最新免疫組化技術(原理、分類、步驟及主要試劑、設備準備)匯編

1、免疫組化技術原理抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素 ）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究。眾所周知，抗體與抗原之間的結合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性，即先將組織或細胞中的某些化學物質提取出來，以其作為抗原或半抗原去免疫實驗動物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并 用某種酶（常用辣根過氧化物酶）或生物素等處理后再與前述抗原成分結合，形成抗原-一抗-二抗復合物，將抗原放大，由于抗體與抗原結合后形成的免疫復合物是無色的，因此，還必須借助于組

2、織化學方法將抗原抗體反應部位顯示出來（常用顯色劑DAB顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應及呈色反應，顯示細胞或組織中的化學成分，在顯微鏡下可清晰看見細胞內發(fā)生的抗原抗體反應 產(chǎn)物，從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學成分的分布、含量。組織或細胞中凡是能作抗原或半抗原的物質，如蛋白質、多肽、 氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。分類 （常用）1、免疫熒光方法最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上熒光素，以此作為探針檢查細胞或組織內 的相應抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當抗原抗體復合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)

3、出一定波長的熒光，從而可確定組織中某 種抗原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用比較 廣。2、免疫酶標方法免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來的技術?；驹硎窍纫悦笜擞浀目贵w與組織或細胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫 酶標技術是目前定位準確、對比度好、染色標本可長期保存，適合于光、電鏡研究等。免疫酶標方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了 多種標記方法，目前在病理診斷中廣為使用的當屬PAP法（過氧化物酶-抗過氧化物

4、酶）、ABC法（卵白素-生物素-過氧化物酶復合物）、SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶）、即用型二步法（聚合物鏈接）等。3、免疫膠體金技術免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白）等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免 疫膠體金技術特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如

5、應用銀 加強的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。4、免疫鐵蛋白法5、放射免疫自顯影法標本1、組織標本：石蠟切片（病理切片和組織芯片）、冰凍切片2、細胞標本：組織印片、細胞爬片、細胞涂片操作步驟石蠟切片制作1、 固定：取組織，用 PBS沖洗，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內固定12h2、 脫水：倒去固定液，用蒸餾水沖洗3次，再用50%酒精沖洗2次，用酒精逐級脫水，70%酒精1天，80%酒精過夜，95%酒 精3h，無水酒精（I）、（U）各2h3、 透明：1:1無水酒精二甲苯 45min，二甲苯（I）、（U）各30min4、 包埋：（恒溫箱內進行）浸入石蠟，1:1二甲苯石蠟（58 C） 45min，石蠟（I

6、）、（H）、（山）共2.5h，用石蠟（山）包埋組織5、 切片：包埋后的組織塊經(jīng)修整后，用切片機切成5-7呵，的石蠟帶6、貼片：將組織石蠟塊在 50 C溫水中展片，然后用處理干凈的載玻片撈片，組織帶可黏在載玻片上（洗片：1%HCI浸泡過夜、蒸餾水沖洗、95%酒精浸泡2h后擦干 -涂膠：防脫劑多聚賴氨酸）7、烤片：68 C恒溫箱內烤片2hSP三步法1、 脫蠟：脫蠟前應將組織芯片在室溫中放置60min，或60 C恒溫箱中烘烤20min，后用二甲苯（I）、（且）浸泡，共25min2、水化：無水酒精（I）、（U ）各2min，下行至95%、80%、70%酒精（I）（U）各2min3、PBS沖洗2-3次，

7、每次5min4、阻斷：3%H 2O2去離子水（或80%甲醇）孵育10min，以滅活內源性過氧化物酶活性5、PBS沖洗2-3次，每次5min6、抗原修復：置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0 ）中用煮沸（95 C，15-20min ），自然冷卻20min以上，再用冷水沖洗缸子，加 快冷卻至室溫7、PBS沖洗2-3次，每次5min8、 封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，甩去多余液體9、滴加I抗50 M，室溫靜置1h，或者37 C 1h，或者4 C過夜（需在37 C復溫45min ）10、PBS沖洗2-3次，每次5min11、 滴加辣根過氧化物酶標記的H抗4050訕，室溫靜置1h，

8、或37 C 1h12、PBS沖洗2-3次，每次5min13、滴加SP （鏈霉親和素-過氧化物酶），室溫或37 C孵育30min-1h14、PBS沖洗2-3次，每次5min15、顯色：DAB顯色5-10min，在顯微鏡下掌握染色程度（胞漿呈棕色者判定為陽性細胞）（顯色劑的配置：在 1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻，然后加1滴顯色劑B,搖勻，再加1滴顯色劑C,搖勻）（A : DAB B : H2O2 C :磷酸緩沖液）16、自來水沖洗10分鐘終止反應17 、復染：蘇木精復染 2min ，鹽酸酒精分化18 、自來水沖洗 10-15min19 、常規(guī)脫水、透明、封片（用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋

9、上） 、鏡檢結果分析： 每張切片選擇 5 個高倍鏡視野（ 400X ），應用圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描后進行分析。試劑、設備：1、PBS ：0.01M 磷酸鹽緩沖液 (pH7.4)雙蒸水中，用鹽酸2-3h 后溶解配制 - 取 NaCl 8g ，KCl 0.2g ， Na 2HPO 4?12H 2O 3.63g 或 Na 2 HPO 4 1.44g ， KH2PO4 0.24g ，溶于 900ml 調pH值至7.4，加水定容至1L,常溫保存?zhèn)溆谩?、固定液： 4% 多聚甲醛磷酸鹽緩沖液 （pH7.4）配制-a.0.1M磷酸鹽緩沖液：取 A液400ml與B液80ml混合后，調pH于7.4，再定容

10、至500mlA 液： 0.1mol/L Na 2HPO 4（Na2HPO4?12H 2O 35.8g 加水定容至 1000ml ） B 液： 0.1mol/L NaH 2PO4（NaH 2PO4?2H 2O 15.6g 加水定容至 1000ml ）b.4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液：取 20g多聚甲醛溶于500ml 0.1M 磷酸鹽緩沖液中，加熱并攪拌約3 、梯度酒精： 100% 、95% 、 80% 、70% 、50%4 、二甲苯5、包埋劑：石蠟6、防脫劑：多聚賴氨酸（PLL5g+蒸餾水1000ml ）、APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）7、抗原修復液： 0.01M 枸櫞酸緩沖液（ PH 6

11、.0 ），或 0.01M 檸檬酸鹽緩沖液（ pH6.0 ）配制 - 取 A 液 8ml 與 B 液 42ml 混合后加水至 400ml ，調 pH 于 6.0，再定容至 500ml A 液： 0.1mol/L 檸檬酸（ C6H8O7?H2O 21.01g 加水定容至 1000ml ）B 液： 0.1mol/L 檸檬酸鈉（ Na3C6H5O7?2H2O 29.41g 加水定容至 1000ml ）8 、 SP 超敏免疫組化試劑盒 （包括試劑 A、 B、 C、 D）試劑A -阻斷劑：3%甲醇-H 202溶液（30%H 2O2和80%甲醇溶液配制）試劑 B - 封閉液：正常非免疫動物血清試劑 C -

12、二抗（辣根過氧化物酶標記）試劑D - SP （鏈霉親和素-過氧化物酶）9 、一抗（特異結合底物）10 、顯色劑： DAB 試劑盒、蘇木素染液11 、封固液：中性樹膠 ，或 50%緩沖甘油，或液體石蠟等12 、恒溫箱（水浴鍋） 、冰箱、切片機、載玻片和蓋玻片、高壓鍋或微波爐、染色缸、顯微鏡、計算機圖像分析系統(tǒng) 附：EDTA (乙二胺四乙酸)：即依地酸鈉鈣，是鈣離子絡合劑、洗滌劑、血液抗凝劑常用固定液1、 醛類固定劑：作用是使組織之間相互交聯(lián)，將抗原保存在原位。(1) 3% 中性甲醛固定液液：30% 甲醛 10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml(2) 24%多聚甲醛緩沖液：

13、40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml ，加熱 攪拌(注意不要沸騰)至溶液清亮后，室溫下冷卻后 加PBS，使總容量為 1000ml(3) 戊二醛多聚甲醛緩沖液：在上述溶液中加入1 %的戊二醛(4) Bouin液：40 %甲醛250ml，冰醋酸50ml,飽和苦味酸750ml.(5) PLP液(過碘酸賴氨酸多聚甲醛固定液)2、 丙酮及醇類固定劑：原理是使組織中的蛋白質和糖類沉淀(1) AAA液：純酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml(2) Clzrke液：純酒精95ml，冰醋酸5ml多用于冰凍切片的后固定(3) Carnoy液：純酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，多

14、用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原的固定保存(4) 丙酮：常用于冰凍切片和細胞涂片的后固定，用前在4 C冰箱預冷，切片在冷丙酮中固定 5 10min3、其他固定劑(1) Zenker液：適合免疫球蛋白抗原的檢測(2 )四氯化鋨液：是電鏡研究中所必需的固定液抗原修復用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片，原因： a.福爾馬林固定時，組織中的許多氨基酸殘基在分子內或分子間形成了醛鍵, 使得不少抗原決定簇被封閉；b.甲醛的聚合作用，使蛋白質分子間相互交聯(lián)形成大分子網(wǎng)絡，也導致了抗原決定簇被掩蓋，這就使得 相當部分的抗原不能與抗體很好是進行反應?？乖瓱嵝迯?1)高壓熱修復：在沸水中加入 0.5mol/L

15、EDTA 緩沖液(pH8.0 )或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0 )。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。(2)煮沸熱修復：電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0 )至95 C左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。(3)微波熱修復：在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0 )至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos ，X-jun ，C-kit ，C-myc ， E-cadherin ，Chromogranin A ，Cyclin ， ER，Heat shockprotein ， HPV， Ki-67， MDMZ ，p