高效液相色譜法測定乳制品中的三聚氰胺

1、高效液相色譜法測定液態(tài)奶中三聚氰胺的含量1（華南師范大學化學與環(huán)境學院，廣州 ） 2（華南師范大學化學與環(huán)境學院分析化學研究所，廣州 ）摘 要 為建立液態(tài)奶中三聚氰胺含量的高效液相色譜測定方法，通過超聲提取，離心，有機濾膜凈化，結(jié)合高效液相色譜進行樣品測定。色譜柱：依利特 C18液相色譜柱（4.6150mm，5 m）。流動相：A液：離子對試劑緩沖液（0.9508g辛烷磺酸鈉+1.0640g檸檬酸，配成1L溶液）；B液：甲醇；色譜條件：70%A+30%B。流速：1.0mL/min。柱溫：40。波長：239 nm。進樣量：2L。結(jié)果表明：三聚氰胺標準曲線為y=58093x+1060.1，相關系數(shù)R

2、2=0.9986，在0.01561.0mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。樣品在三氯乙酸和乙腈（體積比=3：1）的提取條件下的加標回收率最高，為101.63%。關鍵詞 高效液相色譜，三聚氰胺，液態(tài)奶1 引言1.1 三聚氰胺儀器檢測方法概述 三聚氰胺(melamine)是一種重要的氮雜環(huán)有機化工原料1，俗稱蜜胺。因其含氮量大于66%，且我國通常采用“凱氏定氮法”估測食品和飼料中的蛋白含量，三聚氰胺常被不法商人摻雜進食品或飼料中，以提升食品或飼料檢測中的蛋白質(zhì)含量指標，因此三聚氰胺也被稱為“蛋白精”。但三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的。 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局與國家標準化管理委員會聯(lián)合發(fā)布

3、了原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法，即國標GB/T 22388-20082。這一新標準制定了高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）三種檢測方法與標準。三聚氰胺的檢測方法還包括酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。1.1.1 高效液相色譜法（HPLC） 高效液相色譜法的定量限為2.0mg/kg，具有操作簡單、靈敏度高，測定周期短等優(yōu)點。其檢測原理為：待檢測樣在離子對緩沖溶液的淋洗作用下在色譜柱流動，各成分在柱內(nèi)經(jīng)過吸附、溶解等過程實現(xiàn)分離。再利用相應檢測器檢測，最后通過相應標準物質(zhì)出峰時間與出峰面積的比較，進行定性及定量分析。利用高效

4、液相色譜法測定三聚氰胺結(jié)果的精密度、重復性根據(jù)選擇的檢測條件如檢測器、色譜柱等的不同而產(chǎn)生變化。試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標法定量。本方法的定量限為2.0mg/kg。在添加濃度2mg/kg10mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對標準偏差小于10%。1.1.2 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法定量限為0.01mg/kg，是一種利用液相色譜法分離與用質(zhì)譜法定性相聯(lián)用的分析方法。乳或乳制品中的三聚氰胺經(jīng)過前處理操作提取、凈化，在等體積乙酸銨和乙腈的淋洗作用下在色譜柱上實現(xiàn)分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測，再通過

5、與標準物質(zhì)色譜出峰時間、特征離子豐度比對照，最終實現(xiàn)定性、定量分析。該檢測方法靈敏度高，較高效液相色譜法具有更強定性功能，且檢出限更低。 試樣用三氯乙酸溶液提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定和確證，外標法定量。本方法的定量限為0.01mg/kg。在添加濃度0.01mg/kg0.5mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間，相對標準偏差小于10%。1.1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS和GC-MS/MS） 氣相色譜-質(zhì)譜法相較其他方法，靈敏度更高，其檢出限為0.05mg/kg。檢測原理是：原料乳或乳制品首先經(jīng)過提取、凈化，由于其分子質(zhì)量較小，不容易被氣化

6、，因此需使用硅烷化試劑進行硅烷化衍生，衍生產(chǎn)物采用選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式(SIM)或多反應監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式(MRM)，用化合物的保留時間和質(zhì)譜碎片的豐度比進行定性分析，外標法定量。此方法增加了衍生化過程，增加了前處理復雜度，且可能給分析結(jié)果帶來了更多的不確定因素，因此更多研究人員優(yōu)先選用高效液相色譜法測定三聚氰胺。 試樣經(jīng)超聲提取、固相萃取凈化后，進行硅烷化衍生，衍生產(chǎn)物采用選擇離子監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式（SIM）或多反應監(jiān)測質(zhì)譜掃描模式（MRM），用化合物的保留時間和質(zhì)譜碎片的豐度比定性，外標法定量。本方法中，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS法）的定量限為0.05mg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（

7、GC-MS/MS法）的定量限為0.005mg/kg。GC-MS法在添加濃度0.05mg/kg2mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在70%110%之間，相對標準偏差小于10%；GC-MS/MS法在添加濃度0.005mg/kg1mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在90%105%之間，相對標準偏差小于10%。1.1.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法 ELISA方法的原理是通過抗體、抗原相互結(jié)合，使加入底物顯色從而來篩選樣品是否含三聚氰胺殘留，具有特異、快速、簡單、穩(wěn)定、易于自動化操作等特點，但該方法缺點在于，與分析樣品相類似結(jié)構的物質(zhì)亦可與特異性抗體發(fā)生反應，從而產(chǎn)生干擾。例如在三聚氰胺測定中，三聚氰酸與其結(jié)構

8、相似，容易產(chǎn)生特異性反應，從而使結(jié)果偏大。因此ELISA法一般只用于大批樣品檢測三聚氰胺殘留量時的初步篩選，而對于超標樣品的確證還需使用液質(zhì)譜聯(lián)用法或氣質(zhì)譜聯(lián)用法?，F(xiàn)今國內(nèi)已有許多用于食品中三聚氰胺或三聚氰酸殘留檢測的ELISA試劑盒，且其檢測靈敏度均達10-6以上5。Erica6使用三聚氰胺ELISA試劑盒分析寵物食品三聚氰胺的殘留量，回收率為88%，方法檢出限為9ng/mL。1.2 實驗原理 高效液相色譜法的定量限為2.0mg/kg2，具有操作簡單、靈敏度高，測定周期短等優(yōu)點。其檢測原理為：待檢測樣在離子對緩沖溶液的淋洗作用下在色譜柱流動，各成分在柱內(nèi)經(jīng)過吸附、溶解等過程實現(xiàn)分離。再利用相

9、應檢測器檢測，最后通過相應標準物質(zhì)出峰時間與出峰面積的比較，進行定性及定量分析。利用高效液相色譜法測定三聚氰胺結(jié)果的精密度、重復性根據(jù)選擇的檢測條件如檢測器、色譜柱等的不同而產(chǎn)生變化。 試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，其中包括超聲提取、沉淀蛋白、過濾，得到測試液后，再經(jīng)高效液相色譜測定。根據(jù)保留時間進行定性分析，試樣與標準品保留時間的相對偏差不大于2%3；采用多點校正外標法進行定量分析，待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線范圍內(nèi)。在添加濃度2mg/kg10mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%110%之間2。2 實驗部分2.1 試劑與儀器2.1.1 試劑甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；辛烷磺酸鈉

10、（色譜純）；三聚氰胺標準品（CAS 108-78-01，純度大于99.0%）；氨水（25%28%）；三氯乙酸；硫酸鉛；乙酸鋅；檸檬酸。除非另有說明，其余試劑均為分析純，實驗用水均為純凈水（怡寶飲用水）。甲醇水溶液（50%）：準確量取50mL甲醇和50mL水，混勻備用。三氯乙酸溶液（10g/L）：準確稱取1.0g三氯乙酸，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。乙酸鋅溶液（10g/L）：準確稱取1.0g乙酸鋅，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。硫酸鉛飽和溶液：準確稱取1.0g硫酸鉛，用水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度，混勻備用。 離子對

11、試劑緩沖液：準確稱取0.9508g辛烷磺酸鈉和1.0640g檸檬酸，用約980mL水溶解，調(diào)節(jié)pH=3.0后，轉(zhuǎn)移至1000mL塑料試劑瓶中，定容至刻度，混勻備用。 三聚氰胺標準儲備液（2.5mg/mL）：準確稱取0.2500g（精確到0.1 mg）三聚氰胺標準品于100mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為2.5mg/mL的標準儲備液，于4避光保存。2.1.2 儀器SHIMADZU SPD-M10A VP高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器；分析天平，感量為0.0001 g；低速離心機，轉(zhuǎn)速不低于4000 r/min；數(shù)控超聲波清洗器；具塞刻度試管，50mL；容量瓶

12、，25mL、100mL；燒杯，100mL、250mL；量筒，10mL、25mL；微量注射器，10L；一次性注射器，10mL；有機濾膜，0.45m；離心管；玻璃棒；膠頭滴管。2.2 實驗步驟2.2.1 樣品處理參照GB/T 22388-2008標準的方法2 ，分別稱取20mL試液（精確至0.1mL）兩份于50mL具塞刻度試管中，其中一份加入0.1g（精確至0.1mg）的三聚氰胺標準品，另一份則不加；加入15mL10g/L三氯乙酸溶液和5mL乙腈。搖勻，超聲提取10 min。靜置2min，在離心機上以4000 r/min離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶濕潤的濾紙過濾后，取10mL濾液（精確至0.

13、1mL）于25mL容量瓶中，用三氯乙酸溶液定容至刻度，混勻。經(jīng)0.45m有機濾膜過濾，上機測試。只改變提取劑中三氯乙酸和乙腈的加入比例，加入10mL10g/L三氯乙酸溶液和10mL乙腈。其他步驟不變，以同樣的方法進行樣品處理。只改變提取劑的組分，分別加入15mL10g/L乙酸鋅溶液和5mL乙腈，15mL飽和硫酸鉛溶液和5mL乙腈。其他步驟不變，以同樣的方法進行樣品處理。2.2.2 高效液相色譜測定 標準曲線的繪制。用三氯乙酸溶液將三聚氰胺標準儲備液稀釋得到一系列標準溶液，濃度分別為：0.0156 mg/mL、0.0312 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.1250 mg/mL、0.25

14、0 mg/mL、1.00 mg/mL，濃度由低到高進樣檢測，以峰高-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。 定量測定。待測樣液中三聚氰胺的響應值應在標準曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。 結(jié)果計算。試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件處理得出，計算回收率。2.3 儀器工作參數(shù)色譜柱：依利特 C18液相色譜柱（4.6150mm，5 m）。流動相：A液：離子對試劑緩沖液（0.9508g辛烷磺酸鈉+1.0640g檸檬酸，配成1L溶液）；B液：甲醇；色譜條件：70%A+30%B。流速：1.0mL/min。柱溫：40。波長：239 nm。進樣量：2L。3 結(jié)果與討論3.1 三聚氰胺標準品色譜

15、圖 在2.3色譜條件下，得到三聚氰胺標準樣品的色譜圖，如圖1所示。走樣時間20min，標準樣品保留時間為9.7min左右，有較明顯的拖尾現(xiàn)象。圖1三聚氰胺標準品色譜圖3.2 標準曲線與線性范圍在選定的色譜條件下進樣2L，以三聚氰胺質(zhì)量濃度為橫坐標，峰高度為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果如表1、圖2所示?；貧w方程為y=58093x+1060.1，相關系數(shù)R2=0.9986，說明分析物在0.01561.0mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。表1峰高與三聚氰胺質(zhì)量濃度的線性關系濃度c(mg/mL)0.0156 0.0312 0.0625 0.1250 0.2501.00峰高121723004317917216

16、78258800圖2峰高與三聚氰胺質(zhì)量濃度的線性關系3.3 不同提取條件下測定樣品（添加三聚氰胺標準品）的回收率 選擇待測樣品添加同一水平的標準品，分別按照4種不同的樣品處理方法進行提取凈化，測定三聚氰胺的質(zhì)量濃度，計算回收率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，4個樣品的回收率分別為101.63%，85.97%，44.60%，90.64%。其中，由三氯乙酸和乙腈（體積比=3：1）組成的提取劑的回收率最高，為101.63%。分析可能原因如下：第一，蒙牛液態(tài)奶本身含有部分三聚氰胺。第二，先加提取劑，再加入三聚氰胺標準品，導致三聚氰胺直接與溶劑相溶而并未與液態(tài)奶混合，相當于將三聚氰胺全量從液態(tài)奶中提取出來

17、。第三，由于操作者本身的實驗水平影響，進樣量大于2L，使測試結(jié)果偏高。三氯乙酸、乙腈和鉛離子都是沉淀蛋白的試劑，三氯乙酸能使蛋白質(zhì)分子的肽鏈斷裂，破壞蛋白質(zhì)分子的結(jié)構使其沉淀。但對于大分子的蛋白質(zhì)，其結(jié)構復雜性與致密性大，三氯乙酸可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去，需使用乙腈這種有機溶劑抽提三氯乙酸而更好地沉淀蛋白，鉛離子是重金屬離子，使蛋白質(zhì)變性成為固體沉淀下來，效果不如三氯乙酸好。因此，三氯乙酸+乙腈組成的提取劑是最好的選擇，但其混合比例還有待進一步研究。表2 不同提取條件下測定樣品（添加三聚氰胺標準品）的回收率（n = 1）樣品提取劑（體積比）本底值/(mg/mL)加標量/(mg/mL

18、)保留時間/min測得值/(mg/mL)回收率/%1三氯乙酸：乙腈=3：1nd0.787210.3880.8000101.632乙酸鋅：乙腈=3：1nd0.796810.3970.685085.973硫酸鉛：乙腈=3：1nd0.796010.6990.355044.604三氯乙酸：乙腈=1：1nd0.803210.3410.728090.64 說明：nd表示未檢出。3.4 樣品檢測結(jié)果將制備好的樣品用所建立的樣品處理和高效液相色譜方法測定，通過保留時間定性和外標法定量，結(jié)果如表3所示。由表3可知，樣品不含有三聚氰胺，或者其所含量用該方法無法測定，說明市場上蒙牛液態(tài)奶質(zhì)量保證可能較好。表3 樣品檢測結(jié)果（n=1）樣品提取劑（體積比）保留時間/min測得值/(mg/mL)1三氯乙酸：乙腈=3：19.389nd10.347nd10.656nd10.947nd2乙酸鋅：乙腈=3：19.786nd10.620nd10.835nd3硫酸鉛：乙腈=3：19.393nd4三氯乙酸：乙腈=1：110.773nd 說明：nd表示未檢出。References1 邵靜群,溫家琪,徐世文.三聚氰胺毒理學進展J.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2007,12:52-54.2 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 2238