論文：小檗堿、黃連生物總堿對(duì)AChE抑制作用特征研究

1、小檗堿、黃連生物總堿對(duì)ache抑制作用特征研究李淵 李昊坤 宋一驍 劉強(qiáng) 丁兵兵丁虹* 通訊作者：丁虹，女，1964，博士，教授，博導(dǎo)。主要研究方向：藥理毒理學(xué)。email:（武漢大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430072）摘要：目的：ache抑制劑的篩選與探究；方法：通過(guò)薄層分析法展開(kāi)樣品，利用顯色反應(yīng)判斷各樣品對(duì)ache的抑制作用；通過(guò)紫外法測(cè)定ache酶解產(chǎn)物在單位時(shí)間的生成量判斷各樣品對(duì)ache抑制作用的強(qiáng)弱；結(jié)果：小檗堿高劑量及黃連生物堿對(duì)ache的抑制率很高，且黃連生物堿的抑制率接近100%；結(jié)論：小檗堿高劑量及黃連生物堿對(duì)ache有較強(qiáng)的抑制作用。關(guān)鍵詞

2、：ache抑制劑 小檗堿 黃連生物堿 薄層分析法 紫外法 抑制率research into berberine,and berberine alkaloids on the characteristics of ache inhibition li yuan songyi xiao liu qiang ding bingbing li haokun ding hong * (college of pharmacy, wuhan university, wuhan 430072) abstract: objective: ache inhibitor screening and explorat

3、ion; methods: expand thin layer chromatography samples, using the samples to determine the color reaction of ache inhibition; by ache enzyme determination in the generation of the product in unit time the samples to determine the amount of the strength of ache inhibition; results: high-dose berberin

4、e and berberine alkaloids on the high rate of ache inhibition, and inhibition of berberine alkaloids close to 100%; conclusion: the high-dose berberine and berberine alkaloids have a strong inhibitory effect on ache. keywords: ache inhibitor, thin layer chromatography of berberine alkaloids berberin

5、e inhibition by uv method 據(jù)統(tǒng)計(jì)：美國(guó)ad患者為200-400萬(wàn)，全球1700-2500萬(wàn)，我國(guó)有關(guān)調(diào)查尚缺乏大系列、據(jù)最新城市普查結(jié)果，ad患病率高于血管性癡呆。在西方國(guó)家ad是繼心臟病、腫瘤和中風(fēng)之后，排在第四位的導(dǎo)致死亡的疾病。與ad相關(guān)的遞質(zhì)改變有乙酰膽堿系統(tǒng)、單胺系統(tǒng)、氨基酸類(lèi)和神經(jīng)肽遞質(zhì)，其中膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿類(lèi)遞質(zhì)的減少是ad的重要原因。臨床上主要適用膽堿酯酶抑制藥治療ad.黃連是一味具有廣泛藥效作用的中藥,在國(guó)內(nèi)外用于多種疾病的治療,且新的藥效又不斷被發(fā)現(xiàn)。而黃連的有效成分為小檗堿，有文獻(xiàn)報(bào)道小檗堿既有直接拮抗膽堿受體的作用,同時(shí)也可能通過(guò)抑制膽

6、堿酯酶活性發(fā)揮其擬膽堿樣作用。因此小檗堿有可能成為治療ad的有效藥物。利用通過(guò)紫外法測(cè)定ache酶解產(chǎn)物在單位時(shí)間的生成量判斷小檗堿對(duì)ache抑制作用的強(qiáng)弱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小檗堿高劑量及黃連生物堿對(duì)ache的抑制率很高，且黃連生物堿的抑制率接近100%；所以小檗堿高劑量及黃連生物堿對(duì)ache有較強(qiáng)的抑制作用，有可能成為新的治療ad的藥物。1 材料與方法紫外法觀察受試樣品對(duì)ache抑制作用1.1 材料1.1.1儀器與設(shè)備：移液器（200、1000l）ep（1、10ml）、量筒（10ml）。儲(chǔ)液瓶、玻璃棒、50ml、100ml容量瓶、棕色儲(chǔ)液缸（容量約100ml）、10ml、1.5mlep管若干、微量石

7、英比色皿、紫外分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、洗瓶、擦鏡紙若干、500ml量筒、ph試紙、玻璃棒、廢液缸、分析天平、稱(chēng)量紙若干、藥匙1.1.2原料與試劑：緩沖溶液a：ph8.0的tris-hcl（50mm）、緩沖溶液b：150ml含bsa0.1%的溶液、緩沖溶液c、atci底物溶液、dtnb溶液、加蘭他敏（用dmso稀釋成0.01mg/ml的溶液）、小檗堿（40g/ml 、20g/ml、10g/ml、5g/ml）、黃連生物總堿 （20g/ml、40g/ml）酶（將純酶用緩沖溶液b配制成濃度3iu/ml 10ml，臨用時(shí)配制）1.2方法 1.2.1在1.5ml ep管中依次加： 樣品bufferbdnt

8、bacti（混勻）ache酶（具體加入試劑順序和用量見(jiàn)如表1）。1.2.2所有試劑除酶外（防止酶在較高溫度下變質(zhì)）都放于37恒溫水浴鍋中恒溫。1.2.3混勻，30s后倒入比色皿中開(kāi)始測(cè)調(diào)零管加相同量buffer b代替酶入順序和用量 表1加入順序（l）空白調(diào)零空白對(duì)照石杉?jí)A甲調(diào)零管石杉?jí)A甲小檗堿小檗堿醇提取總堿調(diào)零管醇提取調(diào)零管總堿甲醇0100000000石杉?jí)A甲001001000000小檗堿000010010000醇提取000000100100堿提取00000000bufferb200100100100100100100100dtnb200200200200200200200200acti1

9、00100100100100100100100ache0100010001000100bufferb1000100010001000總體積600600600600600600600600薄層法觀察受試樣品對(duì)ache抑制作用2.1材料2.1.1儀器與設(shè)備：硅膠板（10cm20cm）一塊、研缽、展開(kāi)槽一只、三角噴瓶、普通點(diǎn)樣用毛細(xì)管、烘箱2.1.2原料與試劑：流動(dòng)相（氯仿、甲醇、氨水體積比12:7:1）、緩沖溶液a（ph8.0的tris-hcl）、底物atci（2mmol/l）和顯色劑dtnb（2mmol/l）混合液、酶液的制備（ache酶用bufferb稀釋至3u/ml）、小檗堿（40g/ml

10、、20g/ml、10g/ml、5g/ml）2.2方法2.2.1在薄層板底邊（預(yù)先活化）約2cm處，用毛細(xì)管輕輕畫(huà)線，從左到右一次點(diǎn)樣加蘭他敏（1mg/ml）、不同濃度受試樣品。點(diǎn)樣量約為20l，若一次不能點(diǎn)完，待干后再點(diǎn)；2.2.2展開(kāi)：層析缸中加入展開(kāi)劑2030ml，將薄層板放入層析缸，蓋上蓋子，使溶劑沿薄層板擴(kuò)散，至展開(kāi)前沿到薄層板上23cm取出，晾干；2.2.3酶顯色：將底物和顯色劑混合液裝入噴瓶，將液體吹到傾斜的薄層板上。注意吹氣均勻，最好從上到下吹兩次，從左到右吹兩次，而且要保證薄層板上無(wú)液體流下。待薄層板后，噴含酶緩沖溶液，觀察結(jié)果；2.2.4酶顯色結(jié)果評(píng)價(jià)：通過(guò)觀察受試樣是否出現(xiàn)

11、白斑，可判斷有無(wú)ache抑制活性。白斑一般15min左右消失；2.2.5生物堿顯色：待酶顯色后的薄層板晾干后，進(jìn)行生物堿顯色。先噴少量5%鹽酸，再?lài)姷饣G鉀，觀察斑點(diǎn)是否出現(xiàn)黃褐色，如果出現(xiàn)黃褐色，表明受試成分為生物堿。2結(jié)果紫外法觀察受試樣品對(duì)ache抑制作用 小檗堿高劑量及黃連生物堿對(duì)ache的抑制率很高，且黃連生物堿的抑制率接近100%，說(shuō)明小檗堿高劑量及黃連生物堿對(duì)ache有較強(qiáng)的抑制作用。表1溶劑空白對(duì)照(0g/ml)od抑制率%加蘭他敏(0.01mg/ml)0.011750.0077679.840.21小檗堿(5g/ml)0.050630.0195111.570.01小檗堿(10g/ml)0.036750.0105035.818.88小檗堿(20g/ml)0.035380.0301038.2129.28表2抑制率%組別60-3090-6090-30小檗堿(20g/ml)1.0014110.999661.003863小檗堿(40g/ml)0.9845220.9880.972606黃連生物堿(20g/ml)0.9801930.996710.976609黃連生物堿(40g/ml)0.9751320.993350.968258薄層法觀察受試樣品對(duì)ache抑制作用根據(jù)記錄圖片分析此實(shí)驗(yàn)失敗。3結(jié)論小檗堿高劑量及黃連生物堿對(duì)ache有較強(qiáng)的抑制作用，