RT-PCR原理與實(shí)驗(yàn)操作步驟

1、聚合酶關(guān)鍵詞：RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄酶 reversetranscriptase鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物設(shè)計(jì)DNA聚合酶、知識(shí)背景:1、基因表達(dá)：DNA RNA P rotein單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制，如一個(gè)蠶絲心蛋白基因104個(gè)絲心蛋白mRN(每個(gè)mRNA存活4d,可以合成105個(gè)絲心蛋白)共合成109個(gè)絲心蛋白。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對(duì)于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。2、PCR 技術(shù)(olymerase chain reaction):即聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)。在模板、引物和四種脫氧核昔酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個(gè)人工合成的引物序列決 定。反應(yīng)分三步：A、變性：

2、通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA 退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié) 合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2+存在下，退火引物 沿5 3方向延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，如此反復(fù)。3、逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase )是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：1、依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第條鏈；2、Rnase水解活性：水解RNANA雜合體中的RNA 3、依賴DNA的 DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA.二、RT-PCR的準(zhǔn)備：

3、1、引物的設(shè)計(jì)及其原則：1)引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。 因此引物設(shè)計(jì)是否合理對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計(jì)時(shí)要充分考慮 到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNAI切方 式以及可能存在的hnRNA對(duì)引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個(gè)內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá) 過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。2)引物設(shè)計(jì)原則的把握：引物設(shè)計(jì)原則包括a、引物長(zhǎng)度：一般為1530bp,引物太短會(huì)影響PCR的特 異性，引物太長(zhǎng)PCR的最適延伸溫度會(huì)超過Taq酶的最適溫 度，也影響反應(yīng)的特異性。b、堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機(jī)分布，避免卩票吟或卩密咗的聚集存在，

4、特別是連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40%60%, PCR擴(kuò)增的復(fù)性溫度一般是較低Tm 值減去510度。c、3端要求：3,端必須與模板嚴(yán)格互補(bǔ)，不能進(jìn)行任何修 飾，也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是 A時(shí)錯(cuò) 配的引發(fā)效率最低，G C居中間，因此引物的3端最好選用力G C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個(gè)以上的Tod、引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則會(huì)自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。e、引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個(gè)連續(xù) 堿基互補(bǔ)，3,端不應(yīng)超過2個(gè)。f、同源序列：引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8 個(gè)的互補(bǔ)堿基存在。g、5端無(wú)嚴(yán)格限制：5

5、末端堿基可以游離，但最好是G或C使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位 點(diǎn)寺）寺寺。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計(jì)軟件如，等對(duì) 于這些 條件都可以自行設(shè)置。2、耗材：實(shí)驗(yàn)所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過%DE P水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPCo3、試劑準(zhǔn)備：變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酉精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。、RNA勺提取方法：RT- PCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RN

6、A酶活 性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA寸，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是釆用焦碳酸二乙酯（DEPC去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白R(shí)nasin和強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氤酸月瓜抑制內(nèi)源性RNA酶。實(shí)驗(yàn)操作步驟、實(shí)驗(yàn)器具與材料：1、移液槍：1ml、200 卩 1、20 卩 1、10 卩 1、2 卩 12、吸頭：1ml、200 卩 I、20 卩 13、勻漿管：5ml4、吸頭臺(tái):放置lml吸頭的一個(gè)，放置20 1吸頭的一個(gè)5、EP 管：、100 卩 16、試劑瓶：2個(gè)60m

7、l的棕色試劑瓶（廣口，帶蓋）1個(gè)125ml的白色試劑瓶（放無(wú)水乙醇）7、量筒:50ml、250ml、500ml&容量瓶：250ml 500ml 1000ml9、試管架：5ml.、20 110、鹽水瓶：250ml. 500ml各2個(gè)備用，一個(gè)裝無(wú)水乙醇,另一個(gè)裝DEPC水11、鋁制飯盒：4個(gè)12、塑料小飯盒:13、大瓷缸：2個(gè)14、錫泊紙：15、卷紙：2卷16、三角燒瓶：帶蓋，稍大、實(shí)驗(yàn)器具的處理與準(zhǔn)備1、塑料制品：（包括槍頭、EP管、勻漿管等）先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個(gè)浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓， 再烤干備用，實(shí)驗(yàn)前將槍頭等放入吸頭臺(tái)，再

8、咼壓一次（管）EP2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（DEPC水泡）（洗凈后先泡1%。DEPC過夜，再烤干）3、勻漿器：（包 括剪刀、躡子）先洗凈后，再高壓（不需要泡DEPC、試劑配制：放在1000ml容量瓶中靜置4小時(shí)備用。1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1%DEPC水,2、75%乙醇：用無(wú)水乙醇DEPC水配，然后放-20 C保存（其 i=EPC水需先高壓）3、異丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、瓊脂糖四、幾種緩沖液的配制：1、電泳緩沖液：Tris_54g硼酸EDTA 20ml ?蒸溜水 1000ml5XTBE （貯存液）再將5X TBE稀釋10

9、倍成就可以在電泳時(shí)使用（即工作液濃度），如取50ml貯存液450ml水一500ml Z作緩沖液2、上樣緩沖液:%二甲苯青FF 30%甘油 6X緩沖液，4C保存五、瓊脂糖凝膠的配制：1、%瓊脂糖100ml電泳緩沖液，微波爐中火30秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至60 C時(shí)加入10mg/ml漠化乙錠 卩1,充分混 勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置30-45min后現(xiàn)進(jìn)行電泳。2、%:同上，將瓊脂糖的量改為六、需購(gòu)置的RT-PCR材料：（生工.Tel. 2236106.）Taq 酶（含 MgCI2 Buffer ） 200udNT P: 1 支Oligo (dT) 15: 1 0D

10、p romegaM-MLV: 1 支 p romega (Buffer)RNasin: 1 支 11020 CDEPC 5gTrizol 100ml/l 瓶 Invitrogen Life technologies4CMarker: 10 Pg 卩 g/ml 科威(1543. 994. 697. 515. 377. 231七、引物合成 正義：5, -CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC- 反義：5 -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT- 2、p ar-4: 正義：5 -GGGACCTCGGAACTCAAC-反義：5 -TGTATCTGCCTGGGACTG-3、退火溫度

11、計(jì)算2 (A T) 4 ( G C)正反義平均數(shù)，再上下波動(dòng)度（土 4C,或土 504、引物各合成5 0D,每0D瓶分裝好5、引物稀釋:力n DEPC水量為二？ nmol / 0D X 管上所標(biāo) 0D 數(shù) X 100是為10p mol /卩1濃度的引物溶液八、PCR產(chǎn)物電泳 先將1-10卩1左右PCR產(chǎn)物，加已點(diǎn)在紙上 的漠酸蘭，反復(fù)吸打混勻后進(jìn)行電泳，一般電流為10mA電源100V,電泳30分鐘，紫外燈下觀察，滿意的結(jié)果掃描打印。九、幾個(gè)注意點(diǎn)：1、逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水浴？2、Rt時(shí)，先打開PCR預(yù)熱30分鐘。felW 刪I拋總持蔚離心機(jī)預(yù)冷。細(xì)胞IX 107組織100mg加 lmlT

12、RIzol細(xì)胞用lnil加樣器吹至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)塊勻漿（要徹底，后轉(zhuǎn)至EP管）（組織勻漿量100mg時(shí)分裝lml/每EP管）顛倒混勻10下，室溫5分鐘顛倒混勻10加氯仿1/5體積（）（必須按總體積的1/5 ） 下，室溫5分鐘4C,離心12000g, 15分鐘轉(zhuǎn)上層水相（約400卩I ）于另一管中加等體積異丙醇（約400卩I ）,混勻室溫10分鐘4C,離心12000g, 10分鐘棄上清加冰預(yù)冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml4C離心7500g, 5分鐘棄上清，空氣干燥5-10分鐘（不能完全干燥） 溶于DEPC水中至20卩I （10卩1-20卩I ）（可在55-60 C水中，V10分鐘助溶

13、）注:1、RNA若用于核酸轉(zhuǎn)移應(yīng)溶解于樣本緩沖液中，否則 DEPC 溶解2、細(xì)胞組織加TRIzol勻漿后，可在-60 C放置至少一個(gè)月 甚至可一年以上）3、RNA在75%乙醇中，2-8 C至少可保存一周，-20 C至少可 保存一年 兩步法RT-PCR第一步：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）試劑濃度體積終濃度RNA 23 卩 I 卩 I）Oligo（dT）15 卩 g/ 卩 I 4 卩 1（2 卩 I）卩 g/ 卩 1稀釋10倍后用）混勻，離心，70 C 5min立即冰水浴，稍離心試劑濃度體積終濃度M-MLV Buffer 5 X dNT P lOmM 孫（1RNasin 40U/ 卩 I 1M-MLV 200U/u 1 2 200U卩1 （1卩1）總體積40卩1（20卩1 ）混勻,離心，42 C 60min95C lOmin （破壞 MLV4C保存兩步法RT-PCR