白木香AsJAZ1基因原核載體的構(gòu)建與表達(dá)

1、白木香AsJAZI基因原核載體的構(gòu)建與表達(dá)沉香是我國傳統(tǒng)中藥，其味辛、苦，性微溫，具行氣止痛、 溫中止嘔、納氣平喘等功效。 白木香 Aq-uilaria sinensis （ Lour ） Gilg ，是我國生產(chǎn)沉香的唯一正品植物來源。 白木香是一種典型 的傷害誘導(dǎo)型藥用植物， 其只有受到傷害才能產(chǎn)生沉香， 同時沉 香的產(chǎn)生也被認(rèn)為是白木香樹防御反應(yīng)的產(chǎn)物。 沉香的化學(xué)成分 組成主要是倍半萜類和苯乙基色酮類衍生物質(zhì)。沉香的應(yīng)用廣 泛，市場需求量大，長期以來處于供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。因此，為了 提高白木香結(jié)香的產(chǎn)量， 揭示沉香形成的機(jī)制迫在眉睫， 且國內(nèi) 外一些專家學(xué)者陸續(xù)開展了沉香結(jié)香機(jī)制的研究。但

2、至今為止， 沉香結(jié)香的機(jī)制未得到很好的詮釋。研究表明，TA在誘導(dǎo)白木香結(jié)香的過程中扮演重要角色。茉莉酸類物質(zhì)（JAs）是植物內(nèi)一種重要的植物激素，同時 也作為傷害信號分子激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性， 調(diào)節(jié)植物的防御 反應(yīng)。TA信號途徑中的抑制因子 JAZ （Jasmonate ZIM-domain， JAZ）蛋白（JAZs）是調(diào)節(jié)JA應(yīng)答的關(guān)鍵因子。當(dāng)植物未受到外 界脅迫時，體內(nèi)的JA含量較低，JAZs阻抑相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如 MYC2 MYC3 MYC4等的活性，從而JA響應(yīng)基因被抑制，不能啟 動JA信號途徑；植物一旦受到外界脅迫時， 體內(nèi)的JA含量迅速 增加， JAZs 阻遏蛋白被 COI1 （

3、coronatine-insensitive protein1 ）結(jié)合并通過SCFCOI1/26S蛋白酶體，經(jīng)泛素化作用降解，轉(zhuǎn)錄因子被釋放，從而啟動相應(yīng)的TA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)啟動了 JA應(yīng)答的同時，JAZs也被誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)的JAZs再次 抑制了轉(zhuǎn)錄因子的活性， 這種反饋調(diào)節(jié)的作用也正是避免植物體 產(chǎn)生過于猛烈的 JA 應(yīng)答反應(yīng)對本身的傷害。課題組前期轉(zhuǎn)錄組 測序結(jié)果表明AsJAZI基因是白木香響應(yīng)外界傷害的過程中JAZs基因家族中表達(dá)豐度最高的一個基因響。 本實驗首次報道了白木 香 As-JAZ1 基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)， 為篩選互作蛋白因 子，研究基因功能及揭示 JA信號在沉香倍

4、半萜形成中的作用機(jī) 制提供了材料基礎(chǔ)。1 材料1.1 植物材料 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所溫室栽培的 四年生白木香葉片。1.2 菌種及載體 原核表達(dá)載體 oET-28a 保存于本實驗室；大腸桿菌TP010感受態(tài)、oGM-T連接試劑盒和Escherichia coli B121 （DE3購于天根生化科技（北京）XX公司。1.3工具酶及主要試劑植物總RNA提取試劑盒、FastHiFidelitv Polvmerase 高保真酶、T4連接酶和 2XTaq PCRMix 購于天根生化科技（北京）XX公司。限制性內(nèi)切酶BamH和Xho I 購自日本 TaKaRa公司；RevertAid First S

5、trand cDNA SynthesisKit 購于 ThermoFisher SCIENTIFIC 公司；高純度質(zhì) 粒提取試劑盒購自于北京康為世紀(jì)生物科技XX公司；IPTG,氨芐青霉素（Amp，卡那霉素（Kan）和DNALadder Marker購自 于北京全式金XX公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。本研究 所用引物由上海生工生物工程 XX公司合成，產(chǎn)物測序由英濰捷 基貿(mào)易XX公司完成。2 方法2.1白木香總RNA提取及cDNA的合成根據(jù)天根生化科技(北京)XX公司的植物總RNA提取試劑盒說明書提取總 RNA禾I 用1%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性和分光光度計 Nan oDrop2000(T

6、her-no Scientific，美國)測定 RNA濃度。利用RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(ThermoFisherSCIENTIFIC公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，作為基因克隆的模 板。2.2 AsJAZ1基因擴(kuò)增 根據(jù)提交到 NCBI上的白木香 AsJAZ1 基因序列(KP677281)設(shè)計特異引物，上游引物加入BamH I酶切位點：5-CGGGATC-CATGGAGAGAGACTTrCTGGGT下游弓 I物 加入 Xho I 酶切位點： 5-CCGCTCGAGTCACTCAGCTrG-TATGGT，GC-3 加下劃線部分即為引入的酶切

7、序列。以白木香cDNA為模板進(jìn)行PCFT增。PCR體系：快速高產(chǎn)聚合酶 0.5 u L, 5X快速高產(chǎn)PCR 緩沖液 5u L, dNTP Mixture (2.5mmol?L-1 ) 2卩 L,上下游引物(10 u mol?L-1 ) 各 1 u L, cDNAl.Olu L, ddH2O14.5y L,終體 系為25 u L。PCR反應(yīng)程序：94C預(yù)變性5min; 94C變性30s, 53C退火 30s, 72C延伸 1min, 30 個循環(huán)；72C延伸 10min； 4C 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收并純化目的DNA片段，并與oGM-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化 E.co

8、li TOP10感受 態(tài)細(xì)胞，在含有 X-gal和IPTG的Amp( 100mg?L-1)平板上進(jìn)行 藍(lán)白斑篩選，挑取白斑振蕩培養(yǎng)過夜后，經(jīng)菌液PCR驗證后，送測序確定陽性克隆( pGM-T-AsJAZ1)。2.3 原核表達(dá)載體 pET-28a-AsJAZ1 的構(gòu)建 將測序后目的基因序列正確的 pGM-T-AsJAZI質(zhì)粒和pET-28a載體質(zhì)粒分別用 BamH I和Xho I 進(jìn)行雙酶切，回收目的片段后，利用T4連接酶16C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli TOP10 后，均勻涂布在含有 Kan(50mg.L-1 )的LB固體培養(yǎng)基中，37C倒置培養(yǎng) 1216h。經(jīng) 菌液PCR和酶切鑒

9、定為陽性的pET-28a-AsJAZ1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 E.coli B121(DE3中進(jìn)行表達(dá)。2.4 AsJAZ1 基因的原核表達(dá) 將含有重組質(zhì)粒 pET-28a-AsJAZ1的E.coli B121 (DE3陽性克隆振蕩培養(yǎng)過夜， 菌液以1: 50稀釋于含有Kan (50mg?L-1)的LB液體培養(yǎng)基中， 37C培養(yǎng)至 A60g 0.6時，加入IVFG至終濃度為1mmol?L-1, 繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心收集菌體，經(jīng)1X PBS樣品緩沖液重懸，反復(fù) 凍融 45 次充分裂解菌體，沸水煮 5min 使蛋白變性后， 12%SDS-PAG電泳檢測分析。2.5 表達(dá)條件的優(yōu)化 將過夜培養(yǎng)新鮮的 pET-28

10、a-AsJAZl 的E.coliB121 (DE3菌液以1： 100的體積接種到含有 Kan的 LB液體培養(yǎng)基中，37C培養(yǎng)至 A600約為0.5時，分別加入IPTG 至終濃度為 0.05, 0.1 , 0.25 , 0.5 , 1, 1.5mmol?L-1 , 37C 以200r?min-1振蕩培養(yǎng)4h, 12%SDS-PAG電泳分析。2.6 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定 誘導(dǎo)結(jié)束后，低溫條件下5000r?mi n-1離心10min，收集菌體。按照適當(dāng)?shù)谋壤尤脒m量 的1 x PBS緩沖液重懸菌體，冰水浴超聲破碎菌體，13000r?min-1 離心15min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行 12%SDS

11、-PAG電泳檢測 分析。3 結(jié)果與分析3.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖 凝膠電泳鑒定，在1007bD處出現(xiàn)1條特異性DNA條帶，與預(yù)期 大小符合，見圖 1。pET-28a-AsJAZ1 的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 E.coliB121 ( DE3 中，進(jìn)行菌液PCF擴(kuò)增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠清晰地看到1條約為1007bp的條帶，見圖2。經(jīng)菌液PCR鑒定為陽性的克隆， 提取重組子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果見圖3,其中5369b。的大片段為酶切后的載體大小，1007b。為目的DNA目的條帶。將 菌液PCR和雙酶切鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果顯示基因的編碼區(qū)序列完全正確，

12、表明目的片段已正確插入 pET-28a 表達(dá)載體中。3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將表達(dá)載體 pET-28a 轉(zhuǎn)入 B121(DE3中作為對照，同時誘導(dǎo)含有 oET-28a-AsJAZ1和pET-28a 的B121 (DE3，收集菌體，加上樣緩沖液煮沸5min后，經(jīng)12%SDS-PAG電泳分析。含oET-28a空載體的質(zhì)粒無特異蛋白出 現(xiàn)，含有重組質(zhì)粒 pET-28a-AsJAZ1 的菌體經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，在 39kDa處出現(xiàn)1條特異蛋白條帶，見圖4。3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 為了增加蛋白的表達(dá)量， 設(shè)置了不同的IPTG誘導(dǎo)濃度，0.05 , 0.1 , 0.25 , 0.5 , 1

13、, 1.5mmol?L-1，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，見圖5。結(jié)果表明，隨著IPTG誘導(dǎo) 濃度的增加，蛋白的表達(dá)量隨著增加， 當(dāng)其終濃度為 0.5mmol?L-1 時，融合蛋白表達(dá)量最大；當(dāng)IPTG濃度繼續(xù)增加，蛋白的表達(dá) 量降低。本實驗獨立重復(fù) 3 次，結(jié)果一致。3.4 重組蛋白的表達(dá)形式 菌體超聲破碎后，分別收集上清和沉淀，SDS-PAG電泳分析，沉淀中有明顯的蛋白特異條帶， 上清中的特異條帶較弱， 表明重組蛋白主要以包涵體形式存在于 沉淀中，見圖 6。4 討論JAZ基因蛋白家族是茉莉酸信號途徑中重要的抑制因子，調(diào) 控茉莉酸響應(yīng)基因的表達(dá)， 同時它把茉莉酸信號與其他信號通路 相互聯(lián)系起來，起到調(diào)控樞紐

14、的作用，對 JAZs 的功能的研究有 助于詮釋植物的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。目前，對于 JAZs 的研究已經(jīng)在水稻、橡膠樹、大豆、葡萄、 番茄和煙草等植物中展開。研究結(jié)果表明，JAZs的功能在不同的植物中有所不同。在水稻中過表達(dá) TIF Y11b，可增加籽粒的大 小；在大豆中過表達(dá) GsJAZ?可增加其對鹽堿的敏感性。JAZs的功能除了在物種間存在差別外， 其家族成員間的功能也不盡相 同。煙草中過表達(dá) Na-JAZd和NaJAZh可分別抑制花蕾脫落和 促進(jìn)尼古丁的合成。JAZ與不同的互作的因子結(jié)合時，可發(fā)揮不 同的功能。 因此，鑒定與 JAZs 互作的因子是研究 JAZs 基因功能 的關(guān)鍵。 為研究白木香 As-