基因工程工具酶教學(xué)PPT

1、1/40 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶 dna聚合酶聚合酶 連接酶連接酶 核酸酶核酸酶 基因工程的工具酶基因工程的工具酶 2/40 核酸酶（核酸酶（nucleases） 1. 核酸外切酶核酸外切酶 2. 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶 3/40 dna分子糖分子糖-磷酸主鍵的破壞稱為磷酸主鍵的破壞稱為切口切口（nick） dna分子中核苷酸缺失稱為分子中核苷酸缺失稱為缺口缺口（gap） 連接修復(fù)連接修復(fù)3端羥基和端羥基和5端磷酸基團(tuán)，形成端磷酸基團(tuán)，形成3-5磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 連接酶連接酶 dna ligase t4噬菌體噬菌體dna連接酶連接酶 4/40 t4-dna連接酶（連接酶（t4-dn

2、a ligase） 來(lái)源于來(lái)源于t4噬菌體感染的大腸桿菌噬菌體感染的大腸桿菌 連接雙鏈連接雙鏈dna上的單鏈口（上的單鏈口（nick），亦可連接限），亦可連接限 制內(nèi)切酶所產(chǎn)生的粘性末端。制內(nèi)切酶所產(chǎn)生的粘性末端。 連接平頭雙鏈連接平頭雙鏈dna速度很慢，在高濃度的底物和速度很慢，在高濃度的底物和 酶的作用下方可進(jìn)行，分子之間的連接。酶的作用下方可進(jìn)行，分子之間的連接。 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： ph為為7.57.6， 平端連接用平端連接用20-25，粘端連接用，粘端連接用12左右。左右。 use 5/40 animation of the ligation process. when the s

3、ticky ends of two dna fragments come together and hydrogen bond through the a-t and g-c pairing, the enzyme ligase will form covalent bonds between the two fragments. 6/40 the specific cutting and ligation of dna gaattc cttaag gaattc cttaag g cttaa aattc g aattc g g cttaa g cttaa aattc g g cttaa aat

4、tc g g cttaa aattc g ecori dna ligase ecori sticky endecori sticky end 7/40 dna聚合酶（以聚合酶（以dna為模板合成為模板合成dna） rna聚合酶（以聚合酶（以dna為模板合成為模板合成rna） 逆轉(zhuǎn)錄酶（以逆轉(zhuǎn)錄酶（以rna為模板合成為模板合成dna） 聚合酶（聚合酶（polymerase） 8/40 大腸桿菌大腸桿菌dna聚合酶聚合酶i (大腸桿菌大腸桿菌dna聚合酶聚合酶i )klenow片段片段 t4 dna聚合酶聚合酶 t7 dna聚合酶聚合酶 taq dna聚合酶聚合酶 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶 dna聚合酶聚

5、合酶 9/40 1 ）dna聚合活性聚合活性 dttp 3 3 a t g c a a t t g c 5 | | | | 5 t a c g ppi t 1、聚合反應(yīng)具有方向性: 5 3 2、dna 聚合酶不能催化兩個(gè)游離的脫氧 核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3- oh 逐個(gè)添加脫氧核苷酸，使核苷酸 鏈不斷延長(zhǎng)。 10/40 11/40 5 a g c t t c a g g a t a 3 | | | | | | | | | | | 3 t c g a a g t c c t a g 5 33 5 5外切酶活性外切酶活性 55 3 3外切酶活性外切酶活性 能切除突變的能切除突變的 dn

6、adna片段片段 能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對(duì)，并將其水解 12/40 5 3 2 應(yīng)用應(yīng)用 1)切口移位法標(biāo)記dna 在dnase的作用基礎(chǔ)上產(chǎn)生鏈內(nèi)切口，應(yīng)用此酶的53聚合酶活性 和53外切核酸酶活性的同步聯(lián)合反應(yīng)，使切口沿dna鏈從5-端向3- 端移動(dòng)。若用于聚合反應(yīng)的原料dntp帶有放射性核素32p，就能使生成 的雙鏈帶有標(biāo)記物。 13/40 14/40 53 5 3 2) 3-粘端的末端標(biāo)記 先利用此酶的35外切核酸酶活性，切除凸出的3-粘端， 形成5-凸出粘端；再以其53聚合酶活性使其補(bǔ)平，在高濃度 的dntp條件下，使3-端的外切反應(yīng)與dntp的攙入反應(yīng)達(dá)到平

7、衡。 若dntp中有放射性標(biāo)記的核苷酸，即可使產(chǎn)物成為3-末端帶標(biāo) 記的dna。 15/40 16/40 5 3 5 3 17/40 53聚合酶活性：催化單核苷酸到聚合酶活性：催化單核苷酸到 dna 3-oh端端 35外切酶活性：從游離的外切酶活性：從游離的3端降解單核苷酸端降解單核苷酸 53外切酶活性：從游離的外切酶活性：從游離的5端降解雙鏈端降解雙鏈dna成為成為 單核苷酸單核苷酸 大腸桿菌大腸桿菌dna聚合酶聚合酶i（e.coli dna pol i） 1. 隨機(jī)引物標(biāo)記核酸探針 2. 5-粘端補(bǔ)平或3端標(biāo)記 3. 合成cdna的第二鏈 4. dna序列分析 5. 3-端的末端標(biāo)記 應(yīng)用

8、應(yīng)用 18/40 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 dna聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 19/40 蛋白酶降解蛋白酶降解dna聚合酶聚合酶 i 獲得其大片段稱為獲得其大片段稱為 klenow片段片段， 只有只有 53聚合酶活性聚合酶活性, 35外切酶活性。外切酶活性。 use 催化催化dna切口平移反應(yīng)，制備探針切口平移反應(yīng)，制備探針 對(duì)對(duì)dna分子進(jìn)行末端標(biāo)記分子進(jìn)行末端標(biāo)記 20/40 催化以催化以 rna 為模板的為模板的 dna 聚合反應(yīng)聚合反應(yīng) 催化合成出催化合成出互補(bǔ)互補(bǔ)dna（cdna） 可構(gòu)建可構(gòu)建cdna文庫(kù)文庫(kù) use complementary

9、dna 二、反二、反(逆逆)轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄酶 ( rna依賴依賴/指導(dǎo)的指導(dǎo)的dna聚合酶聚合酶 ) 21/40 催化催化dntp dna分子中分子中3-oh端端 給載體或給載體或cdna加上互補(bǔ)的多聚體尾巴加上互補(bǔ)的多聚體尾巴; dna片斷片斷3末端標(biāo)記末端標(biāo)記 在在mg2+ 條件下，選擇條件下，選擇3 oh端單鏈端單鏈dna為引物加成核苷酸，在為引物加成核苷酸，在co2+ 存在的條存在的條 件下，選擇件下，選擇3 oh端雙鏈端雙鏈dna為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。為引物加成核苷酸，形成多聚核苷酸尾。 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶（tdt） 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtmg2+ d

10、atp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 不需要模板的dna聚合酶，隨機(jī)摻入dntps 22/40 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtco2+ , datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaa aaaaaaaaaa oh 3 p 5 5 p 3 ho oh 3 p 5 tdtco2+ datp 5 p 3 ho aaaaaaaaaaaaaa oh 3 p 5 aaaaaaaaaaa 23/40 催化切除催化切除dna、rna和和dntp上的上的5磷酸基團(tuán)磷酸基團(tuán) 切除切除5磷酸防止自身連接磷酸防止自身連接 標(biāo)記前去除標(biāo)記前去除5磷酸磷酸 use 5p-

11、dna 5oh-dna+pi 5p-rna 5oh-rna+pi 堿性磷酸酶堿性磷酸酶(去除去除5 p ) 常用的堿性磷酸酶常用的堿性磷酸酶 細(xì)菌堿性磷酸酶（細(xì)菌堿性磷酸酶（bacterial alkaline phosphatase，bap） 小牛腸堿性磷酸酶（小牛腸堿性磷酸酶（calf intestinal alkaline phosphatase，cip） 24/40 use 標(biāo)記標(biāo)記dna鏈的鏈的5端端 連接反應(yīng)中磷酸化連接反應(yīng)中磷酸化 將將ntp的的-磷酸轉(zhuǎn)移到磷酸轉(zhuǎn)移到ds/ss dna/rna的的5-oh 來(lái)源于來(lái)源于t4噬菌體感染的大腸桿菌噬菌體感染的大腸桿菌 t4-多核苷酸多

12、核苷酸(磷酸磷酸)激酶（激酶（t4-polynucleotide kinase） 25/40 dnase rnase 核酸酶核酸酶s1 水解水解dna 水解水解rna 降解單鏈降解單鏈dna和和rna 用量增大可降解雙鏈核酸，用于切去雙鏈用量增大可降解雙鏈核酸，用于切去雙鏈-cdna 合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。合成中產(chǎn)生的發(fā)夾環(huán)。 核酸酶核酸酶 26/40 重組重組dna技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶 工工 具具 酶酶功功 能能 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割識(shí)別特異序列，切割dna dna連接酶連接酶催化催化dna中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二酯羥基末端之間形成磷酸二酯 鍵，使鍵，使dna切口封合或使兩個(gè)切口封合或使兩個(gè)dna分子或片段連接分子或片段連接 dna聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cdna分子或片段連接分子或片段連接 缺口平移制作高比活探針缺口平移制作高比活探針 dna序列分析序列分析 填補(bǔ)填補(bǔ)3 末端末端 klenow片段片段又名又名dna聚合酶聚合酶i大片段，具有完整大片段，具有完整dna聚合酶聚合酶i的的53 聚合、聚合、 35 外切活性，而無(wú)外切活性，而無(wú)53 外切活性。常用于外切活性。常用于cdna第二鏈合第二鏈合 成，雙鏈