復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米外源蛋白的時(shí)空表達(dá)規(guī)律

1、復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米外源蛋白的時(shí)空表達(dá)規(guī)律自 998 年首例轉(zhuǎn)基因玉米被批準(zhǔn)商業(yè)化以來， 轉(zhuǎn)基因玉米種 植面積不斷擴(kuò)大， 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展， 新一代轉(zhuǎn)基因植物 及復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因植物不斷涌現(xiàn)。 20年，全球共有 6 個(gè)國家種 植轉(zhuǎn)基因玉米，種植面積達(dá)到 5 00萬hm2占全球玉米種植總 面積的 32%?？瓜x耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米種植面積近2年來不斷增長，202年種植面積達(dá)2 029萬hm2比20年增長09% 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米已逐漸取代了單一性狀轉(zhuǎn)基因玉米， 成為市 場主導(dǎo) 2 。然而，轉(zhuǎn)基因大面積種植后引起的生態(tài)環(huán)境安全等 問題也引起了人們的廣泛關(guān)注 3-4 。因此，對(duì)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因

2、玉米在不同栽培條件下外源蛋白時(shí)空表達(dá)成為轉(zhuǎn)基因環(huán)境安全 評(píng)價(jià)的關(guān)注焦點(diǎn)之一 5 。本試驗(yàn)材料為孟山都公司選育的DK007YGRRDK008YGRRNC6304YGR等3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉 米品種，這3個(gè)品種均以MON8903和NK603為親本雜交選育而 成，具有來自父本的 CryA05 和 Cry2Ab2 殺蟲蛋白基因和母本的 C4-ESS蛋白外源基因，表達(dá)雙價(jià)抗蟲和耐除草劑的復(fù)合性狀。 本研究采用ELISA方法對(duì)3個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米不同時(shí)期、 不 同組織進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的實(shí)時(shí)檢測， 研究復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米 抗蟲和耐除草劑基因的時(shí)空表達(dá)規(guī)律。 同時(shí)， 以本品種的同型對(duì) 照品種以及當(dāng)?shù)刂髟云贩N

3、作為陰性對(duì)照開展外源蛋白組織表達(dá) 測定，以期闡明雜交種外源蛋白時(shí)空表達(dá)規(guī)律， 為雜交選育復(fù)合 性狀轉(zhuǎn)基因玉米環(huán)境安全評(píng)價(jià)方案提供參考依據(jù)。材料與方法材料和試劑陽性轉(zhuǎn)基因玉米材料 3 個(gè)，品種名為 DK007YGR、RDK008YGR、RNC6304YGRR同型對(duì)照陰性玉米樣品分別為 DK007 DK008和NC6304由美國孟山都公司提供。當(dāng)?shù)刂髟云贩N對(duì)照 ZD958和 C69為當(dāng)?shù)卮筇锿茝V材料，購于種子公司。 3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米材料 均為MON89034雙價(jià)抗蟲）和NK603（耐除草劑）雜交選育的復(fù) 合性狀品種。主要化學(xué)試劑采購于 Sigma 公司。2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)和取樣方法2 小區(qū)設(shè)計(jì)NC630

4、4YGR和其同型對(duì)照NC6304主栽品種對(duì)照ZD958種 植于吉林省公主嶺市；DK007YGRRDK008YGRR同型對(duì)照DK007 DK008主栽品種C69種植于廣西；每小區(qū)面積為 30 m2（6 mX5 m）， 3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。22 播種時(shí)間與方法吉林省 202 年 5 月 2 日播種， 常規(guī)播種方式， 播種后按當(dāng)?shù)?常規(guī)耕作管理模式進(jìn)行管理。廣西壯族自治區(qū) 202 年 4 月 20 日 播種，常規(guī)播種方式， 播種后按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)耕作管理模式進(jìn)行管理。23 取樣方法3 分抽雄前、抽絲、灌漿初期和乳熟末期 4個(gè)時(shí)期取樣，取樣部位：苗期葉片、心葉期葉片、花粉與花絲、籽粒、雌穗頂 端和莖髓

5、，取樣后用液氮速凍，-80 C低溫冰柜保存。3ELISA試驗(yàn)方法3樣品處理和蛋白抽提當(dāng)在田間對(duì)測試材料的各個(gè)組織進(jìn)行采樣后， 當(dāng)天放入實(shí)驗(yàn) 室-80 C低溫冰箱中進(jìn)行保存，直至全部樣品米集完畢，開始樣 品處理。樣品組織在處理時(shí)先粉碎成均勻的粉末樣本。 樣品稱重 后，對(duì)CryA05、Cry2Ab2、C4-ESS蛋白用X BST進(jìn)行提取。提取 的蛋白樣品在6 h內(nèi)進(jìn)行測試時(shí)，保存在 4 C條件下，否則用 小管分裝保存在-80 C條件下。32C4-ESS蛋白檢測方法單克隆小鼠抗 C4 ESS抗體用含50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3 緩沖液和 05 mol/L NaCl 的溶液稀釋至 2

6、0 g/mL ，每孔加 00 L 稀釋的抗體在96微孔板上固定，放入4 C冰箱孵育8 h以上。 用X BST洗板3次，分別在各孔對(duì)應(yīng)加入 C4-ESS蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、 樣本提取液、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品緩沖液00 L/孑L, 37 C下孵育h。秸稈、葉片、花粉、花絲和根樣品提取液使用XBST/0% BSA溶液稀釋；籽粒樣品使用X TBA稀釋。X BST洗板3次，每孔加 入00 L過氧化物酶偶聯(lián)的抗 C4ESS抗體，37 C孵育h。用X BST 洗板3次，向孔內(nèi)加入00 L TMB,室溫靜置0 min，加入00 L 6 mol/L H3O4終止酶反應(yīng)。C4-ESS蛋白水平定量通過繪制 0456 4600 ng

7、/mL的C4-ESS蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線用內(nèi)插法確定。33Cry2Ab2蛋白檢測方法小鼠抗Cry2Ab2的捕獲抗體用包被緩沖液（92卩L單克隆 抗體加到0 mL 50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3的緩沖液）稀釋，最 終濃度為2卩g/mL,每孔加00卩L稀釋抗體在96微孔板上固 定，放入4 C冰箱孵育8 h以上。用X BST洗板3次，分別在 各孔對(duì)應(yīng)加入00卩L Cry2Ab2蛋白標(biāo)準(zhǔn)液、樣品提取液、標(biāo)準(zhǔn) 品和樣品緩2沖液（00卩L/孔），37 C孵育h o X BST洗板3 次，每孔加入00 U L生物素偶聯(lián)的山羊抗 Cry2Ab2抗體和 NeutrAvidin-HR （ ierce ）來

8、檢測捕獲的 Cry2Ab2oX BST 洗板 3次，每孔加入 00卩L TMB顯色。向各孔中加入 00卩L 6 mol/L H3O4終止酶活反應(yīng)。通過繪制濃度為0297000 ng/mL的Cry2Ab2蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，用內(nèi)插法完成定量。34CryA05蛋白檢測方法 2山羊抗CryA05的捕獲抗體用包被緩沖液（50 mmol/L Na2CO3/NaHCO350 mmol/L NaCl 稀釋至終濃度 3 u g/mL，每孔 加00 u L稀釋抗體在96孔微孔板上固定，放入 4 C冰箱中孵 育8 h以上。用X BST洗板3次。進(jìn)行籽粒樣本分析時(shí)，向各孔 加00 u L含9%兌脂奶粉（NFDM的X BS

9、T再進(jìn)行封閉，37 C 孵育3090 min，用X BST洗板3次，其他組織樣本不進(jìn)行此 步驟。分別在各孔對(duì)應(yīng)加入 00 u L CryA05蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品提 取液，37 C孵育h。用X BST洗板3次，每孔加入00 u L生 物素偶聯(lián)的山羊抗 CryA05抗體和NeutrAvidin-HR （ierce ）來 檢測捕獲的CryA05。用X BST洗板3次，每孔加入00卩L HR底 物3, 3，5, 5 -四甲基聯(lián)苯胺（TMB顯色。向各孔中加入 00卩L 6 mol/L H3O4終止酶活反應(yīng)。通過繪制 04384000 ng/mL CryA05 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,用內(nèi)插法完成定量。4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和

10、分析ELISA研究中采用Bio-rad iMarkTM微孔板吸收光酶標(biāo)儀進(jìn) 行檢測。CryA05、Cry2Ab2、C4 ESS蛋白用波長450 nm時(shí)的吸 光度和波長655 nm時(shí)的參考吸光度來確定其在樣品中的表達(dá)量， 在計(jì)算時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)插法。蛋白的標(biāo)準(zhǔn)濃度用四參數(shù)邏輯曲線模型確定曲線,用內(nèi)插法確定 CryA05、 Cry2Ab2、C4 ESS蛋白在各樣品中的含量，并將結(jié)果由ng/mL轉(zhuǎn)化為卩g/g （鮮質(zhì)量）。數(shù)據(jù)用ELISA軟件進(jìn)行歸納分析。2 結(jié)果與分析2 組織中外源蛋白表達(dá)的差異顯著性分析本試驗(yàn)的 3 個(gè)復(fù)合性狀品種分別在吉林省和廣西壯族自治 區(qū)兩地栽種，3個(gè)復(fù)合

11、性狀轉(zhuǎn)化體，均為 MON8903和NK603的 雜交選育品種。 3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米材料的遺傳背景的外源基因具有 來自父本 MON89034勺雙價(jià)抗蟲基因（WTBXSTBXCryA05、 Cry2Ab2WTBZSTBZ）和來自母本的 NK603耐除草劑基因（WTBXSTBXC4-ESSWTBZSTBZ）。采樣時(shí)期分別為苗期（V4）、心葉期（V8）、吐絲期（R）和灌漿期（R3）,各時(shí)期 采集的組織為V4葉片、V8葉片、R花粉和花絲，R3籽粒、穗尖（雌穗頂端）、莖髓（雌穗著生節(jié)莖稈），在各小區(qū)中對(duì)每個(gè)組 織材料隨機(jī)選取 5 株進(jìn)行蛋白提取。對(duì) 3 個(gè)平行小區(qū)開展 3 次重復(fù) ELISA 檢測，根據(jù) 40

12、5 nm 吸 光度的數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)照其蛋白在轉(zhuǎn)基因玉米植株中的外 源蛋白表達(dá)含量。表統(tǒng)計(jì)分析了 3 個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因品種的 C4-ESS 蛋白在 7 個(gè)不同生長時(shí)期的組織中的表達(dá)情況， 結(jié)果表明， 同一組織內(nèi)的 蛋白表達(dá)在品種間多差異不顯著， 特別是葉片組織， V4 葉片（新 鮮）和 V8 葉片（新鮮）的 C4-ESS 蛋白持續(xù)穩(wěn)定地高表達(dá)，均 約為35卩g/g，其他組織在品種間或有差異，但各組織間表現(xiàn) 了更大的差異顯著性，方差分析結(jié)果見表 2。表 3 分析了 3 個(gè)復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因品種的 CryA05 抗蟲蛋白在 7 個(gè)不同生長時(shí)期組織中的表達(dá)，該抗蟲蛋白在各組織中表達(dá)差 異較大。統(tǒng)計(jì)分析

13、結(jié)果表明， 3 個(gè)品種同一組織蛋白表達(dá)量不同， 但差異均不顯著，而組織間 V4葉片、V8葉FL ）可見，復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)化體組織表達(dá)外源蛋白在轉(zhuǎn)化個(gè)體間變 異不明顯， 其表達(dá)量與表達(dá)蛋白種類有關(guān)。 組織間的差異大于品 種差異，栽培種植條件也是影響其蛋白表達(dá)的原因之一。22 抗蟲和耐除草劑基因在轉(zhuǎn)化體中的蛋白表達(dá)由圖、圖 2、圖 3 可見，轉(zhuǎn)基因植株中耐除草劑蛋白 C4-ESS 在V4葉片、V8葉片、花粉、莖髓、穗尖、籽粒中表達(dá)量均高于 CryA05、 Cry2Ab2 抗蟲蛋白，只有在花絲中 3 種蛋白表達(dá)量均較低的情況下， Cry2Ab2 蛋白表達(dá)量略高于 C4-ESS。CryA4、Cry2Ab2

14、 2 種抗蟲蛋白的表達(dá)量在 3 個(gè)品種中表現(xiàn) 趨勢也較明顯，CryA05抗蟲蛋白在V4葉片、V8葉片、花粉、穗 尖組織中的表達(dá)量高于 Cry2Ab2抗蟲蛋白；僅在3個(gè)品種的花絲、 廣西品種 DK007YGR和DK008YGR莖髓和籽粒中，Cry2Ab2表達(dá) 的抗蟲蛋白量略高于 CryA05。因此， 3 個(gè)品種顯示的耐除草劑和抗蟲蛋白的組織表達(dá)規(guī)律 一致，其外源蛋白的表達(dá)量可能與在其親本來源有關(guān)， 在親本中 的基因插入位置和表達(dá)調(diào)控可直接影響到其在雜交品種中的表 達(dá)。23 植物各組織中外源蛋白的鮮質(zhì)量含量如圖 4、圖 5、圖 6 所示， 3 個(gè)復(fù)合性狀品種 DK007YGR、RDK008YGRR

15、NC6304YGR在各組織中表達(dá)情況也顯示出較高的一致性，即營養(yǎng)器官組織（V4葉片、V8葉片）的外源蛋白表達(dá)量 均高于生殖器官（花絲、花粉、穗尖、籽粒、莖髓）。V4葉片中3種外源蛋白表達(dá)最高，V8葉片其次，這一結(jié)果可能與葉片 中可溶性蛋白含量較高有關(guān)。 2在3個(gè)轉(zhuǎn)化體中，NC6304YGR各時(shí)期的植物組織器官中CryA05蛋白表達(dá)量最高， DK007YGR其次，DK008YGR中表達(dá)相 對(duì)較低。在植物的營養(yǎng)器官中， NC6304YGR的Cry2Ab2蛋白表達(dá)量最高，而生殖生長階段中 NC6304YGR生殖器官（花絲、花粉、穗尖、籽粒、莖髓）中 Cry2Ab2蛋白表達(dá)量均低于 DK008YGRR

16、在苗期和心葉期，3種轉(zhuǎn)化體葉片中C4-ESS蛋白表達(dá)量最 高，其中V4葉片時(shí)期略大于V8葉片時(shí)期，這種情況可能與前期 轉(zhuǎn)化體篩選有關(guān)。 這一時(shí)期葉片的高表達(dá)量為草甘膦噴施效果提 供了有效保證。24 植物生長條件對(duì)轉(zhuǎn)化體外源蛋白組織表達(dá)的影響NC6304YGR是在吉林種植和栽培管理的玉米品種，DK007YGRR DK008YGRF在廣西栽培種，因此植株生長的環(huán)境條件有所不同。生長在吉林的NC6304YGRR勺CryA05蛋白表達(dá)量基本均大于生長于廣西的 DK007YGRFDK008YGRCry2Ab2 蛋白和C4-ESS蛋白表達(dá)量兩地各不相同，無明顯規(guī)律。復(fù)合性 狀轉(zhuǎn)基因品種各組織中的外源蛋白表

17、達(dá)量存在差異， 且在相同條 件栽種的DK007YGRJRDK008YGR蛋白表達(dá)量同樣存在差異，但 差異較小。3 結(jié)論與討論轉(zhuǎn)基因植株外源基因蛋白在不同生育期不同組織器官表達(dá) 不同 6 ，既可能與外界栽培條件有關(guān)，也可能與外源基因整合 的位點(diǎn)有關(guān) 7 。當(dāng)外源基因整合到與生長發(fā)育有關(guān)的基因附近， 外源基因的表達(dá)就會(huì)受生長發(fā)育基因調(diào)控序列的調(diào)控， 隨著生長 時(shí)期的不同而發(fā)生變化。本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因玉米各生長時(shí)期中，抗蟲 Bt 蛋 白含量均未明顯減少， 其抗蟲的表達(dá)量趨于穩(wěn)定， 能夠持續(xù)地進(jìn) 行抗蟲表達(dá)， 因此能夠達(dá)到更好的抗蟲效果。 在玉米不同生長發(fā) 育階段的組織中， 苗期葉片轉(zhuǎn)基因蛋白表

18、達(dá)量明顯高于心葉期葉 片。這可能與表達(dá)不同時(shí)期的環(huán)境條件有關(guān)， 也可能與發(fā)育階段 中基因的表達(dá)調(diào)控相互關(guān)聯(lián)。在苗期和心葉期，3種轉(zhuǎn)化體中，葉片C4-ESS蛋白表達(dá)量 最高，其中V4葉片時(shí)期略大于V8葉片時(shí)期，這種情況可能與前 期轉(zhuǎn)化體篩選有關(guān)。 這一時(shí)期葉片的高表達(dá)量為草甘膦噴施效果 提供了有效保證。 3 個(gè)復(fù)合性狀品種的 C4-ESS 2 蛋白均來源 于轉(zhuǎn)基因玉米品種NK603因此筆者認(rèn)為，通過雜交育種的復(fù)合 性狀轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體對(duì)其親本的安全評(píng)價(jià)可作為復(fù)合性狀雜交種 的安全評(píng)價(jià)的數(shù)據(jù)參考， 其外源基因表達(dá)可能直接決定親本多種 雜交后代中外源基因的表達(dá)。由于NC6304YGR是在吉林種植和栽培的管理玉米材料，DK007YGRRDK008YGR在廣西