湖北麥冬多糖質(zhì)量控制與抗糖尿病活性研究

1、湖北麥冬多糖質(zhì)量控制與抗糖尿病活性研究湖北麥冬 , 又名山麥冬 , 來源于百合科植物湖北麥冬 Liriope spicata var. prolifera 的干燥塊根 , 收載于現(xiàn)行版 中華人民共和國藥典 （2010 年版 ）, 是中 國衛(wèi)生部公布的即可作藥物也可作保健食品的品種 , 主產(chǎn)于湖北省襄樊市。它最 早以“隨州麥門冬”之名記載于宋代證類本草之中 , 是一種常用的抗糖尿病 中藥。多糖的質(zhì)量控制是多糖研究的重點和難點 , 現(xiàn)階段沒有很好的方法對多糖進(jìn) 行非常準(zhǔn)確的質(zhì)量控制。 僅僅采用總糖含量控制多糖質(zhì)量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)下 科技發(fā)展的需求。質(zhì)量控制研究也是湖北麥冬多糖作為一種新藥開發(fā)過程

2、中的核心問題 , 與能 否保證其藥材質(zhì)量、 生產(chǎn)環(huán)節(jié)穩(wěn)定、 制劑過程穩(wěn)定以及最后產(chǎn)品質(zhì)量等多個方面 都有密切關(guān)系。同時 , 有效的質(zhì)量控制是保證其藥效的前提。研究表明,湖北麥冬多糖（TLSP）是由兩種均一多糖組成的,兩種均一多糖的 結(jié)構(gòu)類似,主鏈都是由果糖殘基通過1-2鏈接而成，支鏈通過0-6鏈接一個果糖殘 基,鏈末端都是由葡萄糖殘基和果糖殘基構(gòu)成,分子量分別接近3KDa和5KDa基 于以上信息 , 本文嘗試多種技術(shù)手段 , 對湖北麥冬多糖進(jìn)行質(zhì)量控制。實驗室前期工作已證實 , 湖北麥冬水溶液中的多糖成分具有降低小劑量鏈脲 佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血糖值和改善胰島素抵抗的作用。TLSP和兩種均一

3、多糖在KKAy自發(fā)性糖尿病小鼠模型中都有很好的降血糖效果，而且三者之間沒有 顯著性差異。但前期試驗都是采用小鼠作動物模型 , 由于血液和組織樣本量有限 , 對湖北 麥冬多糖的療效和作用機(jī)制研究都不夠完善。 如2010年開始,美國糖尿病協(xié)會把 糖化血紅蛋白推薦為診斷糖尿病的首要指標(biāo) , 前期試驗中對該指標(biāo)未進(jìn)行測定； 且對糖尿病并發(fā)癥未進(jìn)行研究；僅對胰島素信號上游信號進(jìn)行測定 , 信號通路研 究不完全。鑒于以上原因，本研究選用高脂高糖飼料加小劑量 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠這 一更加穩(wěn)定的模型 , 對湖北麥冬多糖抗糖尿病活性進(jìn)行全面研究 , 以及深入探究 其作用機(jī)理。本論文主要由四個部分組成。第一部

4、分：通過下述 5個方面對湖北麥冬多糖原料藥進(jìn)行質(zhì)量控制 ,以保證 其質(zhì)量穩(wěn)定。(1)單糖組成TLC分析,湖北麥冬多糖原料藥進(jìn)行TCL分析時,顯現(xiàn) 與果糖標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品相同位置和相同顏色的斑點 , 其他標(biāo)準(zhǔn)單糖位置無 斑點。分子量測定,采用高效凝膠滲透色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPGPC-ELSD法 對分子量進(jìn)行測定,規(guī)定湖北麥冬多糖原料藥的重均分子量在 3000-5000Da之間 (3) 總糖含量測定 ,選用果糖作標(biāo)準(zhǔn)品 ,采用蒽酮-硫酸法對湖北麥冬多糖原料中 總糖含量進(jìn)行測定 , 規(guī)定湖北麥冬多糖原料藥中總糖含量必須大于或等于95%。(4)單糖含量高效液相色譜(HPLC)分析,考察了兩種

5、HPLC方法對湖北麥冬多 糖中的單糖組成和含量分析 , 最后選用反相 -高效液相色譜 / 紫外檢測器 (RP-HPLC/UVD法測定湖北麥冬多糖中的果糖和葡萄糖含量,規(guī)定湖北麥冬多糖 中果糖含量必須在 98%-104%之間 , 葡萄糖含量必須在 4%-6%之間。 (5) 雜質(zhì)檢測 , 湖北麥冬多糖原料藥HPGP圖譜須為單一色譜峰，在11-14min(無機(jī)鹽峰)和 18-21min(單糖峰)處無明顯色譜峰出現(xiàn)；湖北麥冬多糖水溶液(5mg/mL)紫外掃描 后在260-280nm處不得有明顯的蛋白質(zhì)吸收峰。第二部分：高脂高糖飼料+小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型被 用作湖北麥冬多糖抗糖

6、尿病活性評價 , 研究結(jié)果表明湖北麥冬多糖可顯著降低糖 尿病大鼠的空腹血糖值和糖化血紅蛋白值 , 且能顯著改善糖耐量 , 進(jìn)一步確認(rèn)了 湖北麥冬多糖的降血糖療效。 對血脂的研究結(jié)果表明湖北麥冬多糖具有降低糖尿 病大鼠血脂的功能。本研究還發(fā)現(xiàn) ,湖北麥冬多糖能改善糖尿大鼠腎臟的各項功能參數(shù) , 同能也 能預(yù)防糖尿病大鼠脂肪肝的發(fā)生與發(fā)展 , 表明湖北麥冬多糖對糖尿病的并發(fā)癥有 預(yù)防作用。第三部分：免疫組織化學(xué)、免疫蛋白印跡電泳法、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等技術(shù)被用于湖北麥冬多糖抗糖尿 病活性作用機(jī)理研究。作用機(jī)理主要如下： (1) 對胰島素信號傳導(dǎo)

7、的影響。湖北麥冬多糖能顯著提 高糖尿病大鼠肝臟中胰島素受體 (InsR) 、胰島素受體底物 -1(IRS-1) 、磷脂酰肌 醇3激酶(P13K)、蛋白激酶B (Akt)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GIut4)的表達(dá)水平，降 低糖原合成酶激酶-3 B (GSK-3B )的表達(dá)水平,改善胰島素信號傳導(dǎo)。(2) 對肝臟葡萄糖代謝的影響。湖北麥冬多糖能使糖尿病大鼠的肌糖原和肝 糖原含量增加,同時使肝臟葡萄糖激酶(GK)和糖原合成酶(GS)活性及mRNA!達(dá) 增加,葡萄糖-6-磷酸激酶(G-6-Pase)和糖原磷酸化酶(GP)活性及mRN表達(dá)降低, 改善肝糖代謝紊亂。(3) 對氧化應(yīng)激環(huán)境的影響。湖北麥冬多糖能顯著增加糖尿病大鼠的血清SOD CAT GSH-px活性，降低血清MDA濃度,改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平。這些都有可能是湖北麥冬多糖抗糖尿病的作用機(jī)理。 (4) 預(yù)防并發(fā)癥的初步 機(jī)制。下調(diào)糖尿病大鼠體內(nèi)AGE-RAG系統(tǒng)