液相色譜_四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析頭孢拉定中的主要雜質(zhì)_潘芳芳

1、藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1) 133 液相色譜 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析頭孢拉定中的主要雜質(zhì)1 ，2 ，2 ，1，2*潘芳芳朱培曦黃巧巧楊偉峰( 1 浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，杭州 310014; 2 浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州 310004)摘要目的: 采用液相色譜 四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法( HPLC Q TOF MS) 分析頭孢拉定中主要雜質(zhì)并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。方法: 色譜柱為 Kromasil 100 5C18 ( 250 mm 4. 6 mm，5 m) ，流動(dòng)相為甲醇 10 mmolL 1 醋酸銨溶液( 30 70) ; 離子源:

2、 ESI 離子源; 掃描模式: 正離子掃描。結(jié)果: 本方法通過四極桿 飛行時(shí)間二級(jí)質(zhì)譜圖特征碎片的分析確定了頭孢拉定中1. 32% 的未知雜質(zhì)為雙氫頭孢拉定，同時(shí)推測(cè)該雜質(zhì)可能是中間體雙氫苯甘氨酸中的雜質(zhì)( 四氫苯甘氨酸) 參與合成引進(jìn)的。結(jié)論: 本方法鑒定了頭孢拉定中的 1 個(gè)未知雜質(zhì)，進(jìn)而可以對(duì)藥品雜質(zhì)控制和工藝優(yōu)化提供參數(shù)。關(guān)鍵詞: 內(nèi)酰胺抗生素; 頭孢拉定; 有關(guān)物質(zhì); 雙氫頭孢拉定; 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定; 液相色譜 四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法; 高分辨率; 安全監(jiān)測(cè)中圖分類號(hào): R917文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A文章編號(hào): 0254 1793( 2013) 01 0133 06HPLC Q TOF M

3、S identification of major impurities in cefradine1 ，2 ，2 ，1，2*PAN Fang fangZHU Pei xiHUANG Qiao qiaoYANG Wei feng( 1 College of Chemistry Engineering and Materials Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China; 2 Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou 310004，China)Ab

4、stractObjective: To establish an HPLC Q TOF MS method for the identification of major impurities incefradine Methods: The HPLC was performed on a Kromasil 100 5C18 column( 250 mm 4. 6 mm，5 m) with methanol 10 mmolL 1 a mmonium acetate ( 30 70) as mobile phase Data was collected under positive ion mo

5、des with ESI as ion resource Results: The method identified an impurity with the content of 1. 32% as di-hydrocefradine based on analysis the feature fragmentation from Q TOF It was speculated that the impurity was introduced by intermediate dihydrophenylglycine impurities involved in the synthesis

6、process Conclusion: The method identified an unknown impurity in cefradine，and thus provide reference to its quality control and process optimizationKey words: lactam antibiotics; cefradine; related compounds; dihydrocefradine; impurity structure identification; HPLC Q TOF MS; high resolution; safet

7、y monitoring頭孢拉定( cefradine，結(jié)構(gòu)見圖 1) 是第 1 代頭孢菌素類中一種廣譜、耐酶抗生素，用于治療產(chǎn)青霉素酶金葡菌及某些革蘭陰性菌感染，臨床應(yīng)用本品不良反應(yīng)的發(fā)生率約為 6% ，腹瀉、惡心、嘔吐等胃腸1。頭孢拉定中的雜質(zhì)道反應(yīng)較為多見，次為藥疹2，故雜質(zhì)研究是 內(nèi)酰胺可能導(dǎo)致其不良反應(yīng)類抗生素的重要研究內(nèi)容之一。 內(nèi)酰胺類抗生素一般由微生物發(fā)酵、純化、精制以及化學(xué)修飾等過程制得，與一般化學(xué)合成藥物相比生產(chǎn)過程更加復(fù)雜，其純度一般也較化學(xué)藥品低，而且該類抗生素對(duì)熱、光和濕的穩(wěn)定性較差，因此更應(yīng)該對(duì)其雜質(zhì)進(jìn)行圖 1頭孢拉定結(jié)構(gòu)圖Fig 1The structure of

8、 cefradine*通訊作者Tel: E mail: ywfhz 163. com 134 藥物分析雜志 Chin JPharm Anal 2013，33( 1)3 4。王維等應(yīng)用凝膠色譜法測(cè)定了頭min 1，柱溫 30 ，檢測(cè)波長 254 nm，進(jìn)樣體積 10 L。深入研究5。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，2. 2質(zhì)譜條件 質(zhì)譜儀使用 ESI 離子源，在正離子孢拉定膠囊中的高分子雜質(zhì)頭孢拉定中的主要雜質(zhì)還有頭孢氨芐、雙氫苯甘模式下采集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采集范圍 m /z 100 1800，離氨酸和 7 氨基去乙酰氧基頭孢烷酸 ( 7 AD-子源前進(jìn)樣分流比為 3 1。毛細(xì)管電壓: 3.

9、8 kV; 錐CA) 6 7?？纂妷? 65 V; 噴霧氣壓: 0. 24 MPa; 干燥氣( 氮?dú)?中國藥典 2010 年版二部收載了頭孢拉定的有流量: 10 Lmin 1 ; 干燥氣溫度: 350 ; 裂解電壓7，并對(duì)上述已知雜質(zhì)含量用外標(biāo)150 V。關(guān)物質(zhì)檢查方法法進(jìn)行了控制，但在實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)有一主要雜質(zhì)成分2. 3溶液的制備不明。為此運(yùn)用高分辨率串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)此未知雜質(zhì)2. 3. 1供試品溶液 精密稱取頭孢拉定約 20 mg，進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確定，提出其質(zhì)譜可能的碎裂機(jī)理，推測(cè)置于 20 mL 量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖其可能的來源，并為藥物的雜質(zhì)控制和工藝優(yōu)化提勻，即得。供參數(shù)。2.

10、 3. 2對(duì)照溶液 取供試品溶液 1. 0 mL，置 2001儀器與試藥mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。1. 1儀器Agilent 1290 HPLC 高效液相色譜儀、2. 3. 3定位溶液 分別取對(duì)照品 7 ADCA、雙氫Agilent 6538 Q TOF 質(zhì)譜儀、Mettler AE240 電子分苯甘氨酸、頭孢氨芐、頭孢拉定約 20 mg，分別置析天平。20 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，1. 2試藥甲醇( 色譜純，Merck 公司) ，醋酸銨和即得。醋酸( 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司) ，Milli2. 4實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Q 純化水，頭孢拉定( 寧波大紅鷹藥

11、業(yè)有限公司提根據(jù)“2. 1”項(xiàng)下色譜條件分析樣品得到色譜供，批號(hào) 051008 20173) ，對(duì)照品 7 ADCA( 批號(hào)圖( 圖 2) 。根據(jù)定位結(jié)果分析得到圖中 1、2、3 號(hào)30416 200605) 、頭孢拉定( 含量 91. 8% ，含頭孢氨峰分別是頭孢氨芐、頭孢拉定和未知雜質(zhì)，其中標(biāo)芐 1. 0% ，批號(hào) 30427 200306 ) 、頭孢氨芐 ( 含量示框內(nèi)的峰中有 7 ADCA 和雙氫苯甘氨酸，框內(nèi)94. 4% ，批號(hào) 130408 200710) 、雙氫苯甘氨酸( 含7頭孢拉定質(zhì)量的峰在中國藥典 2010 年版二部量 98. 8% ，批號(hào) 130434 200202) 均

12、購自中國食品標(biāo)準(zhǔn)中主要采用雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行定位和測(cè)定，此藥品檢定研究院。次研究未對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的分析。以 0. 5% 的自2方法與結(jié)果身對(duì)照法計(jì)算樣品中保留時(shí)間為 15. 163 min 的雜2. 1色譜條件采用 Kromasil 100 5C18 ( 250 mm 質(zhì)含量達(dá) 1. 32% ，ICH 提出任何未知雜質(zhì)限度超，) 色譜柱，流動(dòng)相為甲醇 1過 0. 1% ，應(yīng)對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確定和生物安全性4. 6 mm 5 m 10 mmolL8 9醋酸銨( 用醋酸調(diào)節(jié) pH 至 4. 0) ( 3 7) ，流速 1. 0 mL。驗(yàn)證圖 2樣品的液相色譜圖Fig 2Chromatogram of

13、sample藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1) 135 取“2. 3”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析得到質(zhì)則三者含有奇數(shù)個(gè)氮原子; 三者都具有加 1 的同位譜圖( 圖 3、4) ，并且將分子離子峰及各碎片離子的素峰，且相對(duì)豐度分別為 19. 9% 、18. 8% 、19. 7% ，8 9結(jié)果分別列于表+實(shí)際值與理論值的誤差計(jì)算根據(jù)表 1 中的M + H 結(jié)構(gòu)式得到的分子式計(jì)算理1、表 2 中。從圖 3 可以看出，一級(jí)質(zhì)譜中頭孢氨芐論的相對(duì)豐度均為 19. 6% 和不飽和度為 10、9、8。從有穩(wěn)定的加氫峰 m /z 348. 1017 和加鈉峰 m /z圖 4

14、 可以看出，在設(shè)定的 ESI 條件下三者二級(jí)質(zhì)譜中370. 0833，頭孢拉定有穩(wěn)定的加氫峰 m /z 350. 1162的分子離子峰依稀可見且得到的碎片離子信息清晰和加鈉峰 m /z 372. 0992，未知雜質(zhì)有穩(wěn)定的加氫峰可見，碎片斷裂信息主要集中在不穩(wěn)定的 內(nèi)酰胺m /z 352. 1323 和加鉀峰 m /z 390. 0885，表明化合物四元環(huán)、氨基、酰胺鍵。比較表 1、2 的計(jì)算結(jié)果，表明A、B、C 的相對(duì)分子質(zhì)量為 347、349、351，根據(jù)氮規(guī)理論值與實(shí)驗(yàn)值非常接近，偏差均小于5 10 6 。圖 3樣品中 3 個(gè)化合物在正離子模式下獲得的一級(jí)質(zhì)譜圖Fig 3MS1 spec

15、tra of the three compounds in the test under positive ion modeA 頭孢氨芐( cephalexin)B 頭孢拉定( cefradine)C 未知雜質(zhì)( unknown impurity)圖 4樣品中 3 個(gè)化合物在正離子模式下獲得的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig 4MS2 spectra of the three compounds in the test under positive ion modeA 頭孢氨芐( cephalexin)B 頭孢拉定( cefradine)C 未知雜質(zhì)( unknown impurity) 136 藥物分析雜志

16、 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1)表 1一級(jí)質(zhì)譜中分子離子峰理論值與實(shí)驗(yàn)值的偏差計(jì)算Tab 1 Deviation calculation of theoretical values and experimental values of molecular ion in MS1化合物( compounds)M + H+實(shí)驗(yàn)值( experimental values) m /z理論值( theoretical values) m /z偏差( deviation) / 10 6頭孢氨芐( cephalexin)C16H18N3O4S348. 1017348. 10131

17、.1頭孢拉定( cefradine)C16H20N3O4S350. 1162350. 1169 2.0未知雜質(zhì)( unknown impurity) *C16H22N3O4S352. 1323352. 1326 0.8* 其分子式由軟件根據(jù)分子離子峰以及同位素峰計(jì)算而來，匹配分值為 98. 67( The molecular formula is calculated by software according to the molecular ion peak and isotope peak and the matching score is 98. 67)表 2二級(jí)質(zhì)譜中主要的碎片離子峰

18、理論值與實(shí)驗(yàn)值的偏差計(jì)算Tab 2Deviation calculation of theoretical values and experimental values of the main fragment ion in MS2化合物( compound)M + H+實(shí)驗(yàn)值( experimental values) m /z理論值( theoretical values) m /z偏差( deviation) 10 6頭孢氨芐( cephalexin)C16H18N3O4S348. 1005348. 1013 2. 3C10H8NO2174. 0550174. 05500.0C6H8NO

19、2158. 0269158. 02700.6C7H8N106. 0654106. 06512.8頭孢拉定( cefradine)C16H20N3O4S350. 1170350. 11690.3C16H17N2O4S333. 0906333. 09040.6C10H13N2O2193. 0970193. 0972 1. 0C10H10NO2176. 0707176. 07060.6C6H8NO2158. 0270158. 02700.0C8H10NO136. 0755136. 0757 1. 5C7H10N108. 0811108. 08082.8未知雜質(zhì)( unknown impurity)C

20、16H22N3O4S352. 1334352. 13262.3C16H19N2O4S335. 1075335. 10604.5C10H12NO2178. 0861178. 0863 1. 1C6H8NO2158. 0272158. 02701. 3C7H12N110. 0968110. 09643. 63討論m /z 108. 0811碎 片 中 的 推 斷 是 成 立 的，m /z3. 1頭孢拉定裂解分析 由于 3 個(gè)化合物的不飽108. 0811 碎片結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，側(cè)鏈中無法再增加 2和度依次差 1，結(jié)合表 2 和圖 4 分析可得，3 個(gè)化合個(gè) H 原子，那么同樣可以推測(cè)增加 2 個(gè)雙鍵的

21、結(jié)物具有同一的 m /z 158. 0270 的離子碎片，推斷該碎構(gòu)為頭孢拉定中環(huán)己二烯基換成環(huán)己烯基的結(jié)構(gòu)片是由 內(nèi)酰胺環(huán)斷裂產(chǎn)生，故 H 原子的增加或即為雙氫頭孢拉定?？赡苁?1、2 位雙鍵打開，也減少與此碎片無關(guān)，即此結(jié)構(gòu)為三者都有; 根據(jù)圖 4有可能 4、5 位雙鍵打開，還有 2 種雜質(zhì)同時(shí)存在，中方框標(biāo)示可以看出增加或減少 2 個(gè) H 原子發(fā)生雙氫頭孢拉定的可能裂解機(jī)理見圖 6?？梢钥闯鲈陬^孢拉定 m /z 108. 0811、176. 0707、333. 0906 碎四極桿 飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜具有高分辨率、高準(zhǔn)片中，同時(shí)可以說明這 3 個(gè)碎片中有共同的結(jié)構(gòu)片確度，可以獲得待測(cè)物質(zhì)的準(zhǔn)

22、確分子量，并產(chǎn)生可段。根據(jù)頭孢拉定的結(jié)構(gòu)推測(cè) m /z 108. 0811 碎片能的分子式，根據(jù)二級(jí)裂解碎片信息推測(cè)分子可的來源如圖 5 所示，已知頭孢氨芐結(jié)構(gòu)是頭孢拉定能的結(jié)構(gòu)，為藥物雜質(zhì)鑒定提供一種快速、靈敏、的環(huán)己二烯基換成苯基，故減少 2 個(gè) H 原子發(fā)生在10 13。準(zhǔn)確的方法圖 5頭孢拉定其中 1 條裂解途徑Fig 5Proposed fragmentation pathway of cefradine藥物分析雜志 Chin J Pharm Anal 2013，33( 1) 137 圖 6雙氫頭孢拉定可能的裂解機(jī)理Fig 6Plausible fragmentation pathw

23、ay for dihydrocefradine3. 2 測(cè)未知雜質(zhì)的可能來源 根據(jù)參考文獻(xiàn)15的合成路線，可以推測(cè)雜質(zhì)雙氫頭孢拉定是由于初始原料雙氫苯甘氨酸中的雜質(zhì)參與合成引進(jìn)的，雙16，氫苯甘氨酸由苯甘氨酸還原而來在還原過程中圖 7雙氫苯甘氨酸的合成Fig 7The synthesis of dihydrophenylglycine故作為頭孢拉定合成的重要中間體的雙氫苯甘氨酸的制備工藝和純化工藝有待進(jìn)一步探索和改善，使雙氫苯甘氨酸的純度更高才能降低頭孢拉定中該雜質(zhì)的組成，為用藥安全提供源頭上的保證。參考文獻(xiàn)1 WANG Wei( 王維) Determine polymer impurity

24、in cefradine cap-sule with gel chromatography( 頭孢拉定膠囊中高分子雜質(zhì)的凝膠色譜法測(cè)定) Chin Hosp Pharm J( 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志) ，2005，25( 7) : 6852 OU Bei li( 歐貝麗) ，JIANG Li qun( 姜力群) ，ZHANG Yu( 章宇) ，et al The impurity study and quality control of lactam anti-biotics( 內(nèi)酰胺類抗生素藥物的雜質(zhì)分析及其質(zhì)量研究) Chin J Anal Lab( 分析實(shí)驗(yàn)室) ，2007，26( 10) :

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33、ine phosphate in Xiaochuan tablets( RP HPLC 法同時(shí)測(cè)定哮喘片中嗎啡、鹽酸麻黃堿、磷酸可待因的含量) Chin J Pharm Anal( 藥物分析雜志) ，2009，29( 5) : 73113 ZHENG Shu feng ( 鄭淑鳳) ，YANG Hong juan ( 楊紅娟) ，LI Qun xin ( 李群鑫) Determination of codeine phosphate in com-pound liquorice tablets by HPLC( 高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方甘草片中磷酸可待因含量) Chin Pharm Aff (

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