細(xì)胞免疫熒光步驟[1]（干貨分享）

1、細(xì)胞免疫熒光步驟方法一:1. 首先需要把細(xì)胞養(yǎng)在玻璃片上(懸浮細(xì)胞需要用多聚賴氨酸包被過的玻璃片)2. 然后在4PA里面室溫下固定30分鐘，B洗兩次，0.1 TX100室溫下作用12分鐘使細(xì)胞膜通透。3. 接下來進(jìn)行熒光標(biāo)記,需要在一個大的容器（面積大,扁平狀的，比如大的培養(yǎng)皿）里面，放一張用水打濕的濾紙，以保持濕度。4. 剪一片合適大小的prfilm,在上面滴上稀釋在1S/T中的一抗（稀釋倍數(shù)依具體抗體而定），每個玻璃片0ul足夠,把玻璃片蓋在上面（細(xì)胞面朝下）,室溫下孵育0分鐘，然后在PB里洗三次。5. 接下來二抗孵育步驟同上。6. 最后，在載玻片加上ountingmedium(大約每個玻

2、璃片加10u)，把玻璃片放上去（細(xì)胞面朝下），37度30分鐘，然后就可以在熒光顯微鏡下觀察了。7. 抗體很重要，不能有非特異性結(jié)合。你可以先做W檢測一下你的抗體,看看有沒有雜帶。8. 雙標(biāo)的話，可以把兩個一抗一起加或者分別標(biāo)記兩次（可以都試一下看看那種方法合適）。如果一個抗體需要二抗，一個是直接熒光標(biāo)記的，可以把熒光標(biāo)記的那個和另外一個的二抗一起加。方法二：1. 選取一抗時要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rbi和rt的抗體,二抗則是不同熒光信號標(biāo)記 的，我用的是ony trabbiFITC（綠）和dokeyanti-at-xRed（紅）。2. 我的做法是兩種一抗同時孵育,然后兩種二抗同時

3、孵育.抗體濃度、孵育時間要仔細(xì)摸索，我感覺一抗4度孵育過夜比較好，背景比較清晰。3. 我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG,熒光標(biāo)記物對照是PBS+熒光標(biāo)記物。4. 封閉血清與二抗來源動物一致,我用的是1的正常doney血清.5. 其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作.方法三：1. 片子的制作：可以做細(xì)胞爬片，細(xì)胞甩片,還有直接在2wel/12well/6wll中直接染色2. 細(xì)胞爬片的制作：直接購買公司的已經(jīng)處理過的細(xì)胞爬片，要是自己制作的話，就用無菌的蓋玻片用多聚賴氨酸處理后讓細(xì)胞自己爬片3. 細(xì)胞甩片:需要甩片機(jī)將細(xì)胞懸液均勻甩到玻片上。4. 其實小的wel的話,

4、可以直接拿來染色，沒問題的。5. 固定:用PBS洗去培養(yǎng)液,用固定液(如甲醇和丙酮；多聚甲醛;酒精.。)固定細(xì)胞。6. 內(nèi)源性過氧化物酶處理，3%過氧化氫處理細(xì)胞(選作，二抗連HRP得必做,其他的如做免疫熒光染色不用做).7. 通透（胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白需要做;細(xì)胞膜蛋白不需要做)，一般選用Titon10來做細(xì)胞通透，濃度和時間需要摸索，一般是0。15%,處理時間為1-30分鐘，級個別需要到12小時。8. 封閉:洗去通透液，用二抗同源的血清約1的濃度inPB中封閉半小時，也可以選用50%脫脂奶粉。封閉結(jié)束后千萬不要洗,直接上一抗。9. 一抗：具體你想做什么樣的蛋白,咨詢抗體公司如ana crz

5、e,Abcm，igma.。.選取具體的抗體，但是一抗的稀釋濃度也是要摸索，抗體稀釋液可以購買抗體公司現(xiàn)成的，對于新手還是挺好的。時間一般是度過夜或者37度1小時。一抗最好還是選用外國抗體公司的抗體。.感謝聆聽.10. 洗去一抗。11. 上二抗,二抗一般抗體公司會給你推薦的，你在其中選上一個就行了，自己選國產(chǎn)的也行,就是選在哪個動物體內(nèi)做的一抗,二抗就選抗那個動物的就行了。二抗的濃度也是需要摸索的，抗體稀釋液和一抗相同就行了。二抗的時間一般是37度半小時。12. 底物顯色（選作，二抗連得是酶的必做，按試劑盒的說明書添加就行了，顯色時間可能需要摸索，以免顯色過度引起假陽性；二抗連得是熒光報告的不用

6、做）13. 洗去二抗,染核14. AP或者Hect染核15. 洗去染核液,加PS,上鏡觀察。方法四：(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞,在傳代培養(yǎng)時,將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（00rpm,5min）2次,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。.感謝聆聽.(2) 固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4保存3個月。PBS洗滌3 min。(3) 通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前,對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，

7、以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì).通透的時間一般在5-1min。通透后用PBS洗滌35 min。(4) 封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉,時間一般為30n。 (5) 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗. (6) 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PB漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次. (7) 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。方法五:1 漂洗血清蛋白PH7。2-4，37度B 2小時2 20度甲醇固定分鐘后，自然、干燥 1分鐘3 P洗凈：min*34 1%iton：25in30min。配成50

8、ultiton+lBS5 PS洗凈：2*min6 羊血清封閉：37度,20分鐘7 一抗，度過夜，一般要大于1小時或者7度-2小時8 度 PS洗凈，3in*5次9 二抗 37度小于一小時10 37度 PBS洗凈,33in11 涼干封片（封閉液P8。） 細(xì)胞免疫熒光步驟：1細(xì)胞爬片；首先是玻片的處理,普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊，先用洗衣粉洗干凈,用水沖靜烤干，然后泡酸過夜，撈酸后流水洗凈，烤干,置于器皿中高壓滅菌，然后再烤箱中大約小時烤干備用。爬片可以在培養(yǎng)皿六孔板或24孔板中都可，我選擇在培養(yǎng)皿中爬。一為節(jié)約經(jīng)費(fèi)（培養(yǎng)皿可以重復(fù)利用)二來覺得培養(yǎng)皿口大，操作比較方便。培養(yǎng)皿消毒同

9、上,消毒時記得消兩把鑷子具體操作是：用胰酶消化好細(xì)胞，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液(注意：這一點很重要,關(guān)系到將來爬出來片子的質(zhì)量）取出消毒的培養(yǎng)皿,可以先加少量培養(yǎng)基（以使玻片與培養(yǎng)皿緊密接觸），將玻片小心放入擺放其中,然后將單細(xì)胞懸液一滴一滴的滴到玻片上.最后蓋上培養(yǎng)皿置于37度5CO2的暖箱中培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞生長狀況,2小時或更長時間適時取出爬片。爬片置于37度B中洗三次,每次3到5秒鐘,然后在4多聚甲醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時操作過程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹膠粘在載玻片

10、上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續(xù)實驗,要不然玻片會掉下來的，就又是前功盡棄了做好的細(xì)胞爬片可以放在-20保存?zhèn)溆?具體能保存多長時間不太清楚，當(dāng)然盡量早用。2.4%多聚甲醛固定10mi（固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+0丙酮）；3PBS漂洗5min；40.5riton 穿孔1min（丙酮固定法不用透化處理);5.PBS漂洗2次,每次5m；61BS封閉min;加入1A稀釋的一抗，于37雜交h;8PB漂洗2次，每次5mn；.加入1SA稀釋的二抗，于3雜交1h；10.PB漂洗2次,每次mn；15ug/ml DAPI染色2min;12?？勾銣绶馄瑒┓馄？勾銣绶馄瑒?2.5DABCO (w/v）0m Tis(p。0）90甘油細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定10（固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70甲醇+3%丙酮)PB漂洗5min0.5%riton 穿孔1mn（丙酮固定法不用透化處理）PBS漂洗2次，每次in1SA封閉3m加入1%BS