實(shí)驗(yàn)四血涂片的制備與染色精編版

1、醫(yī)藥資料推薦6實(shí)驗(yàn)四 血涂片的制備與染色目的】 掌握血涂片的制備和染色方法（ preparation and staining of thin blood films）。原理】 將一小滴血液均勻涂在玻片上，呈單層緊密分布，制成薄血片。用含天青B 和伊紅的Romannowsk y類染料進(jìn)行染色。細(xì)胞中的堿性物質(zhì)如RBC中的血紅蛋白及嗜酸性粒細(xì)胞胞質(zhì)中的嗜酸性顆粒等與酸性染料伊紅結(jié)合染成紅色；細(xì)胞中的酸性物質(zhì)如淋巴細(xì)胞胞質(zhì)及嗜堿性粒細(xì)胞質(zhì)中的嗜堿性顆粒等與堿性染料亞甲藍(lán)結(jié)合染成藍(lán)色；中性粒細(xì)胞的中性顆粒呈等電狀態(tài)與伊紅和美藍(lán)均可結(jié)合，染成淡紫紅色。器材】1載玻片 使用前，必須仔細(xì)清洗，并用乙醇或軟

2、布清潔。2推片 選擇邊緣光滑的載玻片，在兩角分別作斜線標(biāo)記， 然后用玻璃切割刀裁去兩角， 制成約 15mm寬度的推片。3吸耳球。4顯微鏡。5酒精燈或 Bunsen 燈。6.采血針。7注射器和針頭。試劑】1瑞氏（ Wright ）染液（1 ）1液：包含瑞氏染料 1.0g、純甲醇（AR級(jí)以上）600ml、甘油15ml。將全部染料放入清潔干燥的乳缽中，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少30min），以使染料充分溶解，再加一些甲醇混勻，然后將溶解的部分倒入潔凈的棕色瓶內(nèi)，乳缽內(nèi)剩余的未溶解的染料，再加入少許甲醇細(xì)研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完為止。再加 15ml 甘油密閉保存。（2） n液：磷

3、酸鹽緩沖液（pH6.46.8 ）,包含磷酸二氫鉀（KHPQ） 0.3g、磷酸氫二鈉（NaHPO 0.2g、蒸餾水加至1000ml。配好后用磷酸鹽溶液校正pH,塞緊瓶口貯存。如無緩沖液可用新鮮蒸餾水代替。2.吉姆薩染液包含吉姆薩染料 0.75g、甘油35ml、甲醇65ml。將吉姆薩染料、甘油和甲醇放入含玻璃珠的容器內(nèi)，每天混勻 3次，連續(xù) 4天，最后過濾備用。3瑞 - 吉復(fù)合染液（1） I液：包含瑞氏染料1g、吉姆薩染料0.3g、甲醇500ml、中性甘油10ml。將瑞氏染料和吉姆薩染料置潔凈研缽中，加少量甲醇，研磨片刻，再吸出上液。如此連續(xù)幾次，共用甲醇500ml 。收集于棕色玻璃瓶中，每天早、

4、晚各搖 3min，共5d，以后存放1周即能使用。（2）n液：即磷酸鹽緩沖液（PH6.46.8 ）。包含無水磷酸二氫鉀 6.64g、無水磷酸氫二鈉 2.56g，加少量蒸餾水溶解，用磷酸鹽調(diào)整pH,加水至1000ml O標(biāo)本】 EDTA 抗凝靜脈血或末梢血。操作】1 采血（1 ）靜脈采血法：用EDTA- K2抗凝12h內(nèi)的標(biāo)本，使用玻棒、毛細(xì)管、注射針頭等在距載玻片一端1cm處加1滴抗凝血，直徑約 4mm2）皮膚采血法：選擇第三、四手指，并先采紅細(xì)胞、白細(xì)胞計(jì)數(shù)，再采血1 滴置潔凈玻片上用于血涂片制備。2制作涂片 左手平執(zhí)載玻片，或放在類似桌子等平坦地方，右手持推片從后方移動(dòng)接近血滴，使血液沿推片

5、邊緣展開，將推片與載玻片呈3045角，用均勻速度向前將血液推成厚薄適宜的血涂片（圖 1-12 ），血涂片應(yīng)呈舌狀，頭、體、尾三部分，且清晰可見。所有血液必須在推片到達(dá)末端前用完。貧血病人推片速度要快。圖 1-12血涂片制備示意圖3干燥涂片1）空氣干燥：將推好的血涂片在空氣中晃動(dòng)，使其迅速干燥。2）加熱干燥：握住涂片，在距離酒精燈或Bunsen燈火焰上方50mn處晃動(dòng)，但不能直接對(duì)著火焰。4標(biāo)記涂片 在載玻片的一端用記號(hào)筆編號(hào)，注明患者姓名或門診 / 住院號(hào)。5染色1）瑞氏染色法：待血涂片干透后，用蠟筆在兩端畫線，以防染色時(shí)染液外溢。然后將玻片平置于染色架上，滴加染液（I液）35滴，使其迅速蓋滿

6、血涂片，約 0.51min后，滴加等量或稍多的緩沖液 （n液），輕輕搖動(dòng)玻片或用吸球?qū)?zhǔn)血涂片吹氣，使染液充分混合。5lOmin后用流水沖去染液，待干。（2）吉姆薩染色法：將固定的血涂片置于被 pH6.46.8磷酸鹽緩沖液稀釋1020倍的吉姆薩染液中,浸染1030min （標(biāo)本較少可用滴染）。取出用流水沖洗，待干燥后顯微鏡檢查。（3）瑞一吉復(fù)合染色法：操作步驟同瑞氏染色法，只是染色時(shí)將瑞一吉復(fù)合染液I液和n液替代瑞氏染液的I液和n液。6觀察結(jié)果 將干燥后的血涂片置顯微鏡下觀察。用低倍鏡觀察血涂片體、尾交界處的血細(xì)胞。在顯微鏡下，成熟紅細(xì)胞染成粉紅色；血小板染成紫色；中性粒細(xì)胞胞質(zhì)染成粉紅色，含

7、紫紅色顆粒；嗜酸性粒細(xì)胞含大的桔黃色顆粒；嗜堿性粒細(xì)胞胞質(zhì)含有大量深紫藍(lán)色顆粒；單核細(xì)胞胞質(zhì)染成灰藍(lán)色；淋巴細(xì)胞胞質(zhì)染成淡藍(lán)色。注意事項(xiàng)】1瑞氏染液 新鮮配制的染液偏堿，染色效果較差，經(jīng)在室溫下貯存一定時(shí)間，美藍(lán)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樘烨郆 后方可使用，這一過程稱染料成熟。放置時(shí)間愈久，天青B 愈多，染色效果愈好，但必須蓋嚴(yán)瓶口，以免甲醇揮發(fā)或氧化成甲酸。甲醇必須用AR（無丙酮）。染液中也可加中性甘油 3ml，防止甲醇揮發(fā)，使細(xì)胞染色較清晰。2采血（1）不能采集以下部位的血液：示指或拇指血液。感染部位血液，如甲溝炎。耳垂部位血液,含單核細(xì)胞太多。2）不能使用肝素抗凝標(biāo)本。（3）玻片必須清潔、干燥、無塵。新

8、玻片：應(yīng)在清潔液中浸泡過夜，然后用水沖洗，最后用蒸餾水沖洗。已用過的玻片：應(yīng)在60C清潔液中加熱20min，然后用水沖洗，最后用蒸餾水沖洗。邊緣破碎、表面有劃痕的玻片不能再用。4）使用玻片時(shí)，只能手持玻片邊緣，切勿觸及玻片表面，以保持玻片清潔、干燥、中性、無油膩。3制作涂片 許多因素可影響血涂片的厚度，針對(duì)不同患者應(yīng)有的放矢，對(duì)血細(xì)胞比容高、血粘度高的患者應(yīng)采用小血滴、小角度、慢推；而貧血患者則應(yīng)采用大血滴、大角度、快推。涂片質(zhì)量不佳及可能原因見表 1-1 ，圖 1-13 。表 1-1 涂片質(zhì)量不佳及可能原因涂片質(zhì)量不佳可能原因不規(guī)則間斷和尾部太長推片污染、推片速度不連續(xù)、載玻片太臟有空洞載玻

9、片污染脂肪、油脂白細(xì)胞和血小板尾部分布不規(guī)則制片技術(shù)差涂片太長或太短推片角度不佳涂片沒有尾部血滴太大涂片很短血滴太小涂片沒有邊緣空隙推片太寬有細(xì)胞退變現(xiàn)象固定延遲、固定時(shí)間太短、甲醇污染血涂片厚血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快白細(xì)胞破損推片時(shí)用力過猛圖1-13血涂片質(zhì)量比較(A為涂片質(zhì)量好,B、C D E、F、G H I為涂片質(zhì)量差)4.干燥涂片 血涂片干透后方可固定染色，否則細(xì)胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色過程中容易脫落。5.染色步驟(1 )操作注意事項(xiàng)及操作不當(dāng)?shù)暮蠊姳?-3。表1-2染色操作注意事項(xiàng)及操作不當(dāng)?shù)暮蠊僮髯⒁馐马?xiàng)操作不當(dāng)?shù)暮蠊尤疽簯?yīng)適量過少則易蒸發(fā)沉淀，一旦染

10、料沉積在血涂片上， 則不易沖洗，使細(xì)胞深染不易檢查。沖洗時(shí)不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖洗染料沉著在血涂片上沖洗時(shí)間不能過久脫色沖洗完的血涂片應(yīng)立放于支架上剩余水分浸泡脫色(2)染色時(shí)間與染液濃度、室溫及細(xì)胞多少有關(guān)。染液淡、室溫低、細(xì)胞多則染色時(shí)間要長；反之,可減少染色時(shí)間。必要時(shí)可增加染液量或延長時(shí)間。沖洗前，應(yīng)先在低倍鏡下觀察有核細(xì)胞是否染色清楚,核質(zhì)是否分明。應(yīng)該在具體實(shí)踐中摸索合適的時(shí)間，特別是在更換染液時(shí)。每批染色液和緩沖液，均需試染，以便掌握染色時(shí)間和加緩沖液的比例。6.結(jié)果觀察低倍鏡下觀察血涂片應(yīng)厚薄適宜，細(xì)胞不重疊，頭尾及兩側(cè)有一定的空隙，一些體積大1-3。的特殊細(xì)胞常在血涂片的尾部出現(xiàn)。如有可能，干燥后的血涂片先用中性樹膠封片后再觀察，不僅能長期保存血涂片，而且觀察效果更佳。染色質(zhì)量不佳及原因見表表1-3 染色質(zhì)量不佳及可能原因染色效果可能原因糾正措施太藍(lán)太紅涂片太厚、沖洗時(shí)間太短、中性水 pH太高、染色 時(shí)間太長、稀釋染液重復(fù)使用、貯存染液暴露于陽 光沖洗時(shí)間太長、中性水 pH太低、貯存染液質(zhì)量不在含1%硼酸的95%乙醇溶液沖洗2 次, 用中性水沖洗，待干鏡檢規(guī)范