第十三章細胞周期

1、CELL CYCLE v細胞增殖是生命的基本特征，種族繁衍、個體發(fā)育、機 體修復(fù)等都離不開細胞增殖。 初生嬰兒有1012個細胞，成人1014個，約200種類型。 成人體內(nèi)每秒鐘有數(shù)百萬新細胞產(chǎn)生，以補償衰老和死亡的細胞。 一個大腸桿菌若按20分鐘分裂一次，并保持這一速度，則兩天即可超過 地球的重量。 第一節(jié) 基本概念 一、什么是細胞周期 v由細胞分裂結(jié)束到下一次細胞分裂結(jié)束所經(jīng)歷的過程，叫細 胞周期。分為4個期： G1期(gap1)，指從有絲分裂完成到期DNA復(fù)制之前的間隙時間。 S期(synthesis phase)，指DNA復(fù)制的時期。 G2期(gap2)，指DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始之

2、前的一段時間。 M期又稱D期(mitosis or division)，細胞分裂開始到結(jié)束。 Eucaryotic Cell Cycle A typical mammalian cell has a cell cycle time of 24 hours, with 12 hr G1, 6-8 hr S, 3-4 hr G2, and 1 hr M v從增殖的角度來看，可將高等動物的細胞分為三類： 連續(xù)分裂細胞，如表皮生發(fā)層細胞、部分骨髓細胞。 休眠細胞暫不分裂，但在適當?shù)拇碳は驴芍匦逻M入細胞周期， 稱G0期細胞，如淋巴細胞、肝、腎細胞等。 不分裂細胞，指不可逆地脫離細胞周期，不再分裂的細胞，

3、又 稱終端細胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細胞等 v細胞周期的時間長短與物種的細胞類型有關(guān)。通常G1期持 續(xù)時間差異較大，M期最短約0.54.5小時。 v標記有絲分裂百分率法（percentage labeled mitoses， PLM）：對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射 自顯影技術(shù)顯示標記細胞，通過統(tǒng)計標記有絲分裂細胞百 分數(shù)的辦法來測定細胞周期。放射標記物為3H或者14C標 記的TDR。 二、細胞周期時間的測定 50 100 TG2 0 TM Ts Tc TG2 +1/2TM T PLM 常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM v細胞同步化(synchronization)

4、是指在自然過程中發(fā)生或經(jīng) 人為處理造成的細胞周期同步化。 v（一）自然同步化 v1、多核體：如：粘菌、瘧原蟲。 v2、某些水生動物的受精卵：如海膽、海參、兩棲類。 v3、增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入 適宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。 三、細胞同步化 v1、選擇同步化 v1）有絲分裂選擇法：M期細胞與培養(yǎng)皿的附著性低，振蕩 脫離器壁收集。 優(yōu)點：操作簡單，同步化程度高，細胞不受藥物傷害。 缺點：獲得的細胞數(shù)量較少（分裂細胞約占1%2%） 。 v2）細胞沉降分離法： M期細胞體積大，可用離心分離。 優(yōu)點：可用于任何懸浮培養(yǎng)的細胞。 缺點：同步化程度較低。 （二）人工同步化 v

5、2、誘導同步化 v1）DNA合成阻斷法：選用DNA合成的抑制劑，可逆地抑 制DNA合成。常用TDR雙阻斷法： 在細胞處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)基中加入過量TDR（Hela 2mol/L； CHO 7.5mol/L）。S期細胞被抑制，停在G1/S交界處。移去TDR， 釋放時間大于TS時，再次加入過量TDR。 優(yōu)點：同步化程度高 缺點：產(chǎn)生非均衡生長，個別細胞體積增大。 v2）中期阻斷法 v用秋水仙素等細胞分裂抑制劑將細胞阻斷在中期。優(yōu)點是 無非均衡生長現(xiàn)象，缺點是可逆性較差。 第二節(jié) 有絲分裂 一、細胞分裂的類型 v無絲分裂(amitosis)：又稱直接分裂，由Remark（1841） 發(fā)現(xiàn)于雞胚血細

6、胞，不涉及紡錘體形成及染色體變化 。 v有絲分裂(mitosis) ：又稱為間接分裂，由Fleming (1882) 年首次發(fā)現(xiàn)于動物，Strasburger(1880)發(fā)現(xiàn)于植物。 v減數(shù)分裂(meiosis）：染色體復(fù)制一次，細胞連續(xù)分裂兩 次。 二、有絲分裂 v為了便于描述人為的劃分為六個時期： 間期（interphase）； 前期(prophase)； 前中期(premetaphase)； 中期(metaphase)； 后期(anaphase)； 末期(telophase)。 其中間期包括G1期、S期和G2期，主要進行DNA復(fù)制、中 心體復(fù)制、細胞體積增大等準備工作。 （一）前期（一）

7、前期 染色質(zhì)凝縮，分裂極確立與紡錘體開始形成，核仁 解體，核膜消失。 vS期中心粒已完成復(fù)制，在前期移向兩極，兩對中心粒之 間形成紡錘體微管，核膜解體時，中心粒已到達兩極，并 形成紡錘體。 v紡錘體有三種微管結(jié)構(gòu)： 極體微管（polar mt）兩極間的微管，在紡錘體中部重疊，重疊 部位結(jié)合有分子馬達 。 著絲點微管（kinetochore mt），是從著絲點到另一極的微管； 星體微管（astral mt），由中心粒放射出來的微管。植物沒有中 心粒和星體，其紡錘體稱無星紡錘體。 Two centrosomes, and their forming radial arrays of astral

8、microtubules separating on the surface of an early prophase newt lung cell nucleus. 圖片來自 圖片來自 （二）前中期（二）前中期 核膜解體到染色體排列到赤道面(equatorial plane) 上。 （三）中期（三）中期 染色體排列到赤道面上。 （四）后期（四）后期 指妹妹染色體單體分開并移向兩極的時期。分為后 期A、后期B兩個過程。 vAnaphase A: separation of the sister chromatids. vAnaphase B: separation of the poles.

9、植物細胞有沒有后期B ？ Microtubules and Motors in the spindle v（五）末期 v從子染色體到達兩極，至 形成兩個新細胞為止的時 期。涉及子核的形成和胞 質(zhì)分裂兩個方面。 末期子核的形成，大體經(jīng)歷了與前期相反的過程，即染 色體解聚縮，核仁出現(xiàn)和核膜重新形成。核纖肽B去磷 酸化，介導核膜重新裝配。 核分裂與胞質(zhì)分裂（cytokinesis）是相繼發(fā)生的，屬于 兩個分離的過程，如： 大多數(shù)昆蟲的卵，核可進行多次分裂而無胞質(zhì)分裂，某些藻類 的多核細胞可長達數(shù)尺，以后胞質(zhì)才分裂形成單核細胞。 子核的形成與胞質(zhì)分裂子核的形成與胞質(zhì)分裂 v動物細胞的胞質(zhì)分裂通過胞質(zhì)收

10、縮環(huán)的收縮實現(xiàn)，收縮環(huán) 由大量平行排列的肌動蛋白組成。 v用細胞松弛素處理這一時期的細胞，會出現(xiàn)什么現(xiàn)象？ Dividing Muscle Myoblast (primative muscle cell) (SEM x8,000) v植物細胞末期近兩極處紡錘 絲消失，中間微管保留，并 數(shù)量增加，形成成膜體。 v來自高爾基體囊泡沿微管轉(zhuǎn) 運到成膜體中間。融合形成 細胞板(cell plate)，囊泡的內(nèi) 含物形成初生壁和中膠層， 囊泡膜形成質(zhì)膜，融合留下 的管道形成胞間連絲。 第三節(jié) 減數(shù)分裂Meiosis v由連續(xù)兩次分裂構(gòu)成： 通常減數(shù)分裂I分離的是同源染色體，所以稱為異型分裂 （heter

11、otypic division）或減數(shù)分裂（reductional division）。 減數(shù)分裂II分離的是姊妹染色體，類似于有絲分裂，所以稱為同型 分裂（homotypic division）或均等分裂（equational division）。 v為了描述方便將減數(shù)分裂分為幾個期和亞期。 Meiosis Concepts: Gametic meiosis Sporic meiosis 1. Zygotic meiosis v稱前減數(shù)分裂間期或前減數(shù)分裂期(premeiosis)。 v間期也可分為G1期、S期和G2期。 vG2期是有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期。 v減數(shù)分裂的S期時間較長

12、，部分DNA（約0.3%左 右）是在合線期合成的。 一、間期 二、分裂期 v（一）減數(shù)分裂I v1、前期I v減數(shù)分裂的特殊過程主要發(fā)生在前期I ，通常分為5個時期： 細線期（leptotene ），合線期（zygotene ），粗 線期（pachytene），雙線期（diplotene），終變期 （diakinesis）。 v1）細線期：染色體呈細線狀，具有念珠狀的染色粒。 v2）合線期：亦稱偶線期，是同源染色體配對的時期。 概念：聯(lián)會復(fù)合體(synaptonemal complex， SC）二價體 （bivalent）四分體（tetrad）。 這一時期合成約0.3%左右的DNA，稱為Z-D

13、NA。 v3）粗線期：同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生交換的 時期。 v4）雙線期：聯(lián)會的同源染色體相互排斥、開始分離，交 叉開始端化(terminalization)。聯(lián)會復(fù)合體消失。 補充：植物細胞雙線期一般較短，許多動物卵細胞中雙線期停留的 時間非常長。人的卵母細胞在五個月胎兒中已達雙線期，而一直到 排卵都停在雙線期，排卵年齡大約在12-50歲之間。魚類、兩棲類、 爬行類、鳥類以及無脊椎動物的昆蟲中，雙線期的二階體解螺旋而 形成燈刷染色體，這一時期是卵黃積累的時期。 v5）終變期：二階體顯著變短。由于交叉端化過程的進一 步發(fā)展，故交叉數(shù)目減少，通常只有一至二個交叉。核仁 此時開始消失，核

14、被膜解體。 v2、中期I v3、后期I 二價體的兩條同源染色體分開，分別向兩極移動。 同源染色體隨機分向兩極，染色體重組，人類染色體重組概率有223個。 v4、末期I v5、減數(shù)分裂間期。 v （二）減數(shù)分裂II v可分為前、中、后、末四個四期，與有絲分裂相似。 v一個精母細胞形成4個精子；一個卵母細胞形成一個卵子及2-3個極體。 Chromosome recombination 1 Chromosome recombination 2 Minimum number of gamete types = 2n , In humans, n = 23 vSC由兩條同源染色體沿縱軸形成，外觀呈梯子狀

15、。 vSC幫助交換的完成，SC上有重組節(jié)(recombination nodules)，是交換發(fā)生的部位。 vSC主要由堿性蛋白質(zhì)和RNA組成，并含有少量DNA。 vSC形成合線期，成熟于粗線期，消失于雙線期。 v在細線期或合線期加入DNA合成抑制劑，則抑制SC的形 成。 三、聯(lián)會復(fù)合體 synaptonemal complex 第四節(jié) 細胞周期調(diào)控 一、研究背景 v1970s Rao和Johnson發(fā)現(xiàn)與M期細胞(Hela)融合的間期細 胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體(prematurely condensed chromosome，PCC)。 G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。

16、S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復(fù)制。 G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。 v甚至不同類的M期細胞也可誘導PCC產(chǎn)生，說明M期細胞 具有促進間期細胞進行分裂的因子，即成熟促進因子 (maturation promoting factor， MPF)。 PCC v1960s Leland Hartwell,1970s Paul Nurse 以芽殖酵母和 裂殖酵母為實驗材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與 細胞分裂有關(guān)的基因(cell division cycle gene, CDC)。 v如： 裂殖酵母cdc2、 芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂； wee1突

17、變型則提早分裂，cdc25突變型細胞體積增大而不分裂； cdc2和cdc28都編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細胞周期的進行， weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進CDC2的活性。 Fission yeast budding yeast Cdc 25 & Wee1 mutant v1980s Timothy Hunt發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的 含量隨細胞周期振蕩，命名為周期蛋白(cyclin A和B)。后 來發(fā)現(xiàn)各類動物來源的細胞周期蛋白mRNA均能誘導蛙卵 的成熟。 v1988年Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由 32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激

18、酶。 v進一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=CDC2+clyclin B Leland H. Hartwell R. Timothy (Tim) Hunt Sir Paul M. Nurse 2001年10月8日美國人Leland Hartwell、英國人Paul Nurse、Timothy Hunt因?qū)毎芷谡{(diào)控機理的研究而獲 諾貝爾生理醫(yī)學獎。 二、CDK vCDC2與細胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細胞 周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。 vCDC2又被稱為CDK1，可將特定蛋白磷酸化，促進細胞 周期運行，又稱作細胞周期引擎。 如將核纖層蛋白磷酸化

19、導致核纖層解體、核膜消失； 將H1磷酸化導致染色體的凝縮等。 v在動物中已知7種CDK。均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域， 這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié) 合有關(guān)。 三、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子 vCDK inhibitor, CKI對細胞周期起負調(diào)控作用，分為： Ink4(Inhibitor of cdk 4): P16ink4a, P15ink4b, P18ink4c, P19ink4d。特 異性抑制cdk4cyclin D1, cdk6cyclin D1。 Kip(Kinase inhibition protein)：P21cip1 (cyclin inhibi

20、tion protein 1）P27kip1、P57kip2，抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。P21cip1還能與 DNA聚合酶的輔助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen） 結(jié)合，直接抑制DNA的合成。 四、細胞周期蛋白cyclin v特點：在細胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個氨 基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導周期蛋白與CDK 結(jié)合。 v作用：激活CDK，引導CDK作用于不同底物。 v已知30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3 、C、 D1-3、 E1-2、F、G、H等。 v分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。 不同類型的CDK

21、/cyclin復(fù)合體 v*包括D1-3，各亞型cyclin D在不同細胞中的表達量不同， 但具有相同的功效。 vG1期，在生長因子的刺激下，cyclin D表達，并與CDK4、 CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，Rb釋放出轉(zhuǎn)錄 因子E2F，促進許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和 CDK1的基因。 vG1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進細胞進入S期。 CyclinE的抗體能使細胞停滯于G1期。 v在G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物 蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導致染色體凝縮，核 纖層蛋白磷酸化使核膜解體。 vcell cycle regulation v在中期當MPF活性達到最高時，激活后期促進因子APC， 將泛素連接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶體(proteasome) 降解，完成一個細胞周期。 分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱降解盒 (destruction box)。 泛素由76個氨基酸組成，高度保守。共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被 蛋白酶體識別和降解，這是細胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常