慢病毒包裝操作說(shuō)明

1、Clontech-Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User Manual Protocol No. PT5135-1慢病毒包裝操作說(shuō)明 A.用Lenti-X HTX Packaging Syste生產(chǎn)慢病毒懸浮物 為了獲得最高效價(jià)的病毒懸液，用Len ti-X 293T細(xì)胞系，嚴(yán)格尊守以下說(shuō) 明，尤其尊守 （ 1 ）培養(yǎng)體系和培養(yǎng)量 （2）DNA的量和轉(zhuǎn)染質(zhì)量 （ 3）無(wú)四環(huán)素血清 （ 4）孵育時(shí)間。 所有的Xfect?轉(zhuǎn)染成份，量和條件最好用 Lenti-XVectors, Lenti-XHTX包裝 混合物，Le nti-X293T細(xì)胞。用10c

2、m組織培養(yǎng)板并確保血清無(wú)四環(huán)素，四環(huán)素 污染的血清對(duì)表達(dá)包裝成份是有害的。 所有的實(shí)驗(yàn)步驟均在無(wú)菌組織培養(yǎng)器血中完成。包裝病毒需要有微生物安 全等級(jí) 2 的生物安全柜中進(jìn)行，注意重組的假性慢病毒包裝顆粒能夠感染人。 6 1. 轉(zhuǎn)染24小時(shí)前，在10cm培養(yǎng)板接種4-5 X 1個(gè) 293T細(xì)胞，添加10ml的 生長(zhǎng)培養(yǎng)基。 在 37 C, 5%C0 2 C條件下過(guò)夜。在進(jìn)行第7步前確保培養(yǎng)血有80-90%的覆蓋率。 2. 充分混均 Xfect Polymer。 3. 每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品需準(zhǔn)備兩個(gè)離心管,按順序添加如下試劑 Tube 1（Plasmid DNA）Tube 2（Polymer） 557 卩

3、 IXfectReaction Buffer 592.5 卩 l Xfect ReactionBuffer36 Lenti-XHTX Packaging Mix 7. 5 IXfect Polymer7Lenti-X Vector DNA（1 卩 g/ 卩 I） 600 I總量600 總量 Xfect Polymer不要在室溫下擱置長(zhǎng)于30mi n 4. 充分混均每個(gè)管 5. 把Tube2添加到Tube1中，中速渦旋10秒。 6在室混下孵育DNA-Xfect混合物10min，這時(shí)可形成納米復(fù)合物。 7.把1200 的DNA-Xfect溶液（第5步制備）加入到第1步準(zhǔn)備好的細(xì)胞 中，前后左右輕輕

4、晃動(dòng)培養(yǎng)血，使其均勻。 8在37C條件下培養(yǎng)。 9.4小時(shí)或過(guò)夜后，換10ml的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，在37C條件下在培養(yǎng)24- 48h。病毒滴定量在48h后可達(dá)到最咼。注意： 移棄的培養(yǎng)液包含了可感染的慢病毒。 1 0.吸取慢病毒懸液。在500g下離心10min。注意： 懸浮液包含可感染的慢病毒。 TM 1 1. 用Lenti-X GoStix鑒定病毒產(chǎn)物或者滴定病毒株。然后可用病毒產(chǎn)物轉(zhuǎn)導(dǎo) 靶細(xì)胞。也可在-80C保存。B: Len ti-Viruses轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞 1轉(zhuǎn)導(dǎo)前12-18h，用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)靶細(xì)胞 2. 輕輕混合凍融的病毒株或從細(xì)胞包裝得到的病毒株，不要渦旋。需要提醒 的是每次的凍融都降低 2-4 倍的病毒效價(jià) 3. 根據(jù)靶細(xì)胞的培養(yǎng)液的量調(diào)節(jié)病毒和聚凝胺的添加量。在轉(zhuǎn)導(dǎo)中可用足量 的聚凝胺（e.g.4匕g/rhl來(lái)獲得需要的最終濃度 4用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋病毒株，獲得需要的 MOI。如要不知道病毒效價(jià)，可連 續(xù)稀釋病毒株或包裝懸液，使得用于轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒總量不會(huì)超過(guò)病毒包裝時(shí)培養(yǎng) 液的 1/ 3。 5在靶細(xì)胞中加入病毒懸液，轉(zhuǎn)導(dǎo) 8-24h。離心的培養(yǎng)液可以增加感染效 率。 6. 移除丟棄存留病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)培養(yǎng)液，換成新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)液。注意： 移棄的培養(yǎng)液包含可感染的慢病毒。 7繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24-48h，在靶細(xì)胞中積累基因產(chǎn)物。 8. 收集細(xì)胞進(jìn)行分析，或者用合適的抗