擴(kuò)增出約600bp 的目的片段。 提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切反應(yīng)后，電 泳圖顯示出現(xiàn)約5500bp和約600bp的 目的片段；pet28a原始質(zhì)粒雙酶切 后，僅出現(xiàn)約5500bp的片段。 上述結(jié)果初步證實(shí)重組質(zhì)粒已構(gòu) 建成功。 17 第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌ompw基因的克隆與表達(dá)基因的克隆與表達(dá) 3.3.2 重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定: 經(jīng)經(jīng)blastn和和blastp比對(duì)，已獲得的副溶血弧菌比對(duì)，已獲得的副溶血弧菌vp 1.1997 ompw基因和基因和ompw蛋白質(zhì)序列與蛋白質(zhì)序列與 已報(bào)道的副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株已報(bào)道的副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)

20、株vp rimd 2210633 ompw基因和基因和ompw蛋白質(zhì)序列一致性分別達(dá)到蛋白質(zhì)序列一致性分別達(dá)到 100%。ompw目的基因的克隆和目的基因的克隆和pet28a-ompw表達(dá)載體的構(gòu)建都已經(jīng)獲得成功。表達(dá)載體的構(gòu)建都已經(jīng)獲得成功。 圖圖3- 3 副溶血弧菌副溶血弧菌vp 1.1997與與vp rimd 2210633 ompw基因序列的比對(duì)圖基因序列的比對(duì)圖 query: vp 1.1997的ompw基因序列；sbjct: v. parahaemolyticus rimd 221063的ompw基因序列 圖圖3- 4 副溶血弧菌副溶血弧菌vp 1.1997與與vp rimd 22

21、10633 ompw成熟蛋成熟蛋 白序列的比對(duì)圖白序列的比對(duì)圖 query: vp 1.1997的ompw成熟蛋白序列；sbjct: v. parahaemolyticus rimd 221063的ompw成熟蛋白序列 18 第三章第三章 副溶血弧菌副溶血弧菌ompw基因的克隆與表達(dá)基因的克隆與表達(dá) 3.4 重組蛋白重組蛋白r-ompw的誘導(dǎo)表達(dá)與純化的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 圖圖3- 5 不同菌體裂解后產(chǎn)物的電泳圖不同菌體裂解后產(chǎn)物的電泳圖 1.蛋白marker; 2.含pet28a原始質(zhì)粒且未經(jīng)iptg誘導(dǎo) 的菌體裂解產(chǎn)物; 3.含pet28a原始質(zhì)粒且經(jīng)iptg誘 導(dǎo)的菌體裂解產(chǎn)物;4.含pet

22、28a-ompw重組質(zhì)粒且未 經(jīng)iptg誘導(dǎo)的菌體裂解產(chǎn)物; 5.含pet28a-ompw重 組質(zhì)粒且經(jīng)iptg誘導(dǎo)的菌體裂解產(chǎn)物. 圖圖3- 6 重組蛋白的表達(dá)形式及純化電泳圖重組蛋白的表達(dá)形式及純化電泳圖 1.protein marker; 2.重組菌裂解液離心后的 沉淀；3. 重組菌裂解液離心后的上清液；4. 純化的重組蛋白 在iptg誘導(dǎo)下， 重組大腸桿菌大 量表達(dá)出預(yù)期分 子量(27kda)的重 組蛋白，重組蛋 白以包涵體的形 式存在。經(jīng)鎳柱 ni-ida親和層析 法純化，重組蛋 白達(dá)到電泳純。 19 第四章第四章 抗抗ompw多克隆抗體的制備與特性分析多克隆抗體的制備與特性分析 4

23、.1 重組蛋白濃度測(cè)定重組蛋白濃度測(cè)定 4.2 小鼠免疫及效價(jià)測(cè)定小鼠免疫及效價(jià)測(cè)定 以1 mg/ml bsa標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液稀釋至不 同濃度，分別加入考馬斯亮藍(lán)染液反應(yīng)。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白bsa的含量與對(duì)應(yīng)a595吸光 度繪制bradford標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方 程為：y=0.045x（r2=0.976）。其中，y為 595 nm處吸光度，x為蛋白含量。經(jīng)透析后， 重組蛋白濃度為0.636 mg/ml。 取純化透析后的重組蛋白，對(duì)balb/c小鼠進(jìn)行免疫。三免后第7天斷尾采血，分離血清。 間接elisa法測(cè)定血清中抗體效價(jià)，包被抗原為甲醛滅活的副溶血弧菌全菌。經(jīng)測(cè)定，三免后 抗體效價(jià)達(dá)到1:5.4

24、104。 抗重組蛋白血清識(shí)別副溶血弧菌全菌，表明重組蛋白r-ompw與天然蛋白o(hù)mpw具有相似的 免疫反應(yīng)性。 圖圖4- 1 bradford標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線 20 第四章第四章 抗抗ompw多克隆抗體的制備與特性分析多克隆抗體的制備與特性分析 圖圖4- 3 抗副溶血弧菌全菌血清與抗副溶血弧菌全菌血清與r-ompw的的 免疫印跡免疫印跡 1.預(yù)染的蛋白marker；2.鼠抗副溶血弧菌血 清與r-ompw反應(yīng). 圖圖4- 2 抗抗r-ompw血清與血清與r-ompw的的 免疫印跡免疫印跡 1.預(yù)染的蛋白marker；2.鼠抗r-ompw 血清與r-ompw反應(yīng). 4.3 免疫印跡試驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)

25、 重組蛋白r-ompw具有良 好的免疫原性 重組蛋白r-ompw與天 然蛋白o(hù)mpw具有相似 的免疫反應(yīng)性 21 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 圖圖5- 1 單克隆抗體的制備過(guò)程單克隆抗體的制備過(guò)程 22 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 5.1 細(xì)胞融合與克隆化細(xì)胞融合與克隆化 圖圖5- 2 雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài) 將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾 細(xì)胞融合后，重懸于hat培養(yǎng)液， 接種于5塊96孔板。約8d后進(jìn)行觀 察，有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的孔數(shù)為 217孔，占45.2%；融合后第10d-

26、12d，使用間接elisa法對(duì)分泌單 克隆抗體(mab)的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行 初篩，包被抗原為滅活的副溶血 弧菌。其中陽(yáng)性融合孔為24孔， 陽(yáng)性率為11.1 %。 選擇a值較大的三株陽(yáng)性細(xì)胞 株通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行克隆化， 直至克隆板陽(yáng)性率達(dá)到100，建 株保種。三株雜交瘤細(xì)胞分別命 名為：s1e6，s4e10，s5c10。 23 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 mab (s1e6)mab (s4e10)mab (s5c10) 效價(jià)1:1101:2701:420 5.2 雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液mab效價(jià)測(cè)定效價(jià)測(cè)定 5.3 mab

27、免疫球蛋白亞類鑒定免疫球蛋白亞類鑒定 igg1igg2aigg2bigg3igm mab (s1e6)+ mab (s4e10)+ mab (s5c10)+ 三株雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清液mab效價(jià)在1:500-1:100之間。 使用間接elisa方法測(cè)定三種雜交瘤細(xì)胞分泌的mab免疫球蛋白亞級(jí) 分類，結(jié)果表明，mab (s1e6)屬igg2b，mab (s4e10)屬igg2a，mab (s5c10)屬igg3。 24 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 5.4 雜交瘤細(xì)胞株的復(fù)篩雜交瘤細(xì)胞株的復(fù)篩 表表5- 3 mab識(shí)別多元弧菌的廣譜性分析識(shí)別多元

28、弧菌的廣譜性分析 序號(hào)菌株mab (s1e6)mab (s4e10)mab (s5c10) 1v.parahaemolyticus 1.1997+ 2v.alginolyticus 1.1587+ 3v.harveyi 1.1593+ 4v.vulnificus 1.1758+ 5v.anguillarum sm+ 雜交瘤細(xì)胞株s4e10分泌的mab對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌有陽(yáng)性反應(yīng)， 與哈維氏弧菌、鰻弧菌呈陰性反應(yīng)；而雜交瘤細(xì)胞株s1e6、s5c10分泌的的mab與 5種不同弧菌均有陽(yáng)性反應(yīng)，所以后續(xù)試驗(yàn)采用雜交瘤細(xì)胞株s1e6和s5c10制備腹 水mab，并進(jìn)行效價(jià)和特異性分析。

29、注：v.parahaemolyticus.為副溶血弧菌，v.alginolyticus.為溶藻弧菌， v.harveyi.為哈維氏弧菌，v.vulnificus.為 創(chuàng)傷弧菌，v.anguillarum為鰻弧菌； 25 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 5.5 腹水腹水mab效價(jià)測(cè)定效價(jià)測(cè)定 表表5- 4 腹水腹水mab效價(jià)效價(jià) mab (s1e6)mab (s5c10) 效價(jià)1:11041:4.6104 分別培養(yǎng)兩株雜交瘤細(xì)胞株s1e6和s5c10至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將balb/c 成年鼠注射1106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。待小鼠腹部明顯膨脹抽取腹水，離 心后收

30、集上層腹水，使用間接elisa方法測(cè)定其抗體效價(jià)。細(xì)胞株 s1e6和s5c10分泌的腹水mab效價(jià)分別達(dá)到1:1104，1:4.6104。 26 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 5.6 腹水腹水mab特異性分析特異性分析 序號(hào)菌株mab (s1e6)mab (s5c10) 1v.parahaemolyticus 1.1997+ 2v.parahaemolyticus 86+ 3v.parahaemolyticus 87+ 4v.alginolyticus 1.1587+ 5v.alginolyticus 1.1607+ 6v.harveyi 1.

31、1593+ 7v.vulnificus 1.1758+ 8v.vulnificus fj03-x2+ 9v.anguillarum sm+ 10v.anguillarum lsv+ 11嗜水氣單胞菌+ 12溫和氣單胞菌+ 13豚鼠氣單胞菌+ 14熒光假單胞菌+ 15大腸桿菌+ 16普通變形桿菌 17痢疾志賀菌+ 18藤黃八疊球菌 19枯草芽孢桿菌 mab(s1e6)不僅與5種弧菌 均有陽(yáng)性反應(yīng)，而且與嗜水氣 單胞菌、溫和氣單胞菌、豚鼠 氣單胞菌、熒光假單胞菌、大 腸桿菌、痢疾志賀菌也有交叉 反應(yīng)。 mab(s5c10)與5種弧菌均有 陽(yáng)性反應(yīng)，與9種非弧菌無(wú)交 叉反應(yīng)，為后續(xù)試驗(yàn)建立基于 單克

32、隆抗體的特異性檢測(cè)多元 弧菌的方法提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 表表5- 5 腹水腹水mab的特異性試驗(yàn)的特異性試驗(yàn) 注：v.parahaemolyticus.為副溶血弧菌，v.alginolyticus.為溶藻弧菌， v.harveyi.為哈維氏弧菌，v.vulnificus.為創(chuàng)傷弧菌，v.anguillarum 為鰻弧菌； 27 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 5.7 雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞mab分泌穩(wěn)定性分泌穩(wěn)定性 表表5- 6 雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞s5c10分泌分泌mab穩(wěn)定性穩(wěn)定性 細(xì)胞來(lái)源s5c10 原代1:420 連續(xù)傳代10代1:410 連續(xù)

33、傳代20代1:370 凍存30d后復(fù)蘇1:330 分別測(cè)定雜交瘤細(xì)胞s5c10擴(kuò)培后的第3天、連續(xù)傳10代、連續(xù) 傳20代、凍存30d后復(fù)蘇的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液抗體效價(jià)。結(jié)果 表明，除剛復(fù)蘇的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力有所下降外，雜交 瘤細(xì)胞株s5c10連續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞上清液的效價(jià)與原代細(xì)胞基本 一致，證明雜交瘤細(xì)胞s5c10具有較穩(wěn)定的分泌抗體的能力。 28 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 圖圖5- 3 mab(s5c10)與重組蛋白的免疫與重組蛋白的免疫 印跡圖印跡圖 1.預(yù)染的蛋白marker；2. mab(s5c10) 與重組蛋白的反應(yīng)

34、; 5.8 腹水腹水mab與與r-ompw的免疫印跡的免疫印跡 將重組蛋白進(jìn)行sds-page后， 電轉(zhuǎn)至pvdf膜，并與腹水 mab(s5c10)和二抗依次反應(yīng)后， 進(jìn)行顯色，見(jiàn)圖5- 3。結(jié)果顯 示，在約27kda處出現(xiàn)了顏色 反應(yīng)，表明雜交瘤細(xì)胞株 s5c10分泌mab可識(shí)別重組蛋 白r-ompw。 29 第五章第五章 抗抗ompw單克隆抗體的制備與特性分析單克隆抗體的制備與特性分析 5.9 腹水腹水mab的純化的純化 圖圖5- 4 純化后純化后mab(s5c10)的電泳圖的電泳圖 1.蛋白marker；2.純化的igg 雜交瘤細(xì)胞株s5c10分泌的 腹水mab經(jīng)rprotein a s

35、epharose 親和層析純化和分離后，進(jìn)行 sds-page分析。結(jié)果顯示， 純化后的單克隆抗體有兩條帶， 一條帶為igg的重鏈，分子量約 55 kda左右，另一條為輕鏈， 分子量約26 kda左右。 30 第六章第六章 多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立 6.1 mab反應(yīng)濃度的優(yōu)化反應(yīng)濃度的優(yōu)化 當(dāng)mab終濃度在2.520g/ml時(shí)，細(xì)胞染色 率隨著抗體濃度的增加而增大，當(dāng)mab濃度增 加到20g/ml時(shí)，細(xì)胞染色率達(dá)到96.8%。mab 增加到40g/ml時(shí)，細(xì)胞染色率增加不顯著。因 此，采用mab終濃度20 g/ml進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 6.2 mab反應(yīng)時(shí)

36、間的優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 當(dāng)mab反應(yīng)時(shí)間在1545min時(shí)，細(xì)胞染色率 隨著染色時(shí)間的增加而增大，當(dāng)染色時(shí)間為45 min時(shí)，細(xì)胞染色率達(dá)到95.7%。在45min75min， 隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞染色率增加不顯著。為 確保反應(yīng)充分，本實(shí)驗(yàn)采用mab的反應(yīng)時(shí)間為 60 min。 在mab的優(yōu)化使用條件下，即取1ml副 溶血弧菌（5105 cells/ml），加入mab 至終濃度20 g/ml，反應(yīng)60 min，洗滌后， 加入過(guò)量二抗反應(yīng)30min，洗滌后，進(jìn)樣 流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞染色率達(dá)到97.1%。 圖圖6- 1 mab反應(yīng)濃度的優(yōu)化反應(yīng)濃度的優(yōu)化 圖圖6- 2 mab反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化反應(yīng)時(shí)

37、間的優(yōu)化 31 第六章第六章 多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立 6.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)弧菌的準(zhǔn)確性與檢出限流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)弧菌的準(zhǔn)確性與檢出限 對(duì)菌體濃度在104107 cells/ml內(nèi)的樣品2樣品5的檢 測(cè)結(jié)果表明，流式細(xì)胞術(shù)與平 皿菌落計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果顯著 相關(guān)(p0.01)，相關(guān)系數(shù) r=0.9920，檢測(cè)值可信度較高。 對(duì)于濃度低于104 cells/ml的樣 品1，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果有較 大偏差(80.7%)。fcm法檢測(cè)弧 菌的最低檢出限為104cells/ml。 圖6- 4 fcm檢測(cè)值與平皿菌落計(jì)數(shù)值的對(duì)比圖 流式細(xì)胞術(shù)；平皿菌落計(jì)數(shù) 32 第六

38、章第六章 多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立 6.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)弧菌的特異性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)弧菌的特異性 圖圖6- 5 fcm檢測(cè)多元弧菌的熒光信息直方圖檢測(cè)多元弧菌的熒光信息直方圖 33 第六章第六章 多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立 fcm方法可特異性識(shí)別5種病原弧菌（副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏 弧菌、創(chuàng)傷弧菌、鰻弧菌），而與6種海水中常見(jiàn)非弧菌（嗜水氣單胞菌、 溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、普通變形桿菌） 無(wú)交叉反應(yīng)，顯示出該方法具有良好的特異性。 圖圖6- 6 fcm檢測(cè)非弧菌的熒光信息直方圖檢測(cè)非

39、弧菌的熒光信息直方圖 34 第六章第六章 多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立多元弧菌流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法的建立 6.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)弧菌的精密度流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)弧菌的精密度 表表6- 2 精密度試驗(yàn)精密度試驗(yàn) 樣品編號(hào)meansd變異系數(shù)（%） 1368372504 6.8% 243688517912 4.1% 對(duì)1號(hào)（5104 cells/ml）、2號(hào)（5105 cells/ml）樣品每天進(jìn)行 一次fcm分析，每次做三個(gè)平行，一共測(cè)試5天，結(jié)果分析見(jiàn)表6- 2。 每個(gè)濃度下的變異系數(shù)均小于7%，變異較小，表明該方法具有較好 的精密度。 35 結(jié)論結(jié)論 1.對(duì)溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌的對(duì)溶

40、藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌的ompw蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序蛋白質(zhì)序列進(jìn)行序 列比對(duì)分析表明，不同弧菌種內(nèi)列比對(duì)分析表明，不同弧菌種內(nèi)ompw蛋白質(zhì)序列的平均一致性分蛋白質(zhì)序列的平均一致性分 別為：溶藻弧菌別為：溶藻弧菌96.0%，副溶血弧菌，副溶血弧菌100%，哈維氏弧菌，哈維氏弧菌95.3%。在。在 不同種弧菌種間：溶藻弧菌與副溶血弧菌、哈維氏弧菌不同種弧菌種間：溶藻弧菌與副溶血弧菌、哈維氏弧菌ompw蛋白蛋白 質(zhì)序列的平均一致性為質(zhì)序列的平均一致性為93%、90.1%；副溶血弧菌與哈維氏弧菌；副溶血弧菌與哈維氏弧菌 ompw蛋白質(zhì)序列的平均一致性為蛋白質(zhì)序列的平均一致性為89%。生物信息學(xué)分

41、析表明，。生物信息學(xué)分析表明， ompw是多種弧菌種內(nèi)、種間高度保守的外膜蛋白，可作為多種弧是多種弧菌種內(nèi)、種間高度保守的外膜蛋白，可作為多種弧 菌共同的菌體表面抗原。菌共同的菌體表面抗原。 2.以提取的副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株以提取的副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株v.parahaemolyticus 1.1997基因組基因組dna為為 模板，成功克隆到模板，成功克隆到ompw成熟蛋白的編碼基因序列，并構(gòu)建了成熟蛋白的編碼基因序列，并構(gòu)建了 pet28a-ompw重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌e.coli bl21。在。在iptg誘導(dǎo)誘導(dǎo) 下，導(dǎo)入下，導(dǎo)入pet28a-ompw重組質(zhì)粒的重組菌重組質(zhì)粒

42、的重組菌e.coli bl21大量表達(dá)了預(yù)大量表達(dá)了預(yù) 期分子量（期分子量（27kda）的重組蛋白。通過(guò)鎳柱）的重組蛋白。通過(guò)鎳柱ni-ida純化，重組蛋白純化，重組蛋白 r-ompw達(dá)到電泳純。達(dá)到電泳純。 36 結(jié)論結(jié)論 3.分別將重組蛋白分別將重組蛋白r-ompw和甲醛滅活的副溶血弧菌全菌免疫小鼠，和甲醛滅活的副溶血弧菌全菌免疫小鼠， 制備抗血清?？怪亟M蛋白制備抗血清?？怪亟M蛋白r-ompw血清在免疫印跡中識(shí)別了重組蛋血清在免疫印跡中識(shí)別了重組蛋 白，表明重組蛋白具有良好的免疫原性?？拱祝砻髦亟M蛋白具有良好的免疫原性?？箁-ompw血清識(shí)別副溶血清識(shí)別副溶 血弧菌全菌與抗副溶血弧菌全菌血清識(shí)別血弧菌全菌與