考馬斯亮藍(lán)測(cè)蛋白實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)二：分光光度計(jì)的學(xué)習(xí)之考馬斯亮藍(lán)G-250法 (Bradford法)測(cè)定蛋白質(zhì)含量定 一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)分光光度訃的基本原理和使用方法，并使用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋口質(zhì) 含量。 二實(shí)驗(yàn)原理 考馬斯亮藍(lán)G-250 (Coomassie brilliant blue G-250)測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染 料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm； 當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋口質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸 收。其光吸收值與蛋口質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋口質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與 考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)

2、十分迅速；其 結(jié)合物在室溫下lh內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單, 操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈墩度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋 白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范用為01 000 ug/mL,是一種常用的微量蛋白質(zhì) 快速測(cè)定方法。 三實(shí)驗(yàn)材料 1. 實(shí)驗(yàn)材料：未知濃度的牛血清樣品 2. 主要儀器：試管、移液槍、分光光度計(jì)等。 3. 試劑：蛋白試劑考馬斯亮藍(lán)G-250的配制：稱取lOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250, 溶于50mL90%乙醇中，加入85% (W/V)的磷酸1 OOmL,最后用蒸鐳水定容到1 OOOmL。此溶液在常溫下可放置一個(gè)月。 四實(shí)驗(yàn)步驟 標(biāo)準(zhǔn)曲

3、線制作：取6支10mL干凈的試管，按表1取樣。搖勻后放置加in ,用 lcm光經(jīng)的比色杯在595nm波長(zhǎng)下比色，記錄測(cè)定的光密度0D595nm,并做標(biāo)準(zhǔn) 曲線。 表1低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 管號(hào) 0 1 2 3 4 5 lmg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白(ml) 0 0. 02 0. 04 0. 06 0. 08 0. 10 蒸館水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考馬斯亮藍(lán)G-250 (ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白濃度(mg /ml) 0 0. 02 0. 01 0. 06 0. 08 0. 10 OD595nzi 0 0. 339 0. 191 0. 601 0. 775 0.

4、799 擬合標(biāo)準(zhǔn)方程：y二7.7329x+0. 1142 2. 未知蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 另取2支10mL試管，按下表取樣。吸取測(cè)定液0. ImL,蒸謂水0. 9 mL放入試 管中，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋口試劑，充分混合，放置2min后用lcm光 徑比色杯在595nm下比色，記錄光密度0D595nm,并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)品提 取液中蛋白質(zhì)的含量X ( ug) o以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)試管做空白。 五實(shí)驗(yàn)結(jié)果 待測(cè)樣品的吸光度1為0.240,待測(cè)樣品的吸光度2為0.266,平均值為0.253。 代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得知x為0. 0018,所以濃度為0. 018 mg /ml。 六、實(shí)驗(yàn)分析 經(jīng)測(cè)量得每毫升測(cè)定液中蛋口質(zhì)的含量很低，是樣品本身蛋白含量少還是 實(shí)驗(yàn)操作造成，還需進(jìn)一步分析。 注：文檔可能無法思考全面，請(qǐng)瀏覽后下載，供參考。 （二）考馬斯殼藍(lán)法測(cè)定未知蛋白濃度： 優(yōu)點(diǎn)：1、靈敏度高； 2、測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需要加入一種試劑； 3、干擾物質(zhì)少。 缺點(diǎn)：一般分光光度法都有較大的機(jī)器誤差（重復(fù)性較差），為了數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，需 要每次進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。 七、注意事項(xiàng) 1 在測(cè)量前應(yīng)把分光光度計(jì)預(yù)熱半小時(shí)，打開開關(guān)時(shí)，先確定開關(guān)按鈕的置，切 不可憑直覺亂摸。 2稱量樣品前，電子天平要?dú)w零，稱量時(shí)要精準(zhǔn)。 3. 溶液一定要配制準(zhǔn)確，以防影響實(shí)驗(yàn)效果，保證點(diǎn)在一條直線上。 4.