弗氏檸檬酸桿菌TPL基因的體外擴(kuò)增論文

1、常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)報(bào)告（論文）別：制藥與生物工程技術(shù)系課題名稱：弗氏檸檬酸桿菌 TPL基因的體外擴(kuò)增指導(dǎo)教師：班級：生物制藥1021聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction簡稱PCR)是最常用的分子生物 學(xué)技術(shù)之一，通過變性、退火和延伸的循環(huán)來完成核酸分子的大量擴(kuò)增。本實(shí)驗(yàn)是以基因組DNA為模板，利用PCR技術(shù)從弗氏檸檬酸桿菌(Ci trobacter f reundii )中擴(kuò)增得到含有酪氨酸酚解酶(the Tyrosine Phenol Lyase簡稱TPL) 基因的有效DNA片段，得到大量的有效基因。PCR技術(shù)產(chǎn)生時(shí)間雖不長，卻以 驚人的速度廣泛應(yīng)用于

2、分子生物學(xué)各領(lǐng)域。PCR技術(shù)能夠快速特異地?cái)U(kuò)增任何目 的基因或DNA片段，它不僅可以用于基因分離、克隆和核酸序列分析，還可用 于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因多態(tài)性的分析、遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制探查、法醫(yī)鑒定等諸多方面。PCR技術(shù)已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各學(xué)科和研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞：弗氏檸檬酸桿菌TPL基因 PCR 擴(kuò)增AbstractPolymerase Chai n Reacti on (PCR) is one of the com mon tech niq ues in molecular biology, which can amplify

3、 nucleic acids through the cycle of den aturation, ann eali ng and exte nsion. Tyros ine phe nol lyase gen e-c ontaining DNA fragme nt was amplified from Citrobacter freun dii, get a lot of effective gene using PCR tech no logy. PCR tech no logy gen erati on time is not long, but it is widely used i

4、n various fields of molecular biology at an alarm ing rate. PCR tech no logy can quickly and specifically any desired gene or DNA fragme nt was amplified, It not only can be used for gene isolati on, cloning and DNA seque ncing an alysis can also be used for the con struct ion of muta nt and recomb

5、inant, the study of the regulati on of gene expression, gene polymorphism analysis, genetic disease and infectious disease diag no sis, tumor mecha nism explorati on The foren sic ide ntificati on, and many other aspects. PCR tech no logy has become a revoluti on on the methodology, it will greatly

6、promote the various disciplines of molecular biology and research progress.Key words： citrobacter freundii gene PCR TPL amplification1前言1.1絡(luò)氨酸酚裂解酶目錄錯(cuò)誤！未定義書簽1.2. PCR 技術(shù)41.3立題依據(jù)和研究內(nèi)容 4.41.3.1立題依據(jù)1.3.2研究內(nèi)容 .42實(shí)驗(yàn)原理52.1 SDS法制備基因組DNA52.2瓊脂糖凝膠電泳原理52.3 PCR反應(yīng)原理.6.3實(shí)驗(yàn)器材與步驟 83.1實(shí)驗(yàn)材料83.1.2實(shí)驗(yàn)試劑8.3.2實(shí)驗(yàn)儀器93.3實(shí)驗(yàn)步驟9

7、.3.3.1菌種培養(yǎng) 9.3.3.2 SDS法制備細(xì)菌基因組DNA103.3.3電泳檢測1.13.3.4 PCR錯(cuò)誤！未定義書簽。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果和注意事項(xiàng)144.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果14154.2分析及注意事項(xiàng)5結(jié)論1.5致謝錯(cuò)誤！未定義書簽。參考文獻(xiàn)161刖言1.1酪氨酸酚裂解酶左旋多巴又稱L-多巴，為酪氨酸的羥化物，在體內(nèi)是左旋酪氨酸合成兒茶 酚胺的中間產(chǎn)物。左旋多巴一直是帕金森病治療的金標(biāo)淮。在帕金森癥狀的治 療中,左旋多巴比其他所有藥物都更有效，這可能是由于其產(chǎn)物（多巴胺）是一種 能同時(shí)作用于紋狀體內(nèi)兩種多巴胺受體的生理性神經(jīng)遞質(zhì)，而許多激動(dòng)劑僅僅激活D2受體。引起異動(dòng)和癥狀波動(dòng)雖與應(yīng)用左旋多巴有關(guān)

8、，但其根本原因是黑 質(zhì)的嚴(yán)重破壞。未來左旋多巴新給藥方法的思路包括應(yīng)用藥物的新劑型，如經(jīng)皮鉆貼劑、鼻腔噴霧劑、咀嚼片以及緩釋劑等 。L-DOPA的衍生物多巴胺是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，由于多巴胺不能透過血腦屏障進(jìn)入腦組織，所以不能通過補(bǔ)充多巴胺來治療帕金森氏病，而L-DOPA可以通過血腦屏障，并在腦組織中脫羧形成多巴胺，從而使腦組織中多巴胺含量 增加而達(dá)到治療的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴治療PD獲得明顯療 效2。L-DOPA及復(fù)方左旋多巴（如美多芭）已成為治療常見老年病一一帕金森氏病的主要藥物3,4。1.2 L-DOPA生產(chǎn)的國內(nèi)外研究進(jìn)展1911年，Casimir Funk在

9、實(shí)驗(yàn)室中第一次成功合成 D,L-DOPA。1913，MarcusGugge nheim從蠶豆的豆莢中第一次分離提取到天然存在于植物體內(nèi)的 L-DOPA2。綜合國內(nèi)外研究狀況，目前，L-DOPA主要通過從植物中提取、 化學(xué)法合成以及微生物酶法轉(zhuǎn)化等方法生產(chǎn)獲得。上世紀(jì)70年代初，國外化學(xué)法合成L-DOPA的年產(chǎn)量已達(dá)150噸，但由化學(xué)法所合成出來的產(chǎn)物是 D-型和 L-型的混合物，而D-DOPA會引起人體毒性反應(yīng)5，因此應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床之前 必須通過控制旋光度的方法來減少 D-DOPA的影響。解決此問題的最好辦法是 使D-型和L-型多巴完全分開，但 D-型和L-型多巴的拆分非常困難。所以越來 越多

10、的研究者開始尋求新的L-DOPA獲得途徑。1.3生物合成L-DOPA上世紀(jì)60年代，國外許多學(xué)者開始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。Larway和Eva ns首次在嗜酪氨酸微螺菌(Microspiratyrasi natica )中發(fā)現(xiàn)了與 L-DOPA形成有關(guān)的酪氨酸酶 。隨后，John等在蠟狀芽抱桿菌(Bucillus cereus) 中也發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶，并用來生產(chǎn) L-DOPA。為了提高L-DOPA產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化 率，研究者們對微生物酶法合成 L-DOPA的工藝方法進(jìn)行了大量研究。酪氨酸酚裂解酶，又名 &酪氨酸酶，以磷酸吡哆醛為輔酶，TPL可以催化 L-酪氨酸發(fā)生3-消去反應(yīng)生成苯

11、酚、丙酮酸和氨。由于這個(gè)反應(yīng)是可逆的，將 鄰苯二酚代替苯酚后，可由鄰苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些學(xué)者開始運(yùn)用基因工程 的手段從含有TPL基因的野生菌株染色體 DNA中克隆得到TPL基因片段，將 其連接到不同的載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。1.2 PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymeras chain reaction,簡稱PCR)是近十幾年發(fā)展和 普及最迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一， 是一項(xiàng)在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的 DNA 片段的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，并且可與其他分子生物 學(xué)方法和免疫學(xué)方法相結(jié)

12、合應(yīng)用，使其敏感性和特異性都大大增強(qiáng)。由于PCR對世界生物醫(yī)學(xué)研究的巨大推動(dòng)作用，其發(fā)明者Saiki因而獲得1992年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。隨著生命科學(xué)和經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，人們對醫(yī)藥水平的要求在不斷的提高。PCR技術(shù)以驚人的速度廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)各領(lǐng)域。PCR技術(shù)能夠快速特異地?cái)U(kuò)增任何目的基因或 DNA片段，并很容易使得微微克(pg)水平的起始物 達(dá)到毫微克(ng)水平的量。它不僅可以用于基因分離、克隆和核酸序列分析， 還可用于突變體和重組體的構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控的研究、基因多態(tài)性的分析、 遺傳病和傳染病的診斷、腫瘤機(jī)制探查、法醫(yī)鑒定等諸多方面。PCR技術(shù)已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將大大推動(dòng)分子生物

13、學(xué)各學(xué)科和研究進(jìn)展。PCR可以由體外酶促合特異 DNA片段，通過高溫變性、低溫退火及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的基因得以迅速擴(kuò)增。其主要步驟是：待擴(kuò)增DNA于高溫下解鏈成為單鏈模板；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸 引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合；DNA聚合酶在72 C將單核苷酸從引物3端開始摻入，沿模板5一方向延伸，合成DNA新股。數(shù)方式增加，經(jīng)過25-30次周期之后,105 倍，一般可達(dá) 106-107。實(shí)際上至少可擴(kuò)增由于每一周期所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，所以 PCR產(chǎn)物以指 理論上可增加109倍，面溫變性 IV中溫延仲AIIIIT丄 I” m

14、rr基因擴(kuò)增示蕙圖1.3本課題的立題依據(jù)和研究內(nèi)容1.3.1立題依據(jù)酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine Phenol-lyase TPL，EC 4.1.99.2)也稱禺酪氨酸 酶，在生物體內(nèi)催化L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物體外可將 苯酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸，而L-酪氨酸常作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑、苯丙酮尿 癥患者的必需氨基酸，是L-多巴的重要制備原料。此外，該酶在磷酸吡哆醛的 作用下，能夠催化一系列的 a B消除反應(yīng)、B取代反應(yīng)以及a B消除反應(yīng)和 消旋反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)。因此TPL是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)的酶類，解決它的大規(guī) 模工業(yè)化生產(chǎn)是一個(gè)迫在眉睫的問題。本課題應(yīng)用分子生物學(xué)手段，通

15、過PCR體外擴(kuò)增技術(shù)，體外合成目的基因，并擴(kuò)大培養(yǎng)，得到目標(biāo)產(chǎn)物，簡化了生產(chǎn)過程，為生物制劑的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的借鑒。1.3.2研究內(nèi)容（1）弗氏檸檬酸桿菌的培養(yǎng)（2）目的基因的構(gòu)建與體外擴(kuò)增（3）表達(dá)產(chǎn)物的鑒別2實(shí)驗(yàn)原理2.1 SDS法制備基因組DNA的原理細(xì)菌基因組DNA （染色體DNA ）的提取一般是先用溶菌酶處理，破壞細(xì) 菌細(xì)胞壁，然后再加入SDS和/或蛋白酶K，使細(xì)菌細(xì)胞裂解，同時(shí)解離與核酸 結(jié)合的蛋白質(zhì)，再利用有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)徹底變性。通過離心，細(xì)胞碎片及變 性蛋白質(zhì)復(fù)合物被沉淀下來，而 DNA擇留在上清液中，利用乙醇或異丙醇沉 淀溶液中的DNA。用無DNA酶的RNA酶水解

16、溶液中的RNA，最終獲得純度 較高的細(xì)菌DNA。溶菌酶（lysozyme）是一種能水解粘多糖的堿性酶，它通過破壞細(xì)菌細(xì)胞 壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的 禺1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶 性粘多糖分解成可溶性糖肽，從而使細(xì)菌細(xì)胞壁破裂。SDS是一種強(qiáng)陰離子去污劑，其主要作用是：結(jié)合膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、核膜；是核蛋白體（DNP） 中的蛋白質(zhì)與DNA分離；與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性而沉淀。蛋白酶 K 能在SDS和EDTA存在的情況下保持較高的活性，可將與 DNA結(jié)合的蛋白質(zhì) 降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。EDTA也具有降低細(xì)胞膜 穩(wěn)定性，并抑制DNase活性的作用。T

17、ris-HCI （8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止 核酸被破壞。高濃度的NaCI可使蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)沉淀。上清液用酚/氯仿/ 異戊醇反復(fù)抽提除去蛋白質(zhì)，再用乙醇或異丙醇沉淀中的DNA。2.2瓊脂糖凝膠電泳原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷在電場中向正極移動(dòng)。由于糖一磷酸骨架在 結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈 DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們 能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。 在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度 取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì) 量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離

18、。 DNA分子的遷移速度與相對分 子質(zhì)量對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。2.3 PCR反應(yīng)原理聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction PCR）是體外酶促合成特異 DNA 片段的一種技術(shù)。利用PCR技術(shù)可在數(shù)小時(shí)之內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因或 DNA片 段，從而免除基因重組和分子克隆等一系列繁瑣操作。由于這種方法操作簡單、 實(shí)用性強(qiáng)、靈敏度高并可自動(dòng)化，因而在分子生物學(xué)、基因工程研究以及對遺 傳病、傳染病和惡性腫瘤等基因診斷和研究中得到廣泛應(yīng)用2.3.1引物設(shè)計(jì)的基本原則PCR反應(yīng)中有兩條引物，

19、即5端引物和3引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條 DNA 單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴(kuò)增片段5端上的一小段 DNA序列相同；3端引物與位于待擴(kuò)增片段3端的一小段DNA序列互補(bǔ)。 引物長度：15-30bp,常用為20bp左右。 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過 多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧 啶核苷酸的成串排列。 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3端的互補(bǔ)重疊。 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，弓I物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致

20、非特異性擴(kuò)增。 引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，最佳選擇是G和Co 引物的5端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，弓I入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等2.3.2 PCR反應(yīng)參數(shù)1. 變性：在第一輪循環(huán)前,在94C下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶（hot start）,這樣可減少聚合酶在 低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的 錯(cuò)誤。變性不完全，往往使PCR失敗,因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會很 快復(fù)性，減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94E 1

21、min。在變性溫 度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全，所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體 系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取τ诟缓?GC的序列,可適當(dāng)提高變性溫度. 但變性溫度過高或時(shí)間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。2. 退火：這是PCR的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。 合理的退火溫度從55E到70C o退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低 5E ,當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實(shí)驗(yàn)的非可異性擴(kuò)增帶時(shí)，以2E為增量， 逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn) 物的形成。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的 Tm低 5C。

22、或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循 環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩 步合并,只用兩種溫度（例如用60E和94E）完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán),既 省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成，反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72E ,接近于Taq DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75C.實(shí)際上,引物延伸在退火時(shí)即已開始,因?yàn)門aq DNA聚合酶的作用溫 度范圍可從20C -85C .延伸反應(yīng)時(shí)間的

23、長短取決于目的序列的長度 和濃度.在一般反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb長的 DNA延伸時(shí)間過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加但對很低濃度的目的序 列，則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后，都需要一步較長時(shí)間（10-30min）的延伸反應(yīng)，以獲得盡可能完整的產(chǎn)物，這 對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。4.循環(huán)次數(shù)：當(dāng)其它參數(shù)確定之后，循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而 言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性 產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴(kuò)增后,反應(yīng)中Taq DNA聚合 酶已經(jīng)不足，如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠，需要進(jìn)一步擴(kuò)增，可將擴(kuò)增的 D

24、NA樣品稀釋103-105倍作為模板,重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增 這樣經(jīng)60輪循環(huán)后,擴(kuò)增水平可達(dá)109-1010。擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò) 增效率有關(guān),擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C = Co（1+P）n。其中： C為擴(kuò)增產(chǎn)物量,Co為起始DNA量,P為增效率,n為循環(huán)次數(shù)。 在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲 線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先 由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水 平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異 性產(chǎn)物。2.3.3 PCF擴(kuò)增的理論模式PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期

25、后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá):Yn=Yn-1 (1+E)= Yn-2 - (1+E)2=X (1+E)n0 E1其中E表示擴(kuò)增效率，Yn表示在n個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量，Yn-1為n-1 個(gè)周期后PCR產(chǎn)物的分子數(shù)量等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為 20或30）內(nèi)成立。超過此周期數(shù),擴(kuò)增過程即由指數(shù)擴(kuò)增降低至穩(wěn)定的擴(kuò)增速率， 最終達(dá)到平臺，不再擴(kuò)增2.3.4影響PCR的因素PCR是非常直接、簡單又具有強(qiáng)大威力的技術(shù)。誠如一位當(dāng)年參與PCR誕生的資深研究員Henry Erlich所言”在分子生物學(xué)的領(lǐng)域中，只要擁有它，你便可以無照營業(yè)”也因此，活用及慎用 PCR是確保一定品質(zhì)的必要條件。PCR本身

26、雖然是一個(gè)單純的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，但是一個(gè)好的PCR反應(yīng)及其產(chǎn)物則是受到很多因素的影響。這些因素色括反應(yīng)中各種原料的濃度 （Taq. Polymerase, primers, dNTPs, MgCI2也包括整個(gè)反應(yīng)中各步驟的溫度與時(shí)間的設(shè)定。當(dāng)然DNA模板（Template）與引信（Primers）本身?xiàng)l件也占有一定的重要性。近來的觀念中，共溶劑諸如Dimethyl sulfoxide (DSMO) 、 glycerol、Foramide and Tetramethylam mon ium chloride (TMAC)也對整個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生若干重要的影響。3實(shí)驗(yàn)器材與步驟3.1實(shí)驗(yàn)材料(1) 菌株弗氏檸檬

27、酸桿菌(Citrobacter freundii)349-14和弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii) 351-14,均由常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心提供。(2) 試劑Tris、EB、EDTA、SDS、乙酸鈉、氯化鈉、苯酚、氯仿、無水乙醇、氯 化鈉、胰化蛋白胨、酵母抽提物、氯化鎂、石蠟油、硼酸、瓊脂糖等，均 為分析純。(3) 酶及其他材料溶菌酶、RNA水解酶、蛋白酶K、Taq酶、dNTP、引物、DNA marker等,均由常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院江蘇省應(yīng)用酶工程技術(shù)研究開發(fā)中心提供。3.2實(shí)驗(yàn)儀器(1) 設(shè)備潔凈工作臺(SW-CJ-IF)上海博迅實(shí)業(yè)有限

28、公司醫(yī)療設(shè)備廠(2) 儀器電子天平1( FA1104)上海良平儀器有限公司電子天平2(MP5002)上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司恒溫氣浴搖床(HZ-8811K)常州市博宏高科試驗(yàn)設(shè)備有限公司手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（SYQ.DSX-280B ）上海申安醫(yī)療器械廠隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9080MBE）上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）國華電器有限公司基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀（DTC）西安天隆科技有限公司電泳儀（DYY-4C）北京市六一儀器廠多功能水平電泳槽（6H120-0328-2）北京市六一儀器廠漩渦混合器（QT-1）上海琪特分析儀器有限公司熱磁力攪拌器（SH-3）臺式高速

29、離心機(jī)（RJ-TGL 16B）無錫市瑞江分析儀器有限公司冰箱（BCD-155TD-GA ）青島海爾股份有限公司可見紫外檢測儀（ZF-401 ）上海市顧村電光儀器廠3.3實(shí)驗(yàn)步驟3.3.1菌種培養(yǎng)（1）配制LB培養(yǎng)基（g/L）:培養(yǎng)基在錐形瓶中配制完成并溶解。液體培養(yǎng)基50mL （胰蛋白胨10%,酵母粉5%，NaCI10% ； pH 7.2）。固體LB培養(yǎng)基100 mL （液體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂）。（2） 滅菌：將平板2塊與裝有培養(yǎng)基的錐形瓶分別包扎，移液槍槍頭與1.5 mL 的離心管置于密封容器中，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌。（3）倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至 50C左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。

30、其過 程是：在酒精燈火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；使錐形瓶的瓶口迅 速通過火焰，目的是消滅瓶口的雜菌，防止雜菌感染培養(yǎng)基；左手將培養(yǎng) 皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，立刻蓋上皿蓋。（4）菌種活化：待平板冷卻凝固后，劃平板，接檸檬酸桿菌349-14和檸檬酸桿菌351-14的菌種，放置片刻，將平板倒置，防止培養(yǎng)基冷卻過程中形成 的水滴落到培養(yǎng)基表面。最后放入恒溫培養(yǎng)箱，37C過夜培養(yǎng)，第二天，觀察菌種活化情況，情況較好可放入冰箱 4 C保存。(5) 擴(kuò)大培養(yǎng)：1.將培養(yǎng)好的培養(yǎng)皿(不要打開皿蓋)用 75%的酒精擦拭，放 進(jìn)無菌超凈臺中，2用酒精燈灼燒接種環(huán)，3.待接種環(huán)冷卻，用接種環(huán)

31、挑 取培養(yǎng)皿上的菌落，4.將接種環(huán)伸入經(jīng)過滅菌的液體培養(yǎng)基， 搖晃接種環(huán)， 使菌種均勻分散到培養(yǎng)液中，然后包扎封口錐形瓶，5將接種后的錐形瓶放入37 C、200r/min搖床過夜培養(yǎng)。(培養(yǎng)時(shí)間不能太長，否則細(xì)菌老 化，代謝產(chǎn)物太多。影響質(zhì)粒質(zhì)量。6.培養(yǎng)皿繼續(xù)放入冰箱4C保存。3.3.2 SDS法制備細(xì)菌基因組DNA(1) 菌體收集：取已經(jīng)培養(yǎng)過夜的弗氏檸檬酸桿菌菌懸液(349-14或351-14)1.5mL于1.5mL離心管中，12000r/min離心1min，棄上清，收集菌體(注 意吸干多余的水分)。(2) 輔助裂解：陽性菌破壁裂解比較困難，可以先用溶菌酶處理。加入100ug/mL溶菌酶

32、50uL，37C處理1h。(3) 裂解:向每管加入 200uL 裂解緩沖液(40mmol/L Tris-HCI pH8.0,20mmol/L乙酸鈉，1mmol/L EDTA,1%SDS)，用槍頭反復(fù)吹打以懸浮和裂解細(xì)菌細(xì) 胞。(4) 接著向每管加入66uL 5mol/L NaCl，充分混勻后，12000r/min離心10min， 除去蛋白質(zhì)復(fù)合物及細(xì)胞壁等殘?jiān)?5) 將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中，加入等體積的用Tris飽和的苯酚，充分混勻 后，12000r/min離心5min，進(jìn)一步沉淀蛋白質(zhì)。(6) 取離心后的水層，加等體積的氯仿，充分混勻后， 12000r/min離心5min, 去除苯酚。(

33、7) 小心取出上清液，用預(yù)冷的二倍體積的無水乙醇沉淀 DNA，室溫放置10min以上，12000r/min離心10min,棄上清液。(沉淀質(zhì)粒)(8) 用1mL 70%乙醇洗滌沉淀1-2次，12000r/min離心10min,棄上清液。沉 淀在室溫下倒置干燥或真空干燥 10-15min。(不要太干，否則不易溶解)(9) 加入50uL含10ug/mL RNaseA的TE緩沖液或無菌雙蒸水，使DNA溶解， 置 37C水浴 20-30min,除去 RNA。(10) 冷卻至室溫后，將樣品儲存在-20 C冰箱中使用。333電泳檢測（1）制備瓊脂糖凝膠按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可

34、參照下表:瓊脂糖凝膠濃度/%線狀DNA的有效分離范圍/ Kb0.35 600.61-200.70.8 100.90.571.20.461.50.242.00.13本實(shí)驗(yàn)選擇1%的瓊脂糖凝膠液（稱取1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入100mL 1XTAE緩沖液，至微波爐加熱至完全溶化，取出搖勻）。（2）膠板的制備 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干； 平衡凝膠槽，放好膠板，調(diào)節(jié)好梳子與底板的距離 將60卩EB加入冷卻至60C左右的瓊脂糖凝膠液中，輕輕混勻，緩緩倒 入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面 （注意不要形 成氣泡）。 待膠徹底凝固后，輕輕拔出梳子 將內(nèi)槽放入電泳槽內(nèi)，加入1XTAE電泳

35、緩沖液至電泳槽中，使其沒過 凝膠表面1-2m m，排除加樣孔中的氣泡。（3）加樣：將5卩L樣品與1卩L 6x上樣緩沖液混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品 孔（樣品不可溢出，記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。（4）電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過 5 V/cm。（樣品 進(jìn)膠后，應(yīng)控制電壓降不高于 5V/cm（電壓值V與電泳板兩極之間距離 比）。溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿，停止電泳。觀察：小心地瀝干凝膠上的緩沖液，取出膠板將膠緩慢滑至保鮮膜上，小心移至 紫外燈觀察臺上，蓋上玻璃罩，在波長254nm紫外燈下進(jìn)行觀察。DNA存

36、在的位置呈現(xiàn)橘紅色熒光，肉眼可觀察到清晰的條帶.熒光在4-6小時(shí)后減弱，因此，初步觀察后，應(yīng)立即拍照記錄下電泳圖譜觀察時(shí)應(yīng) 戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免紫外光對眼睛的傷害。按下列程 序依次加入試劑，按50卩反應(yīng)體積配制PCR反應(yīng)體系（注意：水先加，然 后依次加入其他試劑，模板DNA最后加）3.3.4 PCR 方法（1）按表1-1將各成分依次加到0.2mlPCR反應(yīng)專用薄壁管內(nèi)注意：實(shí)驗(yàn)中應(yīng) 設(shè)立對照。陰性對照（不加模板DNA）可加去離子水代替。表3-1各實(shí)驗(yàn)成分的加入方法實(shí)驗(yàn)成分加入量（卩l(xiāng)）終濃度無菌去離子水話量上游引物（P1）2.00.5mol/L下游引物（P2）2.00.5 1

37、mol/L2.5mmol/L4 種 dNTPs4.00.2mmol/L10 XPCR buffer5.01 x25mM MgCl 23.01.5mMTaq DNA 聚合酶（5U/ QI0.5模板DNA2.5補(bǔ)水至總體積50陽性對照（含目的序列的DNA）。（3）將上述液體混合，短暫離心以集中液體，置PCR儀依表1-2所述條件進(jìn)行反應(yīng)（注意：反應(yīng)結(jié)束后，樣品可于 4 C保存）表3-2 PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)變性退火延伸循環(huán)周期194C預(yù)變性5min1294 C 45s60 C 45s72 C 45s30372 C 5-10min1取5卩1PCR反應(yīng)液置瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)溴化乙啶染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。 成功的擴(kuò)增結(jié)果一應(yīng)為明顯的、單一的熒光帶，并和預(yù)先設(shè)計(jì)的片段大小一致; 電泳時(shí)加DNAMarker標(biāo)定擴(kuò)增片段大小。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論及注意事項(xiàng)4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1菌種弗氏檸檬酸桿菌351-14弗氏檸檬酸桿菌349-144.1.2質(zhì)粒檢測結(jié)果弗氏檸檬酸桿菌349-14基因組DNA弗氏檸檬酸桿菌349-14基因組DNA2013-1-62013-1-8弗氏檸檬酸桿菌351-14基因組DNA弗氏檸檬酸桿菌351-14基因組DNA2013-1-112013-1-104.2分析討論及注意事項(xiàng)（1）當(dāng)EB