白木香AsJAZ1基因原核載體的構建與表達

1、白木香AsJAZI基因原核載體的構建與表達沉香是我國傳統中藥，其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、 溫中止嘔、納氣平喘等功效。 白木香 Aq-uilaria sinensis （ Lour ） Gilg ，是我國生產沉香的唯一正品植物來源。 白木香是一種典型 的傷害誘導型藥用植物， 其只有受到傷害才能產生沉香， 同時沉 香的產生也被認為是白木香樹防御反應的產物。 沉香的化學成分 組成主要是倍半萜類和苯乙基色酮類衍生物質。沉香的應用廣 泛，市場需求量大，長期以來處于供不應求的現狀。因此，為了 提高白木香結香的產量， 揭示沉香形成的機制迫在眉睫， 且國內 外一些專家學者陸續(xù)開展了沉香結香機制的研究。但

2、至今為止， 沉香結香的機制未得到很好的詮釋。研究表明，TA在誘導白木香結香的過程中扮演重要角色。茉莉酸類物質（JAs）是植物內一種重要的植物激素，同時 也作為傷害信號分子激活相關轉錄因子的活性， 調節(jié)植物的防御 反應。TA信號途徑中的抑制因子 JAZ （Jasmonate ZIM-domain， JAZ）蛋白（JAZs）是調節(jié)JA應答的關鍵因子。當植物未受到外 界脅迫時，體內的JA含量較低，JAZs阻抑相應的轉錄因子，如 MYC2 MYC3 MYC4等的活性，從而JA響應基因被抑制，不能啟 動JA信號途徑；植物一旦受到外界脅迫時， 體內的JA含量迅速 增加， JAZs 阻遏蛋白被 COI1 （

3、coronatine-insensitive protein1 ）結合并通過SCFCOI1/26S蛋白酶體，經泛素化作用降解，轉錄因子被釋放，從而啟動相應的TA應答基因的轉錄。當啟動了 JA應答的同時，JAZs也被誘導，誘導表達的JAZs再次 抑制了轉錄因子的活性， 這種反饋調節(jié)的作用也正是避免植物體 產生過于猛烈的 JA 應答反應對本身的傷害。課題組前期轉錄組 測序結果表明AsJAZI基因是白木香響應外界傷害的過程中JAZs基因家族中表達豐度最高的一個基因響。 本實驗首次報道了白木 香 As-JAZ1 基因原核表達載體的構建及表達， 為篩選互作蛋白因 子，研究基因功能及揭示 JA信號在沉香倍

4、半萜形成中的作用機 制提供了材料基礎。1 材料1.1 植物材料 中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所溫室栽培的 四年生白木香葉片。1.2 菌種及載體 原核表達載體 oET-28a 保存于本實驗室；大腸桿菌TP010感受態(tài)、oGM-T連接試劑盒和Escherichia coli B121 （DE3購于天根生化科技（北京）XX公司。1.3工具酶及主要試劑植物總RNA提取試劑盒、FastHiFidelitv Polvmerase 高保真酶、T4連接酶和 2XTaq PCRMix 購于天根生化科技（北京）XX公司。限制性內切酶BamH和Xho I 購自日本 TaKaRa公司；RevertAid First S

5、trand cDNA SynthesisKit 購于 ThermoFisher SCIENTIFIC 公司；高純度質 粒提取試劑盒購自于北京康為世紀生物科技XX公司；IPTG,氨芐青霉素（Amp，卡那霉素（Kan）和DNALadder Marker購自 于北京全式金XX公司。其他試劑均為國產分析純試劑。本研究 所用引物由上海生工生物工程 XX公司合成，產物測序由英濰捷 基貿易XX公司完成。2 方法2.1白木香總RNA提取及cDNA的合成根據天根生化科技(北京)XX公司的植物總RNA提取試劑盒說明書提取總 RNA禾I 用1%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性和分光光度計 Nan oDrop2000(T

6、her-no Scientific，美國)測定 RNA濃度。利用RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisherSCIENTIFIC公司)反轉錄成cDNA第一鏈，作為基因克隆的模 板。2.2 AsJAZ1基因擴增 根據提交到 NCBI上的白木香 AsJAZ1 基因序列(KP677281)設計特異引物，上游引物加入BamH I酶切位點：5-CGGGATC-CATGGAGAGAGACTTrCTGGGT下游弓 I物 加入 Xho I 酶切位點： 5-CCGCTCGAGTCACTCAGCTrG-TATGGT，GC-3 加下劃線部分即為引入的酶切

7、序列。以白木香cDNA為模板進行PCFT增。PCR體系：快速高產聚合酶 0.5 u L, 5X快速高產PCR 緩沖液 5u L, dNTP Mixture (2.5mmol?L-1 ) 2卩 L,上下游引物(10 u mol?L-1 ) 各 1 u L, cDNAl.Olu L, ddH2O14.5y L,終體 系為25 u L。PCR反應程序：94C預變性5min; 94C變性30s, 53C退火 30s, 72C延伸 1min, 30 個循環(huán)；72C延伸 10min； 4C 保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收并純化目的DNA片段，并與oGM-T克隆載體連接，轉化 E.co

8、li TOP10感受 態(tài)細胞，在含有 X-gal和IPTG的Amp( 100mg?L-1)平板上進行 藍白斑篩選，挑取白斑振蕩培養(yǎng)過夜后，經菌液PCR驗證后，送測序確定陽性克隆( pGM-T-AsJAZ1)。2.3 原核表達載體 pET-28a-AsJAZ1 的構建 將測序后目的基因序列正確的 pGM-T-AsJAZI質粒和pET-28a載體質粒分別用 BamH I和Xho I 進行雙酶切，回收目的片段后，利用T4連接酶16C連接過夜，將連接產物轉化 E.coli TOP10 后，均勻涂布在含有 Kan(50mg.L-1 )的LB固體培養(yǎng)基中，37C倒置培養(yǎng) 1216h。經 菌液PCR和酶切鑒

9、定為陽性的pET-28a-AsJAZ1質粒轉化到 E.coli B121(DE3中進行表達。2.4 AsJAZ1 基因的原核表達 將含有重組質粒 pET-28a-AsJAZ1的E.coli B121 (DE3陽性克隆振蕩培養(yǎng)過夜， 菌液以1: 50稀釋于含有Kan (50mg?L-1)的LB液體培養(yǎng)基中， 37C培養(yǎng)至 A60g 0.6時，加入IVFG至終濃度為1mmol?L-1, 繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心收集菌體，經1X PBS樣品緩沖液重懸，反復 凍融 45 次充分裂解菌體，沸水煮 5min 使蛋白變性后， 12%SDS-PAG電泳檢測分析。2.5 表達條件的優(yōu)化 將過夜培養(yǎng)新鮮的 pET-28

10、a-AsJAZl 的E.coliB121 (DE3菌液以1： 100的體積接種到含有 Kan的 LB液體培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)至 A600約為0.5時，分別加入IPTG 至終濃度為 0.05, 0.1 , 0.25 , 0.5 , 1, 1.5mmol?L-1 , 37C 以200r?min-1振蕩培養(yǎng)4h, 12%SDS-PAG電泳分析。2.6 重組蛋白表達形式的鑒定 誘導結束后，低溫條件下5000r?mi n-1離心10min，收集菌體。按照適當的比例加入適量 的1 x PBS緩沖液重懸菌體，冰水浴超聲破碎菌體，13000r?min-1 離心15min，分別收集上清和沉淀，進行 12%SDS

11、-PAG電泳檢測 分析。3 結果與分析3.1原核表達載體的構建及鑒定 PCR擴增產物經1%瓊脂糖 凝膠電泳鑒定，在1007bD處出現1條特異性DNA條帶，與預期 大小符合，見圖 1。pET-28a-AsJAZ1 的連接產物轉入 E.coliB121 ( DE3 中，進行菌液PCF擴增后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠清晰地看到1條約為1007bp的條帶，見圖2。經菌液PCR鑒定為陽性的克隆， 提取重組子質粒進行雙酶切鑒定，結果見圖3,其中5369b。的大片段為酶切后的載體大小，1007b。為目的DNA目的條帶。將 菌液PCR和雙酶切鑒定為陽性克隆的質粒送測序，測序結果顯示基因的編碼區(qū)序列完全正確，

12、表明目的片段已正確插入 pET-28a 表達載體中。3.2 重組蛋白的誘導表達 將表達載體 pET-28a 轉入 B121(DE3中作為對照，同時誘導含有 oET-28a-AsJAZ1和pET-28a 的B121 (DE3，收集菌體，加上樣緩沖液煮沸5min后，經12%SDS-PAG電泳分析。含oET-28a空載體的質粒無特異蛋白出 現，含有重組質粒 pET-28a-AsJAZ1 的菌體經 IPTG 誘導后，在 39kDa處出現1條特異蛋白條帶，見圖4。3.3 重組蛋白的誘導條件的優(yōu)化 為了增加蛋白的表達量， 設置了不同的IPTG誘導濃度，0.05 , 0.1 , 0.25 , 0.5 , 1

13、, 1.5mmol?L-1，誘導培養(yǎng)4h，見圖5。結果表明，隨著IPTG誘導 濃度的增加，蛋白的表達量隨著增加， 當其終濃度為 0.5mmol?L-1 時，融合蛋白表達量最大；當IPTG濃度繼續(xù)增加，蛋白的表達 量降低。本實驗獨立重復 3 次，結果一致。3.4 重組蛋白的表達形式 菌體超聲破碎后，分別收集上清和沉淀，SDS-PAG電泳分析，沉淀中有明顯的蛋白特異條帶， 上清中的特異條帶較弱， 表明重組蛋白主要以包涵體形式存在于 沉淀中，見圖 6。4 討論JAZ基因蛋白家族是茉莉酸信號途徑中重要的抑制因子，調 控茉莉酸響應基因的表達， 同時它把茉莉酸信號與其他信號通路 相互聯系起來，起到調控樞紐

14、的作用，對 JAZs 的功能的研究有 助于詮釋植物的激素調控網絡。目前，對于 JAZs 的研究已經在水稻、橡膠樹、大豆、葡萄、 番茄和煙草等植物中展開。研究結果表明，JAZs的功能在不同的植物中有所不同。在水稻中過表達 TIF Y11b，可增加籽粒的大 ??；在大豆中過表達 GsJAZ?可增加其對鹽堿的敏感性。JAZs的功能除了在物種間存在差別外， 其家族成員間的功能也不盡相 同。煙草中過表達 Na-JAZd和NaJAZh可分別抑制花蕾脫落和 促進尼古丁的合成。JAZ與不同的互作的因子結合時，可發(fā)揮不 同的功能。 因此，鑒定與 JAZs 互作的因子是研究 JAZs 基因功能 的關鍵。 為研究白木香 As-