貼壁細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)指南

1、貼壁細(xì)胞的免疫熒光染色方法materials:1. pbs solution2. 4% paraformaldehyde (pfa fixative):dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml pbs solution, stir at 70 to dissolve;3. pbs-t solution: (0.1% triton x-100 in pbs solution)4. pbs-b blocking solution: (4% bsa in pbs solution)5. primary antibody: dilute with pbs-b solu

2、tion, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50200, should be more concentrate than application in western blot;6. secondary antibody: dilute with pbs-b solution, dilution factors should refer to manualprocedure:1. cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate;2.

3、remove medium, rinse with pbs twice;3. add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes;4. rinse with 2ml pbs three times, rinse for 5 minutes every time;5. permeabilize cells with 2ml pbs-t solution at 4?c for 10 minutes;6. remove pbs-t solution, rinse cells with pbs for 5 m

4、inutes at room temperature;7. block non-specific interaction with pbs-b solution at 37?c for 30 minutes;8. add primary antibody solution, incubate at 4?c overnight;9. remove primary antibody solution, wash with pbs for 5 minutes;10. add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1

5、 hour;11. wash with pbs three times, 5 minutes each;12. add anti-fade dapi solution if needed;13. observation.細(xì)胞免疫熒光步驟1.細(xì)胞爬片；2.4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.pbs漂洗5min；4.0.5% triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)；5.pbs漂洗2次，每次5min；6.1%bsa封閉30min；7.加入1%bsa稀釋的一抗，于37雜交2h；8.pbs漂洗2次，每次5min；9.加入1%bsa稀釋的二抗，于37

6、雜交1h；10.pbs漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml dapi染色2min；12.抗淬滅封片劑封片。抗淬滅封片劑:2.5% dabco (w/v)50mm tris(ph8.0)90%甘油作為熒光顯微鏡使用：（1）先關(guān)閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。（2）等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選用合適的物鏡，調(diào)整焦距。（3）關(guān)閉顯微鏡光源，打開熒光通道。（4）需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。作為熒光顯微鏡使用：（1）先關(guān)閉熒光通道，再打開熒光激發(fā)器電源，等待15分鐘。（2）等待期間，打開顯微鏡光源，找到需要觀察的樣品，選

7、用合適的物鏡，調(diào)整焦距。（3）關(guān)閉顯微鏡光源，打開熒光通道。（4）需要圖片，要把鏡體上的相應(yīng)拉桿拉到綠線位子。按下相應(yīng)附件上的照相按扭。細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮)pbs漂洗5min0.5% triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)pbs漂洗2次，每次5min1%bsa封閉30min加入1%bsa稀釋的一抗，于37雜交2hpbs漂洗2次，每次5min加入1%bsa稀釋的二抗，于37雜交1hpbs漂洗2次，每次5min5ug/ml dapi染色2min抗淬滅封片劑封片 2.5% dabco (w/v)抗淬滅封片劑 50m

8、m tris(ph8.0) 90%甘油0.25g dabco9ml甘油0.5ml 1m tris(ph8.0) 70溶解，-20保存0.5ml ddh2o2005-07-25 20:25 免疫熒光第一步的步驟幾注意事項(xiàng)1.首先是玻片的處理:泡酸去污, 沖洗, 晾干, 泡純酒精脫脂, 蒸餾水洗(此時(shí)要用鑷子夾著洗), 晾干備用.2.不知道你做的細(xì)胞是貼壁比較好的細(xì)胞比如干細(xì)胞,還是貼壁不大好的細(xì)胞比如神經(jīng)元前者的話可以不用多聚賴氨酸包被玻片,后者爬片之前要包被多聚賴氨酸以免洗片時(shí)細(xì)胞掉片3. 固定,我用的是預(yù)冷純丙酮固定15分鐘(應(yīng)為丙酮有毒,操作的時(shí)候小心些),這步應(yīng)該注意:丙酮很容易揮發(fā),但

9、又要保證固定期間不能干片,所以要多滴加丙酮,其間用蓋子蓋住,這一步不要在6孔板內(nèi)進(jìn)行,因?yàn)楸獣?huì)將其熔化.4. 不知道你的一抗是 在胞漿表達(dá)還是在胞核表達(dá)如果在胞漿表達(dá),可以不用0.01%的triton x-100滲透(我前幾次用了triton,結(jié)果胞核也表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光), 當(dāng)然,如果一抗是在胞核內(nèi)表達(dá)要用triton 滲透15分鐘5. 5%的正常山羊血清或是5%的bsa封閉,注意這一步不要洗,只是甩掉多余的封閉液.6. 加一抗,根據(jù)你所做抗體的需求稀釋,一般是先將稀釋液加到ep管里,后加一抗.(一抗在吸出來之前要離心10-20秒),一抗的量要多加些,也是為了避免干片.7. 孵育抗體:最好是

10、4度冰箱過夜,這個(gè)過夜不是簡(jiǎn)單的過夜,一般要達(dá)14-16個(gè)小時(shí),此時(shí)要將6孔板做成濕盒,目的是妨干片.在孵育期間不要隨意搬動(dòng),以免抗體流失.注意,pbs液的ph值要調(diào)在7.4左右孵育一抗不能干片,孵育一抗時(shí)間要久;其四,多余的封閉液不能洗掉,只能甩干2005-07-25 20:51 總之,首先,應(yīng)該注意的是片子有沒進(jìn)行了脫脂處理;其二,注意洗片用pbs的ph植要在7.4左右;其三,固定,孵育一抗不能干片,孵育一抗時(shí)間要久;其四,多余的封閉液不能洗掉,只能甩干;其五,要注意避光說了這么多,嘿嘿,最重要的一點(diǎn)是:你以后闡述問題的時(shí)候請(qǐng)具體一點(diǎn),不要讓回答問題的人遍地撒網(wǎng),好累呀!2009-01-2

11、3 10:50 首先 用16孔板 沒有任何問題分析 沒有熒光的結(jié)果1. 固定最好用4%多聚甲醛 30min2. 一抗 孵育時(shí)間太短 我的經(jīng)驗(yàn) 37度 2小時(shí) 或者4度 過夜 效果更好3. 二抗孵育時(shí)間是多少？ 建議 37度2-3小時(shí) 我也有做過 5個(gè)小時(shí)的最后 你用的是那種ccd的熒光顯微鏡嗎？ 有的時(shí)候染的不好鏡下看不到熒光 但是是可以照出來的！fix cells in 2% formaldehyde in pbs/ph 7.4 for 15 min. at 20oc. 2% formaldehyde is made up fresh prior to use by dissolving t

12、he appropriate amount of em grade paraformaldehyde (prill form, from electron microscopy sciences) in pbs and heating on a hot plate in the hood (setting of 5-6) until the aldehyde goes into solution. keep the bottle cap loosened so that pressure does not build up. cool down to 20oc and ph to 7.4. a

13、lternatively, cells may be fixed in 100% methanol at -20oc for 3 minutes. if methanol fixation is used skip to step 4. wash in pbs 3 x 10 min. permeabilize in 0.2% triton x-100 plus 1% normal goat serum (ngs) in pbs/ph 7.3 for 5 minutes on ice. wash in pbs + 1% ngs 3 x 10 min. incubate in the approp

14、riate concentration of primary antibody for 1 hour at room temp. in a humidified chamber. if using 22mm x 22mm square coverslips, 30 ul of diluted antibody is placed on the coverslip and the coverslip is inverted onto a glass slide. the slide is then placed in the humidified chamber which is incubat

15、ed at room temp. wash in pbs + 1% ngs 3 x 10 min. incubate in secondary antibody (fitc or texas red conjugated) at a dilution of 1:50 for 1 hour in a humidified chamber at room temp. wash in pbs 4 x 10 min. mount coverslip with a drop of mounting medium (see fluorescence mounting medium protocol) an

16、d seal coverslip with clear nail polish to prevent drying and movement under the microscope.liguofan wrote:多聚甲醛固定24孔中加多少?。?0.5-1.0 ml;liguofan wrote:加1抗，不用濕盒，如何防干燥？用個(gè)大飯盒，加上水，蓋上蓋，過夜？parafilm覆蓋，或?qū)overslips倒扣在載玻片上后照你的方法，另外飯盒里可以放上紗布；liguofan wrote:封片如何做？如果立即觀察、拍照，可以用pbs封片，若放置一定時(shí)間則請(qǐng)用水溶性封固劑封片并置4度保存。背景非特異

17、熒光較多, 加一抗或二抗前是否有必要加用動(dòng)物血清溫育一遍? 我們用1%bsa封閉半個(gè)小時(shí)。能否直接在6孔板或者12孔內(nèi)操作?可以的，選擇合適的蓋玻片。我們一直這么做。是否需要封片?用什么為好?直接觀察，不用封。如果要封，可用香柏油一滴。若在培養(yǎng)箱內(nèi),是否還有必要用濕盒?不用也可以。玻片用95%浸泡多久,泡后還用二蒸水沖凈再高壓?95%的酒精泡1-2個(gè)小時(shí)，三蒸水沖凈，用紗布包好裝飯盒高壓。熒光素標(biāo)的二抗及一抗能用pbs配嗎?(0.02m)可以。每次試驗(yàn)時(shí)，需設(shè)置以下三種對(duì)照：（1） 陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物（2） 陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物（3） 熒光標(biāo)記物對(duì)照：pbs+熒光標(biāo)記物

18、parafilm或coverslips起的作用：可以減少抗體用量（窮啊，沒辦法），還可以減小撒開來的概率；封片用pbs，還是甘油，即刻觀察、拍照情況下無所謂的，至于量嗎，盡量少就是了，但前提是封好片別出現(xiàn)氣泡哦（要練的）。 1、將爬有細(xì)胞的蓋玻片，pbs洗3次，每次3分鐘。2、加入4多聚甲醛，固定10分鐘，pbs洗3次。3、用含0.2tritonx-100 的pbs溶液透化固定后的細(xì)胞3分鐘，pbs洗滌細(xì)胞3次。4、在parafilm膜上滴加5bsa封閉液50l，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在封閉液上，室溫封閉20分鐘。甩去多余液體，不洗。5、在parafilm膜上加一抗，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在抗體上，置濕盒中于37孵箱中孵育2小時(shí)。陰性對(duì)照用pbs代替一抗。6、pbs洗3次, 每次5分鐘。7、在parafilm膜上加二抗50，將蓋玻片有細(xì)胞的一面向下蓋在二抗上，37孵育30分鐘。8、pbs洗3次, 每次5分鐘。9、在parafilm膜上加sabc試劑50