醫(yī)學生物分子的分離純化

1、生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸、糖 復合物等） 生物分子（Biomolecule）泛指生物體特有的各類 分子，是自然存在于生物體中的分子的總稱，是組 成生命的基本單位。 包括 小分子（如脂類、激素、維生素等） 5）能人工合成與改造。 生物分子是生物所特有的有機化合物， 具有如下主要特征： 1）結(jié)構(gòu)復雜有序、具有特殊的層次； 2）行使專一的功能； 3）代謝是其存在的條件； 4）生物分子體系具有自我復制的能力； 一、生物大分子的制備 生物大分子指的是作為生物體內(nèi)主要 活性成分的各種分子量達到上萬或更 多的有機分子。常見的生物大分子包 括蛋白質(zhì)、核酸、脂類、糖類。 （1）分離純化方法千差萬別，沒有一種標準

2、方法 可通用于各種生物大分子的分離制備； （2）制備幾乎都是在溶液中進行的，難以準確估 計和判斷pH值、溫度度等各種參數(shù)對溶液中各 種組份的綜合影響 生物大分子的制備有以下主要特點： （3）大多數(shù)生物大分子的含量極微，分離純化的 步驟多，流程長，有的目的產(chǎn)物甚至要經(jīng)過幾十 步的操作才能達到所需純度； （4）分離純化過程中要保證目標產(chǎn)物的活性。 生物大分子制備的一般步驟：生物大分子制備的一般步驟： 確定制備的目的和要求確定制備的目的和要求 文獻調(diào)研和預備性實驗文獻調(diào)研和預備性實驗 建立相應的可靠的分析測定方法建立相應的可靠的分析測定方法 材料的破碎和預處理材料的破碎和預處理 分離純化方案的選擇和

3、探索分離純化方案的選擇和探索 產(chǎn)物純度的鑒定產(chǎn)物純度的鑒定 產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。產(chǎn)物的濃縮，干燥和保存。 科研、開發(fā)或 發(fā)現(xiàn)新的物質(zhì) 制備的關(guān) 鍵 要求達到一維電泳一 條帶，二維電泳一個 點，或HPLC和毛細 管電泳都是一個峰 最困難 的過程 掌握目的產(chǎn) 物 的理化性質(zhì) 特異性強 準確度高 靈敏度高 使用快捷方便 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣， 主要是利用它們之間理化性質(zhì)的差異。 根據(jù)作用原理生物分子的分離、純化可分為以下幾種類型： （1）根據(jù)分子極性大小和溶解度的不同，如溶劑提取技術(shù)、 鹽析法、分配層析法、分級沉淀法等； （2）根據(jù)分子形狀和大小不同，如凝膠過濾層析等； （3）根

4、據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)不同，如選擇性吸附與吸附層析法等； （4）根據(jù)分子帶電性（電離性質(zhì)）的差異，如離子交換層析、 電泳、等電聚焦法等。 （5）根據(jù)配體特異性，如親和層析。 破碎方法應用 機械法研磨法細菌、酵母 勻漿法機體軟組織 搗碎法動物韌性組織 化學法酶解法細菌、酵母 去垢劑組織、細胞 有機溶劑細菌、酵母 物理法反復凍融法細胞 超聲波法細胞懸液 低滲裂解法紅細胞 冷熱交替法細菌、病毒 常用破碎方法常用破碎方法 影響提取效果的因素影響提取效果的因素 （1）pH值 （2）鹽濃度（即離子強度） （3）溫度 （4）水解酶 （5）攪拌與氧化 （6）有機溶劑 生物大分子的分離純化生物大分子的分離純化 （1）鹽

5、析法 （2）有機溶劑沉淀法 (3) 透析 (dialysis) 利用透析袋 把大分子蛋 白質(zhì)與小分 子化合物分 開的方法。 含蛋白溶 液透析袋 透析液 磁子 電磁攪拌器 二、核酸的分離純化 核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者， 是基因表達的物質(zhì)基礎(包括DNA與RNA)。 無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要 對核酸進行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。 DNA與RNA理化性質(zhì)及細胞定位上的差異決定了 兩者的最適分離與純化條件的不同 分離純化的原則 一是保持核酸堿基序列的完整性。二是盡量清 除其它分子的污染，保證核酸制品的純度。 意義：遺傳信息全部儲存在一級

6、結(jié)構(gòu)之中， 核酸的一級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以 及和其他生物大分子結(jié)合的方式。 對于核酸的純化應達到以下三點要求： 1）核酸樣品中不存在過高濃度的金屬離子和對 酶有抑制作用的有機溶劑； 2）其它生物大分子如蛋白質(zhì)、脂類和多糖分子 的污染應降至最低程度； 3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時 應去除RNA，提取RNA分子時應去除DNA。 保持核酸的完整性 在整個操作過程中應盡量避免各種有害因素對 核酸的破壞。 1）溫度不要過高(04)；(高溫破壞氫鍵) 2）控制pH值范圍(pH值4-10);(極端酸堿破 壞磷酸二酯鍵) 3）保持一定離子強度; 4）減少物理因素對核酸的機械剪切力.

7、核酸制備的技術(shù)路核酸制備的技術(shù)路 線線 核酸的濃縮、沉淀與洗滌 隨著提取試劑的逐步加入，去除雜質(zhì)時的丟失， 樣品中核酸的濃度會逐步下降，當不能滿足后 續(xù)研究與診斷所需時應對樣品進行濃縮。 沉淀是濃縮核酸的最常用且高效的方法， 優(yōu)點： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。 核酸的鑒定與保存 （一）核酸的鑒定 1. 濃度鑒定 核酸濃度的測定可通過紫外分光 光度法與熒光光度法進行。 紫外分光光度法：該法是基于核酸分子中的堿 基具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)因而可以吸收紫外線， 其最大吸收波長為260nm，這一物理特性。 前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖 及其他核

8、酸污染。測定濃度應大于0.25 g/ml 熒光光度法：核酸在熒光染料溴化乙錠 （ethidium bromide，EB）嵌入堿基平面后， 本身無熒光的核酸在UV激發(fā)下發(fā)出紅色熒光， 且熒光強度的積分與溶液中核酸的含量呈正 比。 純度鑒定 紫外分光光度法或熒光光度法皆 可用于核酸制品的純度鑒定。 紫外分光光度法：該法主要通過A260與A280 的比值來判定有無蛋白質(zhì)的污染。在TE緩沖液 中，純DNA的A260/A280為1.8，純RNA的比值為 2.0。比值升高與降低均提示不純。 熒光光度法：用EB等熒光染料示蹤的核酸電 泳結(jié)果可判定核酸制品的純度。DNA分子較RNA 大得多，電泳遷移率低。 完

9、整性鑒定 瓊脂糖凝膠電泳法：以EB為示蹤劑的核酸凝膠電泳結(jié) 果為依據(jù)?；蚪MDNA片段如發(fā)生降解，電泳圖呈拖 尾狀。完整的或降解很少的總RNA電泳圖譜中，三條 帶的熒光強度積分應呈特定的比值，如有改變則提示 有RNA的降解。此外，若在點樣孔附近有著色條帶， 則說明存在DNA 的污染。 其它方法：必要時，還可通過一些特殊的實驗來鑒定 RNA的完整性。 如小規(guī)模的cDNA第一條鏈的合成反應，已知大小的某 種mRNA的Northern雜交等 (1) 對DNA DNA樣品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保 存；在-70可保存數(shù)年 長期保存樣品中可加入1滴氯仿。 (2) 對RNA RNA樣品溶于0.

10、3 mol/L NaAc (pH5.2)或雙 蒸滅菌水中，-70 保存; 長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧釩 核糖核苷復合物)凍貯于-70,可保存數(shù)年。 （二）核酸的保存 盡管基因組DNA因來源、性質(zhì)以及制備的目的 不同，其分離純化的方法不盡相同，但有關(guān)分 離純化的原則、主要步驟、主要技術(shù)、主要試 劑及其作用原理是一樣的?；蚪MDNA分離純 化的一般程序見圖7-4。 真核基因組DNA的分離純化 真核 基因 組DNA 分離 純化 的一 般技 術(shù)路 線 1、酚抽提法、酚抽提法(SDS法）法） 本法最初于1976年由Stafford及其同事提出，

11、 通過改良，以含EDTA、SDS及無DNA酶的RNA酶裂 解緩沖液破碎細胞，經(jīng)蛋白酶K處理后，用 pH8.0的Tris飽和酚抽提DNA，重復抽提至一定 純度后，根據(jù)不同需要進行透析或沉淀處理獲 得所需的DNA樣品。 裂解液中： EDTA：離子螯合劑，抑制DNase活性，降低細胞 膜穩(wěn)定性 SDS：溶解細胞膜、核膜，乳化脂質(zhì)、蛋白，并 使其變性沉淀，同時變性DNase 無DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白質(zhì) 酚：變性沉淀蛋白，抑制DNase活性 pH 8.0的Tris溶液保證抽提時DNA進入水相，防 止DNA變性 q SDS SDS法流

12、程圖法流程圖 （以動物組織為例）（以動物組織為例） 動物組織動物組織 細胞裂解細胞裂解 上層溶液上層溶液組織勻漿組織勻漿 抽提抽提 干燥溶解干燥溶解 離心洗滌離心洗滌 酒精沉淀酒精沉淀 DNA溶液溶液 2 2、 甲酰胺解聚法甲酰胺解聚法 該法操作步驟少，但耗時，所得DNA濃度低，適用于 制備大片段DNA 1987年Kupiec等報道了甲酰胺（formamide）解 聚法，該法的細胞裂解與蛋白質(zhì)水解同酚抽提法 相似，但不進行酚的抽提，而是以高濃度的甲酰 胺裂解DNA與蛋白質(zhì)的復合物（即染色質(zhì)），然 后通過火棉膠袋的充分透析以除去蛋白酶K和有 機溶劑。 3 3、玻棒纏繞法、玻棒纏繞法 用該法收集高

13、分子量DNA的沉淀始于20世紀30年代， 現(xiàn)今使用的纏繞法是以1987年Bowtell的方法經(jīng)改 進而來。 本法有兩個關(guān)鍵步驟：一是基因組DNA沉淀在細胞 裂解液和乙醇的交界面；二是將DNA沉淀纏繞在帶 鉤玻棒上。帶鉤玻棒將大片段DNA從無水乙醇中轉(zhuǎn) 移至pH8.0的TE緩沖液中。 該法以鹽酸胍裂解細胞，制備的DNA片段約有80kb， 適用于同時從不同細胞或組織標本中提取DNA 物理方式物理方式：玻璃珠法、：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、超聲波法、研磨法、 凍融法凍融法 化學方式化學方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法：異硫氰酸胍法、堿裂解法 生物方式生物方式：酶法：酶法 q根據(jù)細胞裂解方式的不同有：根

14、據(jù)細胞裂解方式的不同有： 吸附材料結(jié)合法：吸附材料結(jié)合法： q根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有： 硅質(zhì)材料硅質(zhì)材料 陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂 磁珠磁珠 高鹽低高鹽低pHpH值結(jié)合核酸，低鹽高值結(jié)合核酸，低鹽高pHpH值洗脫值洗脫 快捷高效?？旖莞咝?。 低鹽高低鹽高pHpH值結(jié)合核酸，高鹽低值結(jié)合核酸，高鹽低pHpH值洗脫值洗脫 適用于純度要求高的實驗。適用于純度要求高的實驗。 磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目 的物，從而達到分離目的。的物，從而達到分離目的。 濃鹽法濃鹽法： 有機溶劑抽提法：有機溶劑抽提法： 密度梯度離心法：密度

15、梯度離心法： 利用利用RNP和和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離 有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用 利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物 基因組基因組DNADNA片段的純化片段的純化 純化的原則與要求純化的原則與要求 純化的方法有透析、層析、電泳及選擇性沉淀 等。無論采用何種方法從何種支持介質(zhì)中純化 與回收所需要的DNA片段都要注意兩個原則： 一是提高片段的回收率； 二要清除回收的DNA樣品中的污染。 1.回收率 為提高DNA片段的回收率，可 通

16、過提高DNA樣品的上樣量和選擇適宜 的方法與材料而實現(xiàn)。 2. 純度 常用的純化方法包括有機溶劑 抽提法與商品化的柱層析法（column chromatography）。 柱層析法采用的是陰離子交換層析的原理 從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段 從瓊脂糖凝膠中純化DNA片段的方法主要有 二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE） -纖維素（cellulose）膜插片電泳法 電泳洗脫法（透析袋及非透析袋電泳洗脫法） 冷凍擠壓法 低熔點瓊脂糖凝膠挖塊回收法等。 從聚丙烯酰胺凝膠回收DNA片段 從聚丙烯酰胺凝膠中回收DNA的標準方法是壓碎 與浸泡法。它是將含待回收DNA條帶的凝膠塊切

17、 出，用吸頭或接種針將其壓碎，然后以洗脫緩沖 液浸泡，使DNA洗脫出來。 該方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA，依 分子量不同，其回收率從小于30%至大于90%不等。 回收的DNA純度極高，無酶抑制劑，也無對轉(zhuǎn)染 細胞或微注射細胞有毒的污染物，雖費時但操作 簡單，是小片段DNA回收的較好方法。 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA DNA的提取與純化 的提取與純化 質(zhì)粒DNA的提取與純化的經(jīng)典方法包括： 堿裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等 這些方法主要由質(zhì)粒DNA的擴增、質(zhì)粒DNA的 釋放、質(zhì)粒DNA的分離純化三個步驟組成 1、堿裂解法、堿裂解法 在NaOH提供的高pH（12.012.6）條件下，用

18、強 陽離子去垢劑SDS破壞細胞壁，裂解細胞，與 NaOH共同使宿主細胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生 變性，釋放出質(zhì)粒DNA。 q堿裂解法原理堿裂解法原理 染色體染色體DNADNA比質(zhì)粒比質(zhì)粒DNADNA分子大得多，且染色體分子大得多，且染色體DNADNA為為線狀分線狀分 子，而質(zhì)粒子，而質(zhì)粒DNADNA為共價閉合環(huán)狀分子；為共價閉合環(huán)狀分子； 當用堿處理當用堿處理DNADNA溶液時，線狀染色體溶液時，線狀染色體DNADNA容易發(fā)生變性，共容易發(fā)生變性，共 價閉環(huán)的質(zhì)粒價閉環(huán)的質(zhì)粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH時即恢復其天然構(gòu)象；時即恢復其天然構(gòu)象； 變性染色體變性染色體DNADNA片段

19、與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉 淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNADNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相分子則以溶解狀態(tài)存在液相 中，從而可通過離心將兩者分開。中，從而可通過離心將兩者分開。 盡管堿溶液能破壞DNA中的堿基配對，但CCC 質(zhì)粒DNA因纏繞緊密而不易解鏈，只要不在堿 性條件下變性太久，當pH調(diào)至中性時，CCC質(zhì) 粒DNA就可重新恢復天然的超螺旋。 該法操作簡單、重復性好且成本低，制備的 質(zhì)粒純度能滿足DNA測序與PCR等實驗要求， 是使用最廣泛的方法 q堿裂解法流程圖堿裂解法流程圖 對數(shù)期菌體對數(shù)期菌體 溶液溶液III中和中和 溶液溶

20、液I充分重懸充分重懸 溶液溶液II裂解裂解 上清液上清液 抽提抽提 離心洗滌離心洗滌 酒精沉淀酒精沉淀 干燥溶解干燥溶解 沉淀沉淀 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA溶液溶液 2 2、SDSSDS裂解法裂解法 SDS裂解法是將細菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中， 用溶菌酶和EDTA處理以破壞細胞壁，去壁細菌 再用SDS裂解，從而溫和地釋放質(zhì)粒DNA到等滲 液中，然后用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì) 粒DNA 由于條件溫和，該法特別適用于大質(zhì)粒DNA （15kb）的提取。但有一部分質(zhì)粒DNA會與細 胞碎片纏繞在一起而丟失，故產(chǎn)率不高。 3、煮沸裂解法、煮沸裂解法 該法條件劇烈，只能用于小質(zhì)粒DNA的制備 煮沸裂解法是將細菌

21、懸浮于含Triton X-100和溶菌 酶的緩沖液中，Triton X-100和溶菌酶破壞細胞壁 后，沸水浴裂解細胞的同時可破壞DNA鏈的堿基配 對，并使宿主細胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA變性，但 CCC質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會解鏈。當溫度下降后， CCC質(zhì)粒DNA可重新恢復其超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去 除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA，然后回收上清中的 質(zhì)粒DNA。 質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的純化的純化 1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的連續(xù)密度梯度，在過量EB存 在的條件下，各種不同密度的物質(zhì)經(jīng)離心平 衡后得以分開。 2、聚乙二醇沉淀法 （一種分級沉淀法） 3、柱層析法 （樹脂） RNA極易被RNa

22、se水解，除胞內(nèi)的RNase外，它還 廣泛存在于人的皮膚、唾液、汗液及周圍的環(huán)境 中；RNase分子結(jié)構(gòu)中二硫鍵的存在使其生物學 活性非常穩(wěn)定，加熱煮沸及一般的變性劑均不能 使其完全滅活，而且去除變性劑（denaturant） 后，RNase的活性又可恢復。 因此，在RNA的制備過程中，排除RNase的污染及 強有力地抑制其活性是RNA制備成功與否的關(guān)鍵 真核細胞RNA的分離純化 為獲得完整的RNA分子，必須在總RNA提取分離的最 初階段，盡可能地滅活胞內(nèi)RNase的活性。 選擇性地使用RNase的變性劑（如酚、氯仿及強烈 的胍類變性劑）。 蛋白酶K和能與蛋白質(zhì)結(jié)合的陰離子去污劑如SDS、 十

23、二烷基肌氨酸鈉或脫氧膽酸鈉，并聯(lián)合使用 RNase的特異抑制劑（如RNasin與DEPC等）能極大 地防止內(nèi)源性RNase對RNA的降解。 此外，在變性液中加入-疏基乙醇、二硫蘇糖醇 （DTT）等還原劑可以還原RNase中的二硫鍵，有利 于RNase的變性、水解與滅活。 由Chomczynski和Sacchi 于1987年提出。它以 含4mmol/L的(異)硫氰酸胍與0.1mmol/L的-巰 基乙醇的變性溶液裂解細胞，然后在pH4.0的酸 性條件下，用酚/氯仿抽提裂解溶液，最后通過 異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌來制備RNA。 。 本法具有簡便、快速、經(jīng)濟、高效及提取的RNA 質(zhì)量高等優(yōu)點，能在

24、3小時內(nèi)迅速處理多個標本 酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 分離總RNA mRNAmRNA的分離純化的分離純化 與序列明確的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同， 真核生物的mRNA在細胞中含量少，種類多且分 子量大小不一。除血紅蛋白及組蛋白的mRNA外， 絕大多數(shù)mRNA在其3末端帶有長短不同的poly （A）尾巴。 依據(jù)mRNA的結(jié)構(gòu)特征，利用堿基配對原則，通 過oligo（dT）-纖維素或poly（U）-瓊脂糖凝 膠的親和層析，可以很容易地從總RNA制品中 分離純化mRNA。 1、oligo（dT）-纖維素柱層析法 2、oligo（dT）-纖維素柱離心法 3、oligo（dT）-

25、纖維素液相結(jié)合離心法 4、磁性球珠分離法 該法聯(lián)合利用了oligo（dT）與poly（A）的 互補配對、生物素（biotin）與鏈親和素 （streptavidin）的結(jié)合特異性以及磁性分 離原理，可對poly（A）+RNA進行高效、靈 敏及快捷的分離。 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 + 總RNA中的poly(A) +RNA分子 退火形成雜交體 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5 鏈親和素標記的磁珠 + Streptavidin- 磁 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTT

26、T-Biotin5Streptavidin- 磁 生物素與鏈親和素的特異性結(jié)合 磁性分離 5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁鐵3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁 洗滌與洗脫 水相(含純化的mRNA)固相 生物素標記的oligo(dT) 磁鐵 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin- 磁 圖 3-2 磁珠分離法純化poly(A) +RNA的原理 5、其它方法 Poly(U)-凝膠層析法: 利用 Poly(U)與 Poly(A)的互補配對原理 Poly(U)-濾紙法: 將總RNA加到共價交

27、聯(lián)有 Poly(U)的濾紙上,經(jīng)洗滌后加熱洗脫 q 蛋白質(zhì)的去除：蛋白質(zhì)的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用變性劑變性（使用變性劑變性（SDSSDS、異硫氰酸胍等）、異硫氰酸胍等） 高鹽洗滌高鹽洗滌 蛋白酶處理蛋白酶處理 q 多糖的去除：多糖的去除： 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/21/2體體 積的積的5M NaCl5M NaCl，高鹽可溶解多糖。，高鹽可溶解多糖。 用多糖水解酶將多糖降解。用多糖水解酶將多糖降解。 在提取緩沖液中加一定量的氯苯在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2(1/2體積體積) )，氯苯可，氯苯可 以與多糖的羥基作

28、用，從而去除多糖以與多糖的羥基作用，從而去除多糖 。 用用PEGPEG8000 8000代替乙醇沉淀 代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入 200l 20% PEG200l 20% PEG8000 8000 ( (含 含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min。 q 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、巰基乙醇、 抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等 加入易與酚類結(jié)合的試劑：如加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVPPVP

29、、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它 們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNADNA的結(jié)合的結(jié)合 q 鹽離子的去除：鹽離子的去除： 7070的乙醇洗滌的乙醇洗滌 1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多 糖、多酚類雜質(zhì)糖、多酚類雜質(zhì) 2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒 精殘留，酒精抑制精殘留，酒精抑制 后續(xù)酶解反應后續(xù)酶解反應 3.3.DNADNA中殘留有金屬離中殘留有金屬離 子子 1.1.重新純化重新純化DNADNA，去除蛋，去除蛋 白、多糖、多酚等雜白、多糖、多酚等雜 質(zhì)（具體方法見前）質(zhì)（具體方法見前） 2.2.重新

30、沉淀重新沉淀DNADNA，讓酒精，讓酒精 充分揮發(fā)充分揮發(fā) 3.3.增加增加7070乙醇洗滌的乙醇洗滌的 次數(shù)（次數(shù)（2-32-3次）次） q問題一：問題一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應。反應。 原原 因因 對對 策策 1.1.材料不新鮮或反復凍材料不新鮮或反復凍 融融 2.2.未很好抑制內(nèi)源核酸未很好抑制內(nèi)源核酸 酶的活性酶的活性 3.3.提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇 烈，烈，DNADNA被機械打斷被機械打斷 4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染 5.5.反復凍融反復凍融 1.1.盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材

31、料避 免反復凍融免反復凍融 2.2.液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍 前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液 3.3.在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料 的的DNADNA時，可增加裂解液中螯合劑時，可增加裂解液中螯合劑 的含量的含量 4.4.細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔 5.5.所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高 溫滅菌溫滅菌 6.6.將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免 反復凍融反復凍融 q問題二：問題二：DNADNA降解。降解。 對對 策策 原原 因因 1.

32、1.實驗材料不佳或量少實驗材料不佳或量少 2.2.破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分 3.3.沉淀不完全沉淀不完全 4.4.洗滌時洗滌時DNADNA丟失丟失 1.1.盡量選用新鮮（幼嫩）的材盡量選用新鮮（幼嫩）的材 料料 2.2.動植物要勻漿研磨充分；動植物要勻漿研磨充分；G G 菌、酵母裂解前先用生物酶菌、酵母裂解前先用生物酶 或機械方式破壁或機械方式破壁 3.3.高溫裂解時，時間適當延長高溫裂解時，時間適當延長 （對于動物細胞、細菌可增（對于動物細胞、細菌可增 加加PKPK的用量）的用量） 4.4.低溫沉淀，延長沉淀時間低溫沉淀，延長沉淀時間 5.5.加輔助物，促進沉淀加輔助物，促進沉淀 6

33、.6.洗滌時，最好用槍頭將洗滌洗滌時，最好用槍頭將洗滌 液吸出，勿傾倒液吸出，勿傾倒 q問題三：問題三：DNADNA提取量少。提取量少。 對對 策策 原原 因因 三、蛋白質(zhì)的分離與純化 蛋白質(zhì)的分離純化是研究蛋白質(zhì)化學組 成、結(jié)構(gòu)及生物學功能、新蛋白質(zhì)的發(fā) 現(xiàn)和疾病分子診斷的基礎；分子克隆中， 下游的處理和分析鑒定，基因工程產(chǎn)品 的制備，也需要蛋白質(zhì)的分離和純化。 蛋白質(zhì)分離純化的總目標是增加制品的純度 （purity）或比活（specific activity）， 以增加單位蛋白質(zhì)重量中靶蛋白的含量或生 物學活性（比活常以活力單位數(shù)/毫克蛋白 質(zhì)表示），即從蛋白混合物中設法去除不要 的雜蛋白

34、和變性的靶蛋白，使靶蛋白的產(chǎn)量 達到最高值。 蛋白質(zhì)分離純化的一般技術(shù)路線 分離純化的總體原則 一是保證靶蛋白結(jié)構(gòu)的完整，防止降解和活性 蛋白質(zhì)的變性； 二是盡量滿足研究與診斷對靶蛋白純度的要求。 純化蛋白質(zhì)總是希望純度和產(chǎn)率均高，例如純 化某種酶，理想的結(jié)果是比活力和總回收率均 高，但實際工作中二者不能兼得，通常在科研 上希望比活力盡可能高，而犧牲一些回收率， 在工業(yè)生產(chǎn)和分子診斷中則正相反。 蛋白質(zhì)分離純化的條件 蛋白質(zhì)是一類結(jié)構(gòu)復雜、有生物活性的生物大分 子，離開天然的存在體系，其結(jié)構(gòu)與活性變得極 不穩(wěn)定，因此從生物材料中提純各種靶蛋白均需 要特定的條件。應注意各種因素對靶蛋白的影響。

35、1. 緩沖液 2. 鹽、金屬離子和螯合劑. 3. 還原劑 4. 去垢劑 5. 增溶劑 6. 蛋白酶抑制劑（pronase inhibitor） 7. 蛋白質(zhì)的環(huán)境因素 表面效應的影響 溫度的影響 儲存 蛋白質(zhì)的分離純化方法蛋白質(zhì)的分離純化方法 蛋白質(zhì)的分離純化是依據(jù)其溶解性、分子質(zhì)量 大小及形狀、電離性質(zhì)和生物學功能的差異而 進行的。分離純化的方法可分類如下： 以溶解度的差異為依據(jù)的方法：鹽析、分配 層析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀和結(jié)晶等； 以分子大小及形狀差異為依據(jù)的方法：差速 離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過濾層析 等； 以電離性質(zhì)差異為依據(jù)的方法：電泳、 離子交換層析等； 以生物學功能

36、專一性為依據(jù)的方法：親 和層析。 鹽析法：鹽析法：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋 白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化 膜被破壞，導致蛋白質(zhì)沉淀。 等電點沉淀法：等電點沉淀法：凈電荷為零，分子之間的靜電 排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。該法適 用于在等電點pH穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。 有機溶劑沉淀法：有機溶劑沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持 低溫），破壞蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)的溶 解度降低而沉淀。 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì) 帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì) 水化膜水化膜 + + + + + + + 帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋

37、白質(zhì) 帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒 酸酸堿堿 酸酸堿堿 酸酸堿堿 脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用 溶液中蛋白質(zhì)的聚沉 加 壓 蛋白質(zhì)溶液 半透膜 支持膜的柵板 超濾液 凝膠過濾層析凝膠過濾層析(gel filtration)(gel filtration) 凝膠過濾層析亦稱凝膠色譜、排阻色譜或分子篩， 是利用凝膠把分子大小不同的物質(zhì)分離開的一種 方法。 凝膠色譜的機理是分子篩效應，在洗脫過程中， 大分子不能進入凝膠內(nèi)部，而沿凝膠顆粒間的空 隙最先流出柱外；而小分子可以進入凝膠顆粒內(nèi) 部的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，路徑長、流速慢，以至最后 流出柱外。

38、因此，混合樣品如同“過篩”一樣， 因分子大小的不同得以彼此分開。 離子交換層析的原理離子交換層析的原理 密度梯度（區(qū)帶）離心：常用蔗糖密度梯度 電電 泳泳蛋白質(zhì)在高于或低于其 pI的溶液中為帶電的顆 粒，在電場中能向正極 或負極移動。這種通過 蛋白質(zhì)在電場中泳動而 達到分離各種蛋白質(zhì)的 技術(shù), 稱為電泳 (elctrophoresis) 。 電泳(elctrophoresis) 幾種重要的蛋白質(zhì)電泳幾種重要的蛋白質(zhì)電泳 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：常用于蛋白質(zhì)分 子量的測定。 每一個蛋白質(zhì)分子都因

39、為結(jié) 合了許多的SDS而帶有大量 的負電荷，而蛋白質(zhì)分子原 有的電荷則可以忽略。由于 所有的蛋白質(zhì)顆粒都帶有大 量的負電荷，而且它們的電 荷密度也大體相同，因此， Eq值接近一個常數(shù)。所以該 法主要利用了蛋白質(zhì)分子量 大小不同而分離蛋白質(zhì)。 等電聚焦電泳（等電聚焦電泳（isoelectric focusingisoelectric focusing，IEFIEF） 通過蛋白質(zhì)等電點 的差異而分離蛋白 質(zhì)的電泳方法。pH 梯度以兩性電解質(zhì) ampholyte（脂肪 族多胺和多羧同系 物）在外電場作用 下自然形成。 雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳two-dimensional two-dimension

40、al electrophoresis electrophoresis 方法原理優(yōu)點缺點 凝膠層析分子篩的排阻效應分辨力高、不會引起 變性 凝膠介質(zhì)昂貴、處理量有 限 離子交換層析各組份與離子交換劑 親和力不同 分辨力高、處理量較 大 需酸堿處理樹脂、操作耗 時 電泳法等電點、分子量、電 荷的差異 分辨力很高、可連續(xù) 制備 儀器試劑昂貴 鹽析法破壞水化膜和中和表 面電荷 操作簡便、成本低、 重復性好、對蛋白有 保護作用 分辨率差、純化倍數(shù)低、 沉淀中混雜鹽分 選擇性沉淀等電點、熱變性、酸 堿變性等沉淀作用 選擇性較強、方法簡 便、種類較多 應用范圍較窄 有機溶劑沉淀脫水作用和降低介電 常數(shù) 操作

41、簡便、分辨較強對蛋白質(zhì)或酶有變性作用 親和層析蛋白質(zhì)與配體之間特 殊的親和力 分辨力很高局限性大 高速與超速離心沉降系數(shù)或密度差異操作方便、容量大設備昂貴 制備HPLC凝膠過濾、離子交換、 反向色譜等 分辯力很高、步驟少，儀器昂貴 常用的蛋白質(zhì)分離純化方法 蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物 形式存在，每種類型的細胞都含有成千上 萬種不同的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的分離純化往 往要采取多種方法聯(lián)合使用，并通過預實 驗進行條件優(yōu)化，逐步地制備高純度或高 比活的靶蛋白，實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離純化的目 標 蛋白質(zhì)樣品的純度鑒定蛋白質(zhì)樣品的純度鑒定 蛋白質(zhì)的純度（purity）一般指是否含有其 它雜蛋白，而不包括鹽、

42、緩沖液離子、SDS等 小分子在內(nèi)，一定條件下的相對均一性。目 前常用的鑒定純度的方法有：有聚丙烯酰胺 凝膠電泳（PAGE）、SDS-PAGE、毛細管電泳 （CE）、等電聚焦電泳（IFE）及高效液相色 譜（HPLC）。此外，還有超速離心法、蛋白 質(zhì)的化學組成和結(jié)構(gòu)分析法。 蛋白質(zhì)的定量和分子量測定蛋白質(zhì)的定量和分子量測定 蛋白質(zhì)的定量，通常是指測定溶液中的蛋白 質(zhì)濃度。測定蛋白質(zhì)總量的方法很多，最早 的經(jīng)典方法是凱氏定氮法，此法雖有普遍性， 但操作繁瑣，目前極少使用。 應用較為廣泛的方法是雙縮脲法、福林-酚 法和紫外吸收法。 測定蛋白質(zhì)混合物中某一特定靶蛋白的含量 通常要用具有高度特異性的生物學

43、方法?；?性的測定和總蛋白量的測定配合起來可以用 來表示分離純化過程中某一特定靶蛋白的純 化程度。純化程度常用這一特定成分的含量 （一般用活力單位）與總蛋白量（質(zhì)量單位） 之比來表示。 確定了蛋白質(zhì)的均一性后，蛋白質(zhì)的定性 以及一級結(jié)構(gòu)的研究，都需要測定蛋白質(zhì) 的分子質(zhì)量以及亞基和寡聚體的分子質(zhì)量。 測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的方法很多，這此方 法都是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)來測定分子 量的，由此測得的分子量稱為物理分子質(zhì) 量。與物理分子量相對應的是化學分子量， 化學分子量是從化學分析所得的結(jié)果，計 算而得到的最小分子質(zhì)量。 四、生物小分子的提取純化 1、溶劑提取法 2、水蒸氣蒸餾法 3、升華法 4、超臨界流體萃取法 5、超聲提取法 6、固相萃取法 常用提取方法 分離精制的原理主要是根據(jù)： 1）物質(zhì)溶解度差別； 2）物質(zhì)在兩相溶劑中的分配比不同； 3)物質(zhì)的吸附性差別； 4）物質(zhì)分子大小差異等進行分離 常用純化方法 1、逆流分配法（CCD） 2、液滴逆流色譜法（DCCC） 3、高速逆流色譜法（HSCCC） 4、氣液分配色譜（GC或GLC） 5、液-液分配色譜 6、凝膠過濾法 7、超濾法 8、硅膠吸附色譜 9、氧化鋁吸附色譜 10、大孔吸附樹脂吸附色譜 等 Metabolite Regulation of Glycolysis and Gluconeogenesis Glucos