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文檔簡介
1、*丸儀供巷恙,直脩険腳可刪徐RNA含量的測定一紫外吸收法一、目的1、 掌握利用紫外吸光法測定RNA含量的原理和方法2、了解紫外分光光度計的使用原理。二、原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子結構中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統 (-C = C 一C = C 一),能夠強烈吸收 25028Onm 波長的紫外光。核酸(DNA , RNA)的最大紫外吸收 值在260nm 處。遵照Lambert-Beer定律,可以從紫外光吸收值的變化來測定核酸物質的 含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構的情況不同,紫外吸收光也隨之表現出明顯的差異,它們的摩爾消光系數也隨之不同。所以,在測定核酸物質時均應在固定的p
2、H溶液中進行。三、材料1、干酵母粉(市售)。2、 0.2氫氧化鈉溶液,2gNaoH溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。3、標準 RNA溶液:100 卩 g/mL。4、95滋性乙醇和無水乙醇。5、分析天平&紫外分光光度計7、離心機和離心管8、燒杯(10mL)錐形瓶和玻璃棒9、容量瓶(100mL)10、移液管(5mL)和移液槍11、試管和試管架。四、操作1、RNA的提取置4g干酵母粉于200ml錐形瓶中,加入 0.2%NaOH溶液40ml,沸水浴加熱 30分鐘, 經常攪拌,后流水冷卻,4000r/min,離心15分鐘,留上清夜加入 95%酸性乙醇40mL,邊加邊攪拌,后靜置 5-10分鐘,再4000r
3、/min離心5分鐘,保留沉淀,再每次用10mL95%!醇洗滌沉淀,3000r/min,離心5分鐘,洗滌兩次,再用無水乙醇洗滌兩次,每次3000r/min離心5分鐘,收集沉淀于濾紙上,沉淀即為粗RNA晾干后測定 RNA的濃度。2、樣品處理稱取0.2 0.25g粗品RNA,加入2ml0.2%的NaOH溶液,和1ml出0溶解,調成糊狀, 再加入4050ml也0溶解,調節(jié)pH至7.0,然后定容至100ml。(再取2ml定容至100ml 待測)3、標準曲線繪制與樣品測定配制標準RNA溶液梯度,取11支試管,洗干凈后,標號為 0、1、2、3、4、5、6、7、A、B、C按下表,測定其 Abs值,做出工作曲線
4、試管01234567ABC標準RNA 液(g/ ml)05101520253035一一一粗品RNA(ml)666A東儀供參恙,直脩臣腳可冊詒i五、實驗結果2、標準RNA曲線的繪制1、列表表2酵母RNA樣品溶液吸光度測定結果試管01234567ABCAbs值00.1280.2260.3180.4190.5370.6220.7100.5230.5170.5181吸光度-RNA?fi度標準曲踐2011.3.16)由吸光度-RNA濃度標準曲線可得,RNA樣品溶液濃度為:C=25卩g/mL因此可求出 RNA樣品溶液中RNA的含量為:ni = 2S X SO X100 = 0.125 (g.)則RNA樣品
5、的純度為:0.12SCUS19X 100% =49.62%則干酵母粉中RNA的比例為:(P =晉 K100% = 313%A丸儀供參恙,直脩険腳可刪徐六、實驗分析1、樣品中RNA含量較低,可能原因如下:1)粗制的RNA在空氣下長時間放置,性質改變.2)實驗環(huán)境較差,人體唾液中含有 RNA酶,飛濺到RNA上,RNA降解一部分。3)在RNA的提取過程中,對 RNA粗品的沖洗次數較少,導致其遺留雜質較多。標準RNA放置時間較長,物理性質發(fā)生改變,導致其吸光度變小。故標準曲線較理論的曲線y值偏小。故最終標準曲線上面所反映的樣品 RNA濃度偏大。2、測定RNA含量的幾種方法及其比較(1)定磷法:磷的測定
6、方法很多,Fiske-Subbarow定磷法是一經典的但至今仍被經常采用 的方法,它具有靈敏、簡便的特點。各種含磷有機物經硫酸或過氯酸水解,使有機磷消化成為無機磷。無機磷在酸性條件下,與鉬酸鹽(常用鉬酸銨或鉬酸鈉)反應生成磷鉬酸鹽絡合 物。用還原劑處理,磷鉬酸鹽絡合物被還原生成鉬藍,在660nm處有最大光吸收峰。在一定濃度范圍內,顏色的深淺與磷含量成正比關系。因此可應用分光光度法進行磷的定量測定。核酸是一類含磷化合物,其分子含有一定比例的磷,一般純的RNA及其核苷酸含磷質量分數為9.0%; DNA及其核苷酸含磷質量分數為9.2%,即每100g核酸含有9.09.2g磷,也就是核酸量是含磷量的11
7、倍左右,故測得磷的量,即可求得核酸量。這就是定磷法的理論依據,磷的定量測定是測定核酸含量常用手段之一。生物有機磷材料中有時含有無機磷雜質,故用定磷法來測定該有機磷物質的量時,必須分別測定該樣品的總磷量,即樣品經過消化以后所測得的含磷量,以及該樣品的無機磷含量,即樣品未經消化直接測得的含磷量。將總磷量減去無機磷才是該有機磷物質的含磷量。(2 )地衣酚法(苔黑酚法):RNA含量測定,除可用紫外吸收法及定磷法外,常用地衣酚法測定。其反應原理是:當RNA與濃鹽酸共熱時,即發(fā)生降解,形成的核糖繼而轉變成糠醛,后者與3, 5-二羥基甲苯(地衣酚或 苔黑酚,orcinol)反應,在Fe 3+或Cu 2+催化下,生 成鮮綠色復合物。反應產物在670nm處有最大吸收。RNA濃度在20250卩g m范圍內,光吸收與RNA濃度成正比。地衣酚法特異性差, 凡戊糖均有此反應,DNA和其他雜質也能 與地衣酚反應產生類似顏色。因此,測定PNA時可先測得DNA含量再計算RNA含量;(3)二苯胺法:DNA分子中的脫氧核糖基,在酸性溶液中變成w羥基-y酮基戊醛,與二苯胺試劑一起加熱產生藍色反應,在595nm處有最大吸收。DNA在40 400微克范圍內,光密度與DNA的濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛,可以提高反應靈敏度。除DNA外,脫氧木糖,阿拉伯糖也有同樣反應。其
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