實(shí)驗(yàn)六胰蛋白酶的結(jié)晶及活力測(cè)定

1、膁實(shí)驗(yàn)一 胰蛋白酶的結(jié)晶及活力測(cè)定莈原理袇胰蛋白酶(trypsin , EC.3.4.21.4)通常是以無(wú)活性的胰蛋白酶原(trypsinogen)形式存在于動(dòng)物的胰臟中。 在生理?xiàng)l件下， 胰蛋白酶原隨胰液分泌到十二指腸后， 在小腸上腔有鈣 離子的環(huán)境中被腸激酶(enterokinase)或胰蛋白酶所激活，其肽鏈 N端的賴氨酸與異亮氨 酸之間的一個(gè)肽鍵被水解而失去一個(gè)酸性 6 肽，分子構(gòu)象發(fā)生改變， 轉(zhuǎn)變成有生物活性的胰 蛋白酶。螄胰蛋白酶原的 Mr約為24000,其等電點(diǎn)為pH8.9。胰蛋白酶的的 M為23400，等電點(diǎn)為pH10.8。胰蛋白酶在酸性條件下穩(wěn)定。通常在 pH3.0的溶液內(nèi)，在

2、 4的冰箱內(nèi)儲(chǔ)存數(shù)約 乃至2年其活性無(wú)顯著變化。當(dāng)溶液的pH值小于2.5時(shí)，胰蛋白酶易變性；pH大于5.0時(shí),容易發(fā)生自溶；在 pH7.68.0 時(shí)，其催化水解的活性最佳。蕿 重金屬離子，有機(jī)磷化合物和某些反應(yīng)產(chǎn)物均可抑制胰蛋白酶的活性。在胰臟、卵清 和大豆中含有一些對(duì)胰蛋白酶活性具有抑制作用的天然抑制劑。膇 胰蛋白酶催化水解蛋白質(zhì)的能力，表現(xiàn)在它對(duì)堿性氨基酸(如精氨酸、賴氨酸)的羧 基與其他氨基酸所形成的肽鍵具有高度的專一性。 此外， 還能催化水解有堿性氨基酸所形成 的酰胺鍵和酯鍵，胰蛋白酶對(duì)這些化學(xué)鍵催化水解活性的敏感性依次是酯鍵酰胺鍵肽 鍵。因此， 可以利用含有這些化學(xué)鍵的人工合成的化合

3、物為底物來(lái)研究胰蛋白酶的專一性催 化活性。羇 在動(dòng)物的胰臟中除了存在胰蛋白酶外，還有另外兩種與胰蛋白酶的性質(zhì)相似的蛋白水解酶，即：胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin )亦稱糜蛋白酶，彈性蛋白酶(elastase在制備過(guò)程，采用常規(guī)的方法往往很難將三者彼此分離開。 而采用具有高度專一性的親合層析法可將 它們分開。膅 從胰臟中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸將胰腺細(xì)胞中含有的胰蛋白酶原提取出來(lái)，然后根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理將提取液的pH調(diào)至酸性(pH3.0左右)，使大量的酸性蛋白沉淀析出。 經(jīng)硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原， 胰凝乳蛋白酶原和彈性蛋白酶原沉淀， 抽濾后的沉淀 物經(jīng)水溶解并調(diào)至 pH8.0 ,

4、用極少量的胰蛋白酶將胰蛋白酶原激活，同時(shí)溶液中的胰凝乳蛋 白酶原、彈性蛋白酶原也被激活。三種酶原激活相互作用過(guò)程如下：芁流程圖膀 激活后的酶溶液，用硫酸銨分級(jí)鹽析法初步將胰蛋白酶與胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶 分開， 收集胰蛋白酶部分， 通過(guò)結(jié)晶進(jìn)一步純化， 使胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶通過(guò)離子交 換層析可進(jìn)一步分離。羇 胰蛋白酶能水解酯鍵、酰胺鍵和肽鍵，根據(jù)這一性質(zhì)，用人工合成的底物或天然的蛋 白質(zhì)（如酪蛋白）測(cè)定胰蛋白酶的活性。目前，用于檢測(cè)胰蛋白酶活性人工合成的底物主要 是酰胺和酯兩類。常用苯甲酰 -L- 精氨酰 - 對(duì)硝基苯胺（ enzoyl-arginine p-nitro-anilide

5、, 簡(jiǎn)稱BAPA ）和苯甲酰-L-精氨酰-B -精氨酸乙酯（enzoyl-arginine naphthylamide 簡(jiǎn)稱BANA）為底 物測(cè)定酰胺酶的活力；用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（enzoyl-arginine ethyl ester,簡(jiǎn)稱BAEE ）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（tosyl-L-arginine methyl ester，簡(jiǎn)稱TAME ）為底物測(cè)定酯酶的活力。以 BAEE 為例，酶水解的反應(yīng)如下：節(jié) 反應(yīng)方程式肅 以人工合成的底物測(cè)定胰蛋白酶活力時(shí)，通常采用紫外吸收法，酶活力單位的規(guī)定因 底物及測(cè)定方法而異。罿操作方法肆一 結(jié)晶胰蛋白酶的制備（一）（二）蚃胰蛋白酶原的提

6、取1.2. 蒁稱取1kg （凈重）新鮮的或速凍的動(dòng)物胰臟，剝?nèi)ブ炯敖犹娼M織。剪成小塊， 搗碎。3.3. 螈加入22.5倍體積預(yù)冷的pH2.53.0乙酸酸化水，在510 C下提取6小時(shí)以上， 并不時(shí)的的輕輕攪拌。5.4. 膆用 4 層紗布擠濾，擰擠出濾液；組織殘?jiān)偌尤爰s1/2 體積（ 500ml 左右）的乙酸酸化水，提取 12 小時(shí)。再次用紗布過(guò)濾。合并兩次濾液， 用 2.5mol/L 的硫酸 調(diào)至pH2.53.0，靜置約4小時(shí)，使提取液中的酸性蛋白承佃析出。7.5. 肄用折疊濾紙過(guò)濾，收集全部的濾液，加入粉狀固體的硫酸銨至0.75 飽和度（按每1000ml濾液加492g, 5C）。放置過(guò)夜

7、，使胰蛋白酶原完全析出。9.6. 膃用布氏漏斗抽濾，壓緊成濾餅。即可獲得胰蛋白酶原粗品。（三）（四）薇胰蛋白酶原的激活1.2. 芆將硫酸銨沉淀的胰蛋白酶原稱重（濕重），加入約 10 倍體積的預(yù)冷蒸餾水（按濾餅重量計(jì)算） ，使濾餅完全溶解，一般情況濾餅中硫酸銨含量約站 1/4。3.3. 蒅用5mol/L氫氧化鈉將溶液調(diào)至 pH8.0，慢慢加入固體無(wú)水氯化鈣使鈣離子的終 濃度達(dá)到 0.1mol/L （要減去一部分氯化鈣和硫酸銨結(jié)合生成硫酸鈣沉淀的鈣離子）。隨加隨攪拌均勻。5.6. 蟻取出 0.1ml 溶液，稀釋 200 倍測(cè)定激活前的蛋白含量及酶活性（一般情況下是 無(wú)活性或活性極低） 。7.8.

8、薀加入25mg該種動(dòng)物的胰蛋白酶為激活啟動(dòng)酶，輕輕攪勻，于4C激活1216小時(shí)或25C激活34小時(shí)。在激活期間每隔一段時(shí)間測(cè)定一次酶活性，觀察酶原激活增長(zhǎng)情況， 直到酶激活速度有快變慢或停止增長(zhǎng)， 表明酶原已經(jīng)全部被激活。一般比活可達(dá)到 35004500 BAEE單位/mg酶蛋白。9.10.莆酶原激活后，用 2.5mol/L的硫酸調(diào)至pH2.53.0，用濾紙過(guò)濾除區(qū)硫酸鈣沉 淀。置冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。（五）（六）螞胰蛋白酶的分?jí)分離1.2. 莃將以激活的胰蛋白酶溶液，慢慢加入固體硫酸銨至 0.4飽和度（每 1000ml 溶液加入 240g 硫酸銨）。使胰凝乳蛋白酶沉淀出來(lái)。3.3. 荿用布氏漏斗抽

9、濾，收集濾液，（濾餅留做制備胰凝乳蛋白酶） ，再加入固體硫酸銨至0.75飽和度（每1000ml溶液加入250g硫酸銨），使胰蛋白酶析出。5.4. 蒆在4C放置約4小時(shí)，待胰蛋白酶完全沉淀析出后，用布氏漏斗抽濾，收集濾 餅，即可獲得胰蛋白酶的粗制品。肂二 胰蛋白酶的活力測(cè)定螀1. N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE ）為底物測(cè)定法肇N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯在波長(zhǎng) 253nm下的紫外吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于 N-苯甲酰-L-精氨酸（benzoyl-L-arginine,簡(jiǎn)稱BA）的紫外光吸收。在胰蛋白酶催化水解下，BAEE隨著酯鍵的被水解，水解產(chǎn)物 BA逐漸增多，反應(yīng)體系的紫外光吸收亦隨之相應(yīng)增加，以A2

10、53計(jì)算胰蛋白酶的比活力。薆取兩個(gè)石英比色杯（帶蓋，光程為1cm）,分別加入 25 C預(yù)熱過(guò)的2.8ml1.0mmol/L的 BAEE 底物溶液。向一個(gè)比色池內(nèi)加入 0.2ml 10mmol/L 的鹽酸，在波長(zhǎng) 253nm 下調(diào)整儀 器零點(diǎn)；向另一個(gè)比色池內(nèi)假如 0.2ml胰蛋白酶溶液（酶的用量一般為 510卩g純胰蛋白 酶，若是粗制品應(yīng)增加用量） ，立即蓋上蓋迅速顛倒幾次混勻并計(jì)時(shí)，于 253nm 處測(cè)定其光 吸收增加值（A253nm）,每隔30秒讀數(shù)一次，反應(yīng)持續(xù) 57分鐘。測(cè)得結(jié)果要使厶253nm/min 控制在 0.050.1 之間為宜。若偏離此范圍則要適當(dāng)增減酶量。蒃 以時(shí)間（t ）

11、為橫坐標(biāo)，光吸收值（A253nm）為縱坐標(biāo)做直線，在直線部分任選一個(gè)時(shí) 間間隔（t）與相應(yīng)的光吸收值變化（厶 A253nm）。按下列公式計(jì)算胰蛋白酶的活力單位和比 活力。酶的活力單位（BAEE 單位）=（ A253nm/min ） /0.001膀酶的比活力單位（BAEE 單位 /mg 酶）=（ A253nm/min ）x 1000/ （& X 0.001）薆 式中的 A253nm/mi n為每一分鐘遞增光吸收值； 為測(cè)定時(shí)所用的胰蛋白酶量（卩g ）； 1000為酶蛋白的卩g轉(zhuǎn)換成mg的轉(zhuǎn)換值；0.001為光吸收值每增加 0.001定義為1個(gè)BAEE 活力單位的常數(shù)。襖 2. 對(duì)甲苯磺酰 -L-

12、 精氨酸甲酯（ TAME ）為底物測(cè)定法羀 取2個(gè)石英比色杯（帶蓋，光程為1cm）,分別加入經(jīng)25C預(yù)熱過(guò)的2.8ml1.0mol/L TAMA 底物溶液。向一個(gè)比色杯中加入 0.2ml 10mmol/L 的鹽酸溶液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng) 247nm 下調(diào)整儀器的零點(diǎn)，然后向另一個(gè)比色池加入0.2ml胰蛋白酶溶液（酶用量510卩g）,蓋上蓋，迅速顛倒幾次混勻并計(jì)時(shí)，于波長(zhǎng) 247nm 處測(cè)定其光吸收。每隔 30 秒讀數(shù)一次，反 應(yīng)持續(xù)57分鐘。 247nm/min控制在0.050.1為宜。若偏離此范圍要適當(dāng)增減酶量。衿 以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，光吸收值（A247nm）為縱坐標(biāo)做直線，在直線部分任選

13、一個(gè)時(shí)間 間隔（t）與相應(yīng)的光吸收值變化（厶 A247nm）。按下列公式計(jì)算胰蛋白酶的活力單位和比活 力。蚆 酶的活力單位（TAME單位）=（ A247nm/min ） /0.001芅酶的比活力單位（TAME 單位 /mg 酶）=（ A247nm/min ） X 1000/ （ X 0.001）螞式中的 A253nm/min為每一分鐘遞增光吸收值；為測(cè)定時(shí)所用的胰蛋白酶量（ 卩g） ;1000為酶蛋白的卩g轉(zhuǎn)換成mg的轉(zhuǎn)換值；0.001為光吸收值每增加 0.001定義為1個(gè) TAME 活力單位的常數(shù)。蚈3.甲酰-L-精氨酰-3 -萘酰胺（BANA ）為底物測(cè)定法螅 取 3只試管， 其中兩支為平

14、行測(cè)定酶活力實(shí)驗(yàn)， 均加入 0.1ml0.25%BANA 乙醇溶液， 0.4ml0.2mol/L , pH8.0磷酸鹽緩沖液，在加入1ml已稀釋好的酶溶液，混勻后于37C保溫15 分鐘，然后立即加入 0.5ml 2mol/L 的鹽酸溶液，以停止酶促反應(yīng)，搖勻。另一支試管加 入試劑與前 2 支相同， 只是先加入 0.5ml 2mol/L 的鹽酸溶液， 后加酶液。 加酶后亦同樣保溫 15 分鐘，作為空白對(duì)照。然后在 3支試管中都加入 1ml 0.1%的亞硝酸鈉溶液，充分振蕩3分鐘后，加入1.5ml 0.5%氨基磺酸銨溶液，再振蕩2分鐘，最后加入 2ml 0.05%的N-萘基-乙二胺二鹽酸乙醇溶液，

15、搖勻。溶液逐漸呈蘭色，在25C保溫30分鐘后，產(chǎn)物的顏色即達(dá)穩(wěn)定。于560nm處測(cè)其光吸收。以不同樣品量為橫坐標(biāo)，所得相應(yīng)的560nm為縱坐標(biāo)做圖，選擇曲線的直線部分，按以下計(jì)算公式計(jì)算胰蛋白酶的活力單位和比活。莂酶的活力單位（BANA 單位）=（ A 5603nm） / （ 0.01 X t）膀酶的比活力單位（BANA 單位 /mg 酶）=（ A560nm）X 1000/ （ X tX 0.01）蕆式中的 A 560nm為樣品管光吸收值一空白管光吸收值；為每個(gè)樣品管所用的胰蛋白酶量（卩g）; 1000為酶蛋白的卩g轉(zhuǎn)換成mg的轉(zhuǎn)換值；0.01為光吸收值每增加 0.01定義為 1 個(gè) BANA

16、 活力單位的常數(shù)； t 為保溫時(shí)間（ min）。裊 在上述條件下，每分鐘光吸收值增加 0.01 時(shí)，所需酶量定為一個(gè) BANA 單位。螃 4.酪蛋白為底物測(cè)定法袂 以酪蛋白為底物，主要用于測(cè)定胰蛋白酶粗制品的活力。按修改后的Kunitz 法進(jìn)行測(cè)定，方法如下：蒀樣品管：將酶液用0.1mol/L ，pH8.0 的硼酸緩沖液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋ù忠鹊鞍酌阜奂s880卩g/ml，結(jié)晶胰蛋白酶粉約 220卩g/ml）,取不同量的酶液（0.11.0ml），并用O.1mol/L , pH8.0的硼酸緩沖液補(bǔ)足體積到1.0ml。然后在每個(gè)樣品管中在加入1ml預(yù)先在37C保溫好的1%酪蛋白溶液，混勻，在37C保溫

17、10分鐘，立即個(gè)加入 3.0ml 5%的三氯乙酸，迅速搖勻，于室溫放置半小時(shí)。羅空白管：在每支試管中個(gè)加入1.0ml1%酪蛋白溶液和 3.0ml5%三氯乙酸，搖勻后，再加入1.0ml酶液（酶濃度分別與樣品管相同），在37C保溫10分鐘，以下操作同樣品管。膄將樣品管、空白管分別離心，取上清液于280nm 策其光吸收值。以不同樣品量作為橫坐標(biāo)，所得相應(yīng)的 280nm為縱坐標(biāo)作圖，選擇曲線的直線部分按下列公式計(jì)算胰蛋白酶的活 力單位和比活力。莀酶的活力單位= 280nm/t艿酶比活力（活力單位 /mg酶）=（ 280nmX 1000） / （ X t）肅式中： 280nm為樣品管光吸收值（A?）空白

18、管光吸收值（AJ； 為每個(gè)樣品管中胰蛋 白酶的用量卩g; t為保溫時(shí)間（min）； 1000為樣品由卩g換算成mg時(shí)的轉(zhuǎn)換值。薅三 胰凝乳蛋白酶的活力測(cè)定肁 以N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-acetyl-tyrosine ethyl ester簡(jiǎn)稱ATEE）為底物，用紫外吸收法測(cè)定。方法如下：羈取2個(gè)石英比色杯（帶蓋，光程為 1cm）,其中一個(gè)加蒸餾水，用于調(diào)零。另一個(gè)比色杯加入2.8ml ATEE 0.05mol/L , pH7.0的磷酸緩沖液，0.20ml酶液（用量一般為 10卩g蛋白的 結(jié)晶酶），立即混勻并計(jì)時(shí)，于 237nm 處測(cè)其光吸收值（降低） ，每隔半分鐘讀一次數(shù)，共 35分鐘。

19、若 237nm/min 0.400,則酶液需要適當(dāng)稀釋或減量。肅 根據(jù)時(shí)間光吸收關(guān)系曲線中的直線部分， 任選一時(shí)間間隔與相應(yīng)的光吸收值變化 （ 237nm）,按以下計(jì)算公式計(jì)算胰凝乳蛋白酶的活力單位和比活力。酶的活力單位（ATEE單位）= 237nm/t X 0.001葿 比活力=酶活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì) =（ 237nmX 1000 ） / （& X t X 0.001 ）肀式中： 237nm為任選一個(gè)時(shí)間間隔（min ）光吸收值的變化（降低）；為測(cè)定時(shí)所用的酶 量（卩g）; 1000為酶蛋白由卩g轉(zhuǎn)換成mg時(shí)的轉(zhuǎn)換值；0.001為每分鐘光密度值降低0.001定為1個(gè)ATEE活力單位的常數(shù)。

20、膅五 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的蛋白含量測(cè)定膂根據(jù)蛋白質(zhì)溶液在波長(zhǎng) 280nm處具紫外光吸收的特性，將測(cè)得的光吸收值A(chǔ)280nm除以該蛋白質(zhì)的消光系數(shù)或乘以該蛋白質(zhì)的比消光系數(shù)，即可計(jì)算出該蛋白質(zhì)溶液的濃度。 胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶及彈性蛋白酶的消光系數(shù)和比消光系數(shù)分別列在下表中。芁胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶及彈性蛋白酶的消光系數(shù)和比消光系數(shù)蝿蛋白質(zhì)名稱芅消光系數(shù)薃比消光系數(shù)羃豬胰蛋白酶薈 1.35蒞 0.740羄牛胰蛋白酶莁 1.71莇 0.585蒄牛胰凝乳蛋白酶蒞 2.00肅 0.500莀計(jì)算出的蛋白質(zhì)的濃度為mg/ml薄蛋白酶（mg/ml） = （A 280nm X N ） /消光系數(shù)或 A

21、280nm X比消光系數(shù)X N 蒂式中：N為測(cè)定時(shí)酶溶液的稀釋倍數(shù)。薁結(jié)果處理1.2腿乘量所得到的胰蛋白酶結(jié)晶的重量3.4. 蚄計(jì)算結(jié)晶酶的比活力。以單位數(shù)/mg蛋白來(lái)表示5.5. 袃將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列表如下：芃步驟羈總體積芄總蛋白質(zhì)羈比活力蚅總活力蝿回收率羈(ml)螀（mg）肇（單位數(shù)/mg蛋白質(zhì)）蒂總單位數(shù)膈（%）肅激活后袀蒈羋節(jié)螞芇第一次結(jié)晶莈蚃肀芀莇肄第二次結(jié)晶螂聿蕆蒅芀袈試劑和器材薇試劑薂 1.pH2.5 乙酸酸化水2.10%乙酸羂 3.2.5mol/L 硫酸4.硫酸銨薇 5. 氯化鈣（ AR ）6.5mol/L 氫氧化鈉溶液蚇 7. 2mol/L 氫氧化鈉溶液羃 8. 0.8mol/L

22、， pH9.0 硼酸溶液：取 20ml0.8mol/L 硼酸溶液，加 30ml0.05mol/L 四硼酸鈉 溶液，混合后，檢查溶液的 pH 值。9. 0.8mol/L ， pH9.0 硼酸溶液10.0.2mol/L ， ph8.0 硼酸緩沖液：取 70ml0.2mol/L 硼酸溶液，加 30ml0.05mol/L 四硼酸 鈉溶液，混合后，檢查溶液的 pH 值。11.2mol/L 鹽酸12.ATEE0.05mol/L ，pH7.0 磷酸鹽緩沖液（每 ml 磷酸鹽緩沖液中含 0.25mg ATEE） 13.0.1mol/L pH8.0 硼酸緩沖液14.5%三氯乙酸溶液15.1%酪蛋白溶液16.0.25%BANA 乙醇溶液：貯于冰箱可使用 2 周17.0.1%亞硝酸鈉溶液18.0.5%氨基磺酸銨溶液19.0.05%N-1-萘基-乙二胺鹽酸乙醇溶液：貯于冰箱可使用4周20.0.2mol/L ，pH8.0 磷酸鹽緩沖液：取 5.3ml 0.2mol/L 磷酸二氫鈉溶液，加入 94.7ml0. 2mol/LL 磷酸氫二鈉溶液，混勻后，檢查溶液的 pH 值21.TAME 0.05mol/L pH8.0 Tris-HCI 緩沖液：取 29mg TAME , 222mg 氯化鈣，溶于 100ml 0. 05m