試驗(yàn)八蛋白質(zhì)定量微量分析---ELISAreader應(yīng)用

1、lSSJSl（）95i*6087實(shí)驗(yàn)八結(jié)果：蛋白質(zhì)定量（微量）分析-ELISA reader應(yīng)用編號(hào)吸光值吸光值吸光值平均濃度00.0660.0650.0690.06666700.20.2040.1770.2040.1950.20.40.2840.2370.2960.2723330.40.60.3920.5020.5970.4970.60.80.4930.4850.5030.4936670.810.8290.690.5960.70511X1.2831.3961.1071.2621.9464295X0.3810.3880.4450.4046670.55465420X0.1560.1910.193

2、0.180.189935計(jì)算未知液稀釋前濃度：5X0.3128755=1.56437520X 0.17448*0=3.48961X未知液濃度不在檢量線範(fàn)圍內(nèi)，因此不予計(jì)算 計(jì)算未知液濃度平均值（1.564375+3.4896）2=2.5269875吸光値圖表 = O.616x 4- 0.063R2= 0.963吸光値綠性（吸迅?jìng)帲?.4討論：1. 檢量線不直，有部分不在線性上，也就是吸光值不是很準(zhǔn)確，也許是稀釋時(shí)操作錯(cuò)誤 未震盪均勻，液體量取錯(cuò)造成的，若是微量滴定盤(pán)不淨(jìng)也可能會(huì)影響吸光值的測(cè)定。2計(jì)算出的未知液濃度差距太大，也許是因?yàn)椴僮麇e(cuò)誤，取量錯(cuò)誤，容器清洗不淨(jìng)，或 是檢量線不完全在線性上

3、造成計(jì)算時(shí)產(chǎn)生的誤差，因此本組的未知液濃度不夠精準(zhǔn)， 必須要再次實(shí)驗(yàn)才能確認(rèn)此未知液真正的濃度為何。3本次實(shí)驗(yàn)使用的是微量滴定盤(pán)，於 ELISA reade光度計(jì)測(cè)吸光值，它不同於分光光度 計(jì)的是它不像分光光度計(jì)是要將液體分裝置小的測(cè)光管內(nèi)，一管僅能放一種液體，分 好幾管容易混到或者打翻，且測(cè)光管有分透光面及不透光面，擺放錯(cuò)誤或有汙漬也無(wú) 法測(cè)得準(zhǔn)確的吸光值，而ELISA reade光度計(jì)只要將液體都裝在96孔的微量滴定盤(pán) 內(nèi)，放進(jìn)儀器內(nèi)測(cè)量即可，所以準(zhǔn)確度及方便度都比分光光度計(jì)來(lái)的方便許多。4. 此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果不是很理想，是稀釋錯(cuò)誤嗎？但本組的操作是每次稀釋都有換微量吸管 頭的，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果不

4、理想實(shí)在很難理解，也許真的是沒(méi)有混勻吧！實(shí)驗(yàn)問(wèn)題:1. 請(qǐng)說(shuō)明本分析方法的原哩，並特別以蛋白質(zhì)構(gòu)造來(lái)說(shuō)明。CBG有點(diǎn)像指示劑，會(huì)在不同的酸鹼度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍(lán)色。 當(dāng)CBG接到蛋白質(zhì)上去的時(shí)候，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)會(huì)提供 CBG 一個(gè)較為中性的環(huán)境，因此會(huì) 變成藍(lán)色。當(dāng)樣本中的蛋白質(zhì)越多，吸到蛋白質(zhì)上的 CBG也多，藍(lán)色也會(huì)增強(qiáng)。因此， 藍(lán)色的呈色強(qiáng)度，是與樣本中的蛋白質(zhì)量成正比。如下圖:各種蛋白質(zhì)定量法: 20HHjt/ NH2尿秦urea5-Pi 280 nm 呂、；(arom alic)UV Absorbanceiu. Special Binding 匸；Groups |hem

5、c)H QfO J 206 nm 廠 (carbonyl)Biuret Method phsophcnclybdic- (carbonyl) phosphoturigstate_qLowry MethoddCBG接在4號(hào)位置，使其呈現(xiàn)藍(lán)色。2. 一般緩衝液或試劑中，何種添加物會(huì)影響B(tài)radford法的呈色？若含有色素則呈色效果就會(huì)變差，清潔劑(deterge nts)及鹼性蛋白質(zhì)緩衝液(basicprotein buffer)亦會(huì)干擾此種檢驗(yàn)結(jié)果3. 請(qǐng)列出本分析方法的各操作步驟中，哪些會(huì)影響分析的準(zhǔn)確度？稀釋時(shí)，若稀釋錯(cuò)誤會(huì)造成吸光值影響，造成最後做出檢量線時(shí)無(wú)法呈現(xiàn)直線，也計(jì)算 不出未知式

6、樣濃度；若微量低定盤(pán)清洗不淨(jìng)，造成測(cè)吸光值時(shí)的誤差，也會(huì)影響檢量線 的製作及計(jì)算出的結(jié)果；最後靜置10分鐘是要讓CBG與蛋白質(zhì)結(jié)合，若時(shí)間不夠也會(huì) 影響結(jié)果。4. 還有哪些蛋白質(zhì)的定量方法？並請(qǐng)比較其優(yōu)劣點(diǎn)。各種蛋白質(zhì)定量法的比較：定量方法靈敏度|準(zhǔn)確度|其它說(shuō)明Biuret0.05 - 5 mg咼呈色快速有腐蝕性 皺離子干擾大Lowry0.05 - 0.5 mg中呈色較慢 多種離子有干擾Absorbs nee280 nnn0.05-2 mg低樣本可再收其它物質(zhì)干擾大Absorbance205 nm0.01 - 0.05 mg高樣本可回收 氧分子干擾極大Dye-Bi nding0.01- 0.

7、05 mg中咼呈色快雜質(zhì)干擾多顏色不易先除實(shí)驗(yàn)九結(jié)果：醣類(lèi)的鑑定反應(yīng)-醣的呈色反應(yīng)和還原醣的檢驗(yàn)H20XyloseGlucoseFructoseLactoseSucroseStarchAlbumin紅8Molish一+Iodi ne一一一一一一+一+Ben edict一+一一一一Barfoed一+一一一一一討論：1. Molish Test中是利用硫酸將醣類(lèi)脫水產(chǎn)生furfural或其衍生物，在與a -萘酚產(chǎn)生具有 鮮明顏色物質(zhì)，因此是用來(lái)測(cè)定容易中是否含有碳水化合物；結(jié)果顯示除了水以外的 溶液皆呈陽(yáng)性反應(yīng)，因此都含有碳水化合物。2. Iod ine Test中是利用碘會(huì)與澱粉及肝醣形成錯(cuò)合物

8、，若溶液中含有支鏈澱粉或肝醣則 此錯(cuò)合物會(huì)呈紅棕色，若溶液中含有直鏈澱粉則錯(cuò)合物會(huì)呈藍(lán)色，若溶液中兩者都有 則錯(cuò)合物會(huì)呈紫色；結(jié)果顯示只有澱粉及未知溶液呈現(xiàn)紫色，因此可以肯定的推斷此 未知溶液就是澱粉溶液。3. Ben edict Test中是利用游離醛或酮將鹼性之銅還原 （或醣被氧化），形成黃色至磚紅色 之氧化亞銅，是用來(lái)測(cè)定溶液中是否有還原醣存在；結(jié)果顯示木醣、匍萄糖、果糖及 乳醣皆有呈色，為陽(yáng)性反應(yīng)，其餘為陰性反應(yīng)，因此可推定未知液不屬於還原醣。4. Barfoed Test中是利用Benedict Test原理但在酸性環(huán)境使銅離子能測(cè)出單醣，溶液中若 含單醣則在加熱時(shí)短時(shí)間內(nèi)（約57分

9、鐘）會(huì)產(chǎn)生紅色沉澱，溶液中若含雙醣則在加 熱時(shí)一段時(shí)間後（約712分鐘）會(huì)產(chǎn)生大量沉澱（蔗糖除外）；結(jié)果顯示木醣、葡萄 糖及果糖呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，其餘呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，可以推定未知溶液不為單醣。5. 以上種種試驗(yàn)結(jié)果要推斷出未知溶液為何種醣類(lèi)，首先我們可以確定未知溶液一定含 有碳水化合物，再來(lái)可以確定未知溶液與碘呈陽(yáng)性反應(yīng)，接著我們知道未知溶液不屬於還原醣，最後又得知未知溶液不為單醣；將還原醣及單醣排除，剩下三種可能蔗糖、 澱粉及白蛋白，但又因其能與碘產(chǎn)生反應(yīng)，因此可推定未知溶液為澱粉溶液。5t?ajBu)951 *6087實(shí)驗(yàn)十葡萄糖定量分析結(jié)果:溶液575nm吸光值所含的glucose濃度1%gl

10、ucose0.8971%glucose0.8%glucose0.6950.8%glucose0.6%glucose0.5300.6%glucose0.4%glucose0.2960.4%glucose0.2%glucose0.1760.2%glucose10X稀釋的紅茶0.5140.594565%glucose10X稀釋的柳橙汁0.3140.377174%glucose10X稀釋的葡萄汁1.3041.453261%glucose2X稀釋的未知液0.5020.581522%glucose5X稀釋的未知液0.1390.186957%glucose蒸餾水00計(jì)算各種飲料及未知液稀釋前所含的 gluc

11、ose濃度：10X 紅茶0.594565%X10=5.94565%10X 柳橙汁0.377174%X0=3.77174%10X葡萄汁1.453261%X0=14.53261% (不在檢量線範(fàn)圍內(nèi))2X 未知液0.581522%2=1.163044%5X 未知液0.186957%5=0.934785%計(jì)算未知液所含的glucose濃度平均值(1.163044%+ 0.934785%用=1.0489145%吸光値圖表V = 0.920x - 0.033RJ = 0.992吸光値線性（吸逛値）討論：1還原醣在鹼性環(huán)境下可將 DNSA還原呈紅棕色，可利用此種原理用比色法測(cè)定飲料及 未知液內(nèi)所含葡萄糖量

12、。2. 測(cè)定結(jié)果葡萄汁吸光值為 1.304，大大超出檢量線範(fàn)圍內(nèi)，因此不能算在結(jié)果內(nèi)，但可 以確定的是葡萄汁含有大量葡萄糖，至於多少要再稀釋再測(cè)吸光值才能知道。3. 紅茶含有葡萄糖濃度為 5.94565%，所以紅茶才很甜吧！但也許也會(huì)因?yàn)榧t茶具有紅色 會(huì)影響反應(yīng)結(jié)果的紅色造成測(cè)吸光值及計(jì)算的結(jié)果。3.柳橙汁含有葡萄糖濃度為 3.77174%含量也很多，但比紅茶低，所以柳橙汁沒(méi)有很甜都 酸酸的吧！4未知溶液含有葡萄糖濃度為1.0489145%,沒(méi)有很多但是每100g也有1g,味道應(yīng)該是 淡淡的甜味吧！5. 因此結(jié)果顯式甜度大小：葡萄汁紅茶柳橙汁未知溶液；但飲料顏色應(yīng)該都會(huì)影 響吸光值，所以都不太

13、準(zhǔn)確，若要更準(zhǔn)確得知結(jié)果，應(yīng)該要再做同樣稀釋倍數(shù)之飲料 的吸光值，再用反應(yīng)過(guò)飲料之吸光值去扣除，計(jì)算得出的結(jié)果才最準(zhǔn)確吧！實(shí)驗(yàn)問(wèn)題：1. 請(qǐng)舉出至少兩種測(cè)定糖含量的方法，並比較這些方法的優(yōu)缺點(diǎn)。還原醣定量 -Bertrand 法：利用硫酸銅加熱還原為氧化亞銅沉澱，與硫酸鐵反應(yīng)氧化產(chǎn)生 硫酸銅，鐵鹽還原成亞鐵鹽，用高錳酸鉀滴定求出亞銅量，比 照 Bertrand 醣類(lèi)定量表求出樣品中還原醣量。還原醣定量-Somogyi法：利用硫酸銅加熱還原為氧化亞銅沉澱，沉澱與過(guò)量之碘作用，剩餘碘以硫代硫酸鈉滴定，禾用不同濃度的醣做Somogyi測(cè)定，畫(huà)出檢量線求出樣品溶液之還原醣濃度。這兩種定量法都是測(cè)定還原

14、醣含量，但 Somogy i法較為麻煩，不僅要測(cè)樣品還要將不同 濃度的已知醣含量滴定做出檢量線，相較之下 Bertrand 法就來(lái)的快速多了，雖然要煮沸 要過(guò)濾但實(shí)驗(yàn)速度會(huì)快很多，雖然Somogyi法較為麻煩但是結(jié)果卻會(huì)較Bertrand法來(lái)的 精準(zhǔn)許多，因?yàn)镾omogyi法是與已知的做比較，而B(niǎo)ertrand法是查表，因此兩種還原醣 測(cè)定法都是各有優(yōu)缺點(diǎn)的。SiS?ftJSu)951 *6087實(shí)驗(yàn)十五 健康食品之抗氧化功能評(píng)估實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖片:結(jié)果:1X2X4X8X16X32X綠茶0.120.1460.1380.1350.5810.9230.1250.1260.1140.1340.5410.9

15、170.1180.1150.1170.130.5510.914烏龍茶0.1160.1160.1250.1140.4280.7590.1170.1110.1170.1080.480.7450.1180.1130.1140.1080.2430.738紅茶0.1360.1220.110.3230.8551.0150.1360.1180.1120.3170.8411.010.1460.1220.1110.3260.7910.993麥茶1.0141.11.1191.1371.1751.1930.9941.0991.1351.1691.1731.1771.0061.0981.131.1651.1831.1

16、89水1.21.1981.2計(jì)算清除率:公式：(水的吸光值1+2+3)七(樣品8X吸光值1+2+3)七訊水的吸光值1+ 2 + 3)X100% 綠茶(1.2+1.198+1.2)七(0.135+0.134+0.133訊1.2+1.198+1.2)X00%=88.91051% 烏龍茶(1.2+1.198+1.2)3 (0.114+0.108+0.1083珂1.2+1.198+1.2)X00%=90.82824% 紅茶(1.2+1.198+1.2)3 (0.323+0.317+0.3263說(shuō)1.2+1.198+1.2)X00%=73.15175% 麥茶(1.2+1.198+1.2)3 (1.137

17、+1.169+1.1653說(shuō)1.2+1.198+1.2)X00%=3.529739%討論：1.常見(jiàn)的抗氧化劑是提供氫來(lái)清除脂質(zhì)過(guò)氧化物自由基而達(dá)到抑制油脂氧化連鎖反應(yīng)進(jìn) 行的效果；DPPH甲醇或乙醇溶液在517nm有強(qiáng)吸光，若被抗氧化劑還原則吸光值降 低，因此測(cè)吸光值時(shí)，吸光值越低代表抗氧化劑供氫力越強(qiáng)，抗氧化性越高。2. 結(jié)果顯示：於 8X 時(shí)吸光值最低者為烏龍茶，計(jì)算出期清除率為 90.82824%，其抗氧化 性相當(dāng)強(qiáng)，且這是8X稀釋的，若用未稀釋的計(jì)算，那就大於 100%，代表其抗氧化劑 供氫超級(jí)強(qiáng)！3. 綠茶，清除率為 88.91051%，抗氧化性也是很高，跟烏龍茶比較很接近，因此我們來(lái)做16X的比較看看，烏龍茶的清除率為 68.01001%,綠茶的清除率為53.50195%,兩 者的差異變大了，因此可以確定烏龍茶的抗氧化性較綠茶的抗氧化性來(lái)的高。4. 紅茶，清除率為 73.15175%，抗氧化性雖然較上面兩種飲料低，但也有 70多百分比， 且這也是8X稀釋的飲品，若推算回去，抗氧化性也算高的了。5. 麥茶，清除率為 3.529739%，抗氧化性與前面三種飲品比較下來(lái)相當(dāng)?shù)牡?/p>