細(xì)菌生物膜的形成和研究注射用雙黃連對(duì)細(xì)菌生物膜的影響

1、長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)碩士學(xué)位論文細(xì)菌生物膜的形成和研究注射用雙黃連對(duì)細(xì)菌生物膜的影響姓名：王坤申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：中藥學(xué)指導(dǎo)教師：高其品20090401英文縮略語(yǔ)英文縮寫B(tài)BF英文全稱the model of bactrial biofilms中文名詞細(xì)菌生物膜長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是個(gè)人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)特別加以注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并致謝。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名年月

2、日關(guān)于學(xué)位論文成果歸屬權(quán)的聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下自選課題或?qū)煶袚?dān)的國(guó)家立項(xiàng)資助的計(jì)劃課題的一部分，系本人在導(dǎo)師指導(dǎo)和資助下獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果，歸屬權(quán)為長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)和本人導(dǎo)師所有。特此聲明，本聲明的一切法律責(zé)任由本人承擔(dān)。論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名年月日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)保留使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向中國(guó)科學(xué)技術(shù)信息研究所及中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤版）電子雜志社送交論文的復(fù)印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權(quán)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入中國(guó)學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)及中國(guó)優(yōu)秀博碩士學(xué)位論文全文

3、數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或其他復(fù)印手段保存和匯編本學(xué)位論文。（保密論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定）論文作者簽名指導(dǎo)教師簽名年月日長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文中文摘要中 文 摘 要目的建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)菌生物膜（）的模型，考察注射用雙黃連以及注射用雙黃連方中藥材金銀花、連翹、黃芩不同提取部位對(duì) 形成的影響及抑制作用。方法采用 孔板，在特定的條件、方法下分別對(duì)細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)和細(xì)菌與提取物共同培養(yǎng)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量其 值來(lái)考察 的生長(zhǎng)能力。結(jié)果不同的培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度及 孔板的材質(zhì)等是影響 生長(zhǎng)的主要因素。結(jié)論注射用雙黃連對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌 的形成均有明顯的抑制作用。金銀花、黃

4、芩的醇提部分對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的 的形成和抑制作用較強(qiáng)。其它部分無(wú)明顯的作用。金銀花、黃芩醇提部分的氯仿和正丁醇的萃取部分對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的 的形成和抑制作用均較明顯。關(guān)鍵詞大腸桿菌金黃色葡萄球菌細(xì)菌生物膜注射用雙黃連金銀花連翹黃芩1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文英文摘要ABSTRACTPurpose: To establish the model of bactrial biofilms (BBF),and to observe the influenceof Shuanghuanglian injection and the different parts of hone

5、ysuckle、Weeping Forsythia andRadix Scutellariae to BBF.Method: By use of 96-well culture plate to culture the bacterial only and to culturebacterial and the extract of Shuanghuanglian injection together. The absorbance wasmeasured by plate reader to observe the growth ability of BBF.Result: The time

6、 of culture, the bacteria consistency and the meterial ofculture plate are all of the main facts that can affect the growth of BBF.96-wellConclusion: Shuanghuanglian injection haveobviousnegative affect to the growth ofBBF of E.coli and S.aureus. The alcohol- extractive fraction of Honeysuckle、Weepi

7、ngForsythia and Radix Scutellariaehaveobviousnegative affect to the growth of BBF of E.coli andS.aureus. Special, the powers of inhibition of the alcohol- extractive fraction of Honeysuckleand Radix Scutellariaeare stronger. The chloroform-extractive and n-butanol extractive fraction ofHoneysuckle a

8、lcohol extractionandRadix Scutellariae alcohol extractionhave obvious negative affectto the growth of BBF of E.coli and S.aureus.Key words :E.coli,S.aureus,BBF,Shuanghuanglian injection,Honeysuckle,WeepingForsythia,Radix Scutellariae2長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文前言前言長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為細(xì)菌是以單個(gè)的浮游狀態(tài)生存的，但近十年來(lái)，由于臨床上常發(fā)現(xiàn)一些讓人們費(fèi)解的

9、現(xiàn)象，例如慢性綠膿桿菌肺部感染、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、慢性中耳炎、齲齒、膽道感染和尿路感染、眼部感染、氣管插管患者的呼吸道感染等，這些感染一旦發(fā)生，即成為治療上的難題，有時(shí)即使分離出該病菌，并找到敏感的抗生素，但無(wú)論采用何種規(guī)范的強(qiáng)化的抗生素或抗生素組合治療，仍難以根除感染。近年來(lái)，由于研究和診斷技術(shù)的進(jìn)步，激光掃描共聚焦顯微鏡的誕生，人們才發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌的生存方式是以生物膜為主，浮游狀態(tài)為輔的。在這些難治性細(xì)菌性感染的病灶中大都存在著成為細(xì)菌生物膜的感染源，正是由于細(xì)菌生物膜的存在，使抗生素的作用大大減弱，可見(jiàn)細(xì)菌生物膜類感染是威脅人類健康的嚴(yán)重問(wèn)題。導(dǎo)師高其品教授擬從中藥的復(fù)方、中藥材提取物和單

10、體化合物中篩選出能夠抑制或破壞 BBF 形成的活性部位或活性成分。為從中藥中開(kāi)發(fā)治療慢性感染性疾病的新藥奠定可靠的基礎(chǔ)，為科學(xué)、客觀評(píng)價(jià)中醫(yī)藥在治療慢性感染方面的作用提供可靠的依據(jù)。本課題是在大量的理論研究及實(shí)踐基礎(chǔ)上開(kāi)展的，擬通過(guò)此課題的研究，為開(kāi)發(fā)新的藥物建立一種新的篩選方法。3長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文文獻(xiàn)綜述文 獻(xiàn) 綜 述長(zhǎng)期以來(lái)人們一直認(rèn)為細(xì)菌是以單個(gè)的浮游狀態(tài)生存的，但近十年來(lái)，由于臨床上常發(fā)現(xiàn)一些讓人們費(fèi)解的現(xiàn)象，例如慢性綠膿桿菌肺部感染1、2、3、4、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎5、慢性中耳炎6、齲齒7等，這些感染一旦發(fā)生，即成為治療上的難題，有時(shí)即使分離出該病菌，并找到敏感的抗生素，但

11、無(wú)論采用何種規(guī)范的強(qiáng)化的抗生素或抗生素組合治療，仍難以根除感染。近年來(lái)，由于研究和診斷技術(shù)的進(jìn)步，激光掃描共聚焦顯微鏡的誕生，人們才發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌的生存方式是以生物膜為主，浮游狀態(tài)為輔的。在這些難治性細(xì)菌性感染的病灶中大都存在著成為細(xì)菌生物膜的感染源，國(guó)內(nèi)外臨床實(shí)踐和研究結(jié)果證明這類細(xì)菌群體耐藥性極強(qiáng)，可以逃避宿主免疫作用，且感染部位難以徹底清除，是臨床上難治性感染的重要原因之一。正是由于細(xì)菌生物膜（ bactrial biofilms BBF）的存在，使抗生素的作用大大減弱8，可見(jiàn)細(xì)菌生物膜類感染是威脅人類健康的嚴(yán)重問(wèn)題。細(xì)菌生物膜（bacterial biofilm）是指由附著于惰性或活性

12、實(shí)體表面的細(xì)菌細(xì)胞和包裹著細(xì)菌的由細(xì)菌自身所分泌的含水聚合性基質(zhì)所組成的結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落8。生物膜廣泛存在于含水和潮濕的各種表面上，包括自來(lái)水管道、工業(yè)熱交換系統(tǒng)，甚至病理狀態(tài)下的人體組織器官。生物膜的形成和發(fā)展大致經(jīng)歷了以下幾個(gè)時(shí)期9。首先是浮游細(xì)菌粘附到一個(gè)實(shí)體的表面，為粘附期，這時(shí)的粘附是可逆的。然后粘附的細(xì)菌進(jìn)行分裂繁殖，并合成與分泌粘膠狀的胞外基質(zhì)，形成微菌落，為種植期，其對(duì)表面的粘附是牢固和不可逆的。隨后多個(gè)微菌落互相融合，向上生長(zhǎng)，為生長(zhǎng)期。生物膜發(fā)育形成蘑菇狀并含有液體通道的成熟生物膜，為成熟期。成熟生物膜通過(guò)蔓延、部分脫落和釋放出浮游狀細(xì)菌來(lái)擴(kuò)展和播散生物膜，為播散期。這幾個(gè)時(shí)

13、期，每個(gè)時(shí)期都會(huì)激活大量不同的細(xì)菌基因來(lái)完成其特定的任務(wù)。自從抗生素發(fā)明之后，細(xì)菌感染在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)受到了控制，尤其是急性細(xì)菌感染，抗生素治療往往能收到良好的療效。然而近 20 年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)，抗生素用量不斷加大而療效則日欠滿意，抗生素不得不更新?lián)Q代，然而耐藥菌株則不斷的涌現(xiàn)，這一切的原因固然與濫用抗生素使得細(xì)菌變異加快有關(guān)，但也與細(xì)菌生物膜類感染密切相關(guān)。細(xì)菌生物膜類感染的嚴(yán)重性在于感染的頑固性和反復(fù)性，即難以根除。實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果顯示，生物膜細(xì)菌對(duì)抗生素和殺菌消毒劑的抵抗力比浮游的非生物膜細(xì)菌強(qiáng)4長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文文獻(xiàn)綜述10 倍，老生物膜（生長(zhǎng)期超過(guò) 天）比新生物膜（生長(zhǎng)

14、期小于 天）耐藥強(qiáng)得多?？梢?jiàn)人類的健康正面臨著細(xì)菌生物膜的嚴(yán)重威脅。近年來(lái)，國(guó)外在細(xì)菌的抗藥機(jī)制上進(jìn)行了許多探討，取得了很大的進(jìn)展。美國(guó)東北大學(xué)的研究人員 Kim Lewis 從細(xì)菌生物膜中發(fā)現(xiàn)了一種對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性的基因HipA，這種基因能使生物膜中細(xì)菌進(jìn)入“冬眠”狀態(tài)。因?yàn)榭股刂荒茉谶@些細(xì)菌處于生活狀態(tài)下才能被摧毀，因此這些冬眠的細(xì)菌大大降低了抗生素的活性。2001 年 Lory與愛(ài)荷華州大學(xué)醫(yī)學(xué)院的生物學(xué)家 Greenberg 共同完成了題為“銅綠假單胞菌在成熟的生物膜上的基因表達(dá)”的論著，研究結(jié)果表明，銅綠假單胞菌在成熟的生物膜中有不同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，能夠鑒定形成生物膜所需的或生物膜

15、抵抗抗生素的特異性基因。美國(guó)的 Frank R Stermitz等人最新研究結(jié)果令從事中醫(yī)中藥研究人員為之振奮。從中藥多成分的協(xié)同作用闡述了經(jīng)變異而產(chǎn)生耐藥的細(xì)菌菌株是如何使具抗菌作用的小檗堿的抗菌能力下降的，又是如何利用黃酮類化合物來(lái)抑制耐藥菌株中外排泵的活性，從而提高小檗堿的抗菌作用的作用強(qiáng)度。研究從多種植物中所分離出的陽(yáng)離子型小檗堿，可以被已產(chǎn)生耐藥的葡萄球菌中的外排泵(NorA)穩(wěn)定地排除細(xì)菌外而降低抗菌活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，從分離小檗堿的同屬藥用植物中也能分離出一種葡萄球菌外排泵（NorA)的抑制劑。這種抑制劑被鑒定為 5-methoxyhnocapin(5-MHC),5-MHC 單獨(dú)作用

16、無(wú)抗菌活性，但能夠明顯起到抑制葡萄球菌外排小檗堿或結(jié)構(gòu)與小檗堿類似的季銨鹽類化合物的作用?？墒箤?duì)抗小檗堿的細(xì)菌的耐藥機(jī)制失去作用，細(xì)菌中小檗堿的含量在有 5-MHC的存在情況下迅速增加，使得小檗堿抗菌作用大大增強(qiáng)。應(yīng)用中醫(yī)中藥在我國(guó)防病治病已有幾千年的歷史，特別是在治療慢性感染性疾病方面有著顯著的療效。如臨床上常使用的黃連、黃柏、大青葉、板藍(lán)根等 400 多種中草藥，均證明具有明顯的抗菌活性。臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果已顯示出一種中藥少則有殺滅一種細(xì)菌的作用，多則能殺滅十幾種細(xì)菌，這種多成分、多靶點(diǎn)、多作用使中藥具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。例如市場(chǎng)已有藥品板藍(lán)根沖劑，主要是對(duì)枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌

17、等具有抗菌作用。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，己從黃連、黃柏等藥材中提取出小檗堿單體化合物，主要用于治療痢疾桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌引起的腸道感染；從魚腥草中提取的魚腥草素對(duì)金黃色葡萄球菌、流感桿菌、白色念球菌感染引起的感染，均顯示出抗菌作用。近十年來(lái)，臨床上對(duì)于一些慢性感染性疾病，如心肌炎、尿路感染、中耳炎等，均采用了中藥配合抗生素治療，取得了很好的療效，尤其在恢復(fù)期顯示了中醫(yī)理論治本的獨(dú)特作用，療效均好于單純使用抗生素治療。5長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文文獻(xiàn)綜述本課題在前人的研究基礎(chǔ)上，建立了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 BBF 的模型。注射用雙黃連具有顯著的抑菌、抗病毒的作用，可用于病毒、

18、病菌感染性疾病，如：上呼吸道感染、急性支氣管炎等。該產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用于臨床 10 余年，收到了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。我國(guó)遭遇 SARS 期間，注射用雙黃連發(fā)揮了很大的作用，有很好的藥效。因此我們選擇注射用雙黃連和注射用雙黃連方中三味藥材黃芩、金銀花、連翹來(lái)考察它們分別對(duì) BBF 形成的影響和抑制作用，為進(jìn)一步研究中藥抗菌成分打下基礎(chǔ)。本課題為從中藥中開(kāi)發(fā)治療慢性感染性疾病的新藥奠定可靠的基礎(chǔ)，為科學(xué)、客觀評(píng)價(jià)中醫(yī)藥在治療慢性感染方面的作用提供了新的方法。6長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究實(shí) 驗(yàn) 研 究1 儀器與材料1.1 實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌:購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；菌種編號(hào)：1.13

19、69。金黃色葡萄球菌: 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；菌種編號(hào):1.0089。注射用雙黃連、黃芩、金銀花、連翹：購(gòu)于藥店。1.2 試劑試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純NB 培養(yǎng)基瓊脂1.3 儀器96 孔細(xì)菌培養(yǎng)板北京化工廠北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心海門市天龍實(shí)驗(yàn)器材制造廠恒溫振蕩器太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)儀器廠THZ-?恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司 DHP-9025低溫冰箱SANYOMDF-U4086S酶標(biāo)儀超凈臺(tái)熱電(上海)儀器有限公司蘇州凈化設(shè)備有限公司MK3SW-CJ-2D恒溫水浴鍋金壇市江南儀器廠HH-4高壓滅菌器上海東亞壓力容器制造有限公司 01J2003-042 BBF 模型的建立2.1

20、 大腸桿菌 BBF 模型的建立2.1.1 菌種的復(fù)活將大腸桿菌凍干粉加入 0.4ml NB 培養(yǎng)基溶解后，放入 37恒溫振蕩器（23轉(zhuǎn)分鐘）中培養(yǎng) 8 小時(shí)，分裝在離心管中，加入 0.5ml 的 50%甘油，置于液氮中，于-80冰箱中冷藏保存。2.1.2 大腸桿菌 BBF 模型建立的方法將置于-80冰箱中的大腸桿菌劃線于 NB 培養(yǎng)基的平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于 36培養(yǎng) 24 小時(shí)。挑取平板上的單一菌落溶于 5ml NB 液體培養(yǎng)基中，于 36恒溫7長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究振蕩器中振蕩 8 小時(shí)，得到單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液，備用。將菌液稀釋 100 倍（論文以下的“菌液”均

21、指稀釋 100 倍后的菌液）置于 96 孔板中，四周為 NB 培養(yǎng)基作為空白，如圖 1。置于恒溫培養(yǎng)箱中，于 36培養(yǎng) 24 小時(shí)，取出。將菌液傾出，用蒸餾水反復(fù)清洗后，加入 0.1%結(jié)晶紫染色 30 分鐘后，將結(jié)晶紫傾出，洗凈，加入 1%脫氧膽酸鈉溶液，30 分鐘后，測(cè)其 600nm 處的 OD 值。以菌液濃度為橫坐標(biāo)，以 OD 值為縱坐標(biāo)，考察 BBF 生長(zhǎng)情況。虛線部分為 NB 培養(yǎng)基（空白）實(shí)線部分為菌液圖 1 96 孔板的點(diǎn)樣方法2.2 影響大腸桿菌 BBF 生長(zhǎng)的因素：通過(guò)實(shí)驗(yàn)的反復(fù)摸索，我們發(fā)現(xiàn)影響大腸桿菌 BBF 生長(zhǎng)的因素主要有以下幾種：菌種：不同的大腸桿菌菌株對(duì) BBF 的

22、影響很大，直接影響到 BBF 的生長(zhǎng)與否和 BBF 形成的好壞。且大腸桿菌傳代越多，BBF 的生長(zhǎng)情況越不好，故我們每次實(shí)驗(yàn)均采用大腸桿菌（菌號(hào)：1.1369）的第二代菌株。96 孔板的材質(zhì)：不同的細(xì)菌在不同材質(zhì)的 96 孔板上的生長(zhǎng)情況是不同的。我們選用了市場(chǎng)上常見(jiàn)的三種 96 孔板分別是進(jìn)口聚氯乙烯（PVC）板，國(guó)產(chǎn)聚苯乙烯（PS）板，進(jìn)口聚苯乙烯板，大腸桿菌分別在不同材質(zhì)的 96 孔板上培養(yǎng)，見(jiàn)圖 2。結(jié)果，大腸桿菌在國(guó)產(chǎn) PS板上的生長(zhǎng)情況是最好的。8長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究培養(yǎng)時(shí)間：圖 2不同 96 孔板材質(zhì)的對(duì)比進(jìn)口 板驗(yàn) 國(guó)產(chǎn) 小36 小時(shí)，考察BBF 的生長(zhǎng)情況。

23、見(jiàn)圖 3。結(jié)果，大腸桿菌在培養(yǎng) 24 小時(shí)后，BBF 的生長(zhǎng)情況最好。 進(jìn)口 板菌液稀釋倍數(shù)菌液稀釋倍數(shù)圖 3不同培養(yǎng)時(shí)間的對(duì)比菌液濃度：菌液稀釋不同的濃度也對(duì)大腸桿菌 BBF 的生長(zhǎng)情況有影響。我們分別將菌液稀釋10 倍、50 倍、100 倍、200 倍、300 倍分別進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其 OD 值。見(jiàn)圖 4。結(jié)果，菌液濃度高時(shí)，BBF 生長(zhǎng)能力較弱，當(dāng)菌液稀釋 100 倍時(shí)，BBF 的生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，因此選定將菌液稀釋 100 倍作為菌液濃度。9OD 值值考慮到實(shí) 操作時(shí)間的可行性，我們選定將大腸桿菌分別培養(yǎng) 18 板 時(shí)、24 小時(shí)、長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究菌液稀釋倍數(shù)圖 4不同

24、菌液濃度的對(duì)比2.3 金黃色葡萄球菌 BBF 的建立及影響因素金黃色葡萄球菌的 BBF 模型的建立方法基本上與大腸桿菌的相同。在這里就不做詳細(xì)的介紹。我們?nèi)耘f分別考察了 96 孔板的材質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間及菌液濃度等因素，最終確定金黃色葡萄球菌菌液稀釋 100 倍、于國(guó)產(chǎn) PS 板上培養(yǎng) 24 小時(shí)，BBF 的生長(zhǎng)的最好且穩(wěn)定。3 注射用雙黃連對(duì) BBF 的影響3.1 培養(yǎng)方法的建立我們建立兩種方法分別考察藥物對(duì) BBF 形成的影響及對(duì) BBF 的抑制作用。96 孔板的點(diǎn)樣方法 1：四周為菌液（NB 培養(yǎng)基）。B 行加入 180l 菌液（NB 培養(yǎng)基）， 行每孔各加入 l 菌液（ NB 培養(yǎng)基），B

25、行每孔用移液槍加入 20l 藥液，混勻，用多通道移液槍從 B 行吸出 100l 移入 C 行，混勻，再?gòu)?C 行吸出 100l 移入D 行，依此類推至 H 行，吸出 100l 后，棄去。即從 行藥液濃度以 倍遞減。96 孔板的點(diǎn)樣方法 2：四周為菌液。B 行加入 100l NB 培養(yǎng)基， 行每孔用移液槍加入 100l 藥液，混勻，用多通道移液槍從 B 行吸出 100l 移入 C 行，混勻，再?gòu)?C 行吸出 100l 移入 D 行，依此類推至 H 行，吸出 100l 后，棄去。即從 行藥液濃度以 倍遞減。培養(yǎng)方法一：考察對(duì) BBF 形成的影響。按“ 孔板點(diǎn)樣方法 ”完成后，依照“2.1.2 大腸

26、桿菌 BBF 模型建立的方法”中置于恒溫培養(yǎng)箱中，于 36培養(yǎng) 小時(shí)，以藥液濃度為橫座標(biāo)，以平均 值為縱坐標(biāo)，作圖，考察對(duì) 形成的影響。10 值長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究培養(yǎng)方法二：考察對(duì) BBF 的抑制作用我們先將 96 孔板全部點(diǎn)菌液，依照“2.1.2 大腸桿菌 BBF 模型建立的方法”置于恒溫培養(yǎng)箱中，于 36培養(yǎng) 24 小時(shí)，取出，此時(shí) BBF 已經(jīng)形成，將菌液傾出，按“3.1中 96 孔板點(diǎn)樣方法 2”，將培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 小時(shí)，以藥液濃度為橫座標(biāo)，以平均 值為縱坐標(biāo)，考察對(duì) BBF 的抑制作用。3.2 考察對(duì) BBF 形成的影響。將注射用雙黃連加水溶解，配制成 5mg/

27、ml 的藥液，分別進(jìn)行對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)方法一和培養(yǎng)方法二的操作。點(diǎn)樣方法見(jiàn)圖 5。乙醇提取部分（ 列）空空白水溶部分（ 列）白圖 596 孔板點(diǎn)樣方法3.2.1 注射用雙黃連對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響結(jié)果見(jiàn)圖 6圖 6注射用雙黃連對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響結(jié)果見(jiàn)圖 7值11625藥液濃度（g/ml）3.2.2 注射用雙黃連對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究圖 7注射用雙黃連對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用3.2.3 注射用雙黃連對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響值625藥液濃度（g/ml）83.2.4 注射用雙黃連對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF

28、 的抑制作用結(jié)果見(jiàn)圖 9值藥液濃度（g/ml）12結(jié)果見(jiàn)圖 8圖 注射用雙黃連對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究圖 9注射用雙黃連對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 的抑制作用由圖可見(jiàn)，注射用雙黃連對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌 BDF 的形成均有抑制作用。 值 為了進(jìn)一步考察注射用雙黃連中對(duì) BBF 形成和抑制有明顯作用的有效部位，我們4.1 藥材的提取 藥液濃度（g/ml）并濾液，濾液濃縮，得金銀花藥材乙醇提取部分。殘?jiān)铀逯?3 次，每次 2 小時(shí)，濾過(guò)，合并濾液，濾液濃縮，得金銀花藥材水提取部分。同法，制得連翹及黃芩的醇提部分和水提部分。4.2 考察對(duì)大腸桿

29、菌 BBF 的影響4.2.1 三種藥材水溶部分對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響將三種藥材的水溶部分分別加水配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法一”的方法培養(yǎng)， 列、 列、 列分別為金銀花、連翹、黃芩的水溶部分。結(jié)果見(jiàn)圖 10。134 黃芩、金銀花、連翹對(duì) BBF 影響的考察將注射用雙黃連中的三味藥材金銀花、黃芩、連翹分別進(jìn)行了提取分離。取金銀花藥材 2Kg，粉碎，加 95%乙醇加熱回流提取 5 次，每次 3 小時(shí)，濾過(guò)，合長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究三種藥材的水溶部分對(duì)大腸桿菌形成的影響金銀花連翹黃芩 濃度圖 10三種藥材水溶部分對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響4.2.

30、2 三種藥材水溶部分對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用取三種藥材水溶部分分別配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法二”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 11。三種藥材的水溶部分對(duì)大腸桿菌的抑制作用金銀花連翹黃芩 濃度圖 11三種藥材水溶部分對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用4.2.3 三種藥材醇提部分對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響將三種藥材的醇提部分分別加水配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法一”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 12。14值值長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究三種藥材的乙醇提取部分對(duì)大腸桿菌形成的影響金銀花連翹黃芩 濃度圖 12三種藥材醇提部分對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的

31、影響4.2.4 三種藥材醇提部分對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用取三種藥材醇提部分配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法二”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 13。三種藥材的乙醇提取部分對(duì)大腸桿菌的抑制作用金銀花連翹黃芩 濃度圖 13三種藥材醇提部分對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用4.3 考察對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 的影響4.3.1 三種藥材水溶部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響取三種藥材水溶部分配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法一”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 14。15值值長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究三種藥材的水溶部分對(duì)金黃色葡萄球菌形成的影響金銀花連翹黃芩

32、濃度圖 14三種藥材水溶部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響4.3.2 三種藥材水溶部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 的抑制作用取三種藥材水溶部分配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法二”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 15。三種藥材的水溶部分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用金銀花連翹黃芩 濃度圖 15三種藥材水溶部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 的抑制作用4.3.3 三種藥材醇提部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響取三種藥材水溶部分配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法一”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 16。16值值長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究三種藥材的乙醇提取部分對(duì)金黃色

33、葡萄球菌形成的影響金銀花連翹黃芩 濃度圖 16三種藥材醇提部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響4.3.4 三種藥材醇提部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 的抑制作用取三種藥材醇提部分配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法二”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 17。三種藥材的乙醇提取部分對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用金銀花連翹黃芩 濃度圖 17三種藥材醇提部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 的抑制作用由圖可見(jiàn)，金銀花、連翹、黃芩的乙醇提取部分對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的BBF 的形成和抑制作用較明顯。其中金銀花、黃芩的醇提部分對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的 BBF 的形成和抑制作用較強(qiáng)。因此，我們對(duì)金銀花

34、、黃芩醇提部分做進(jìn)一步的分離研究。5 金銀花、黃芩醇提部分對(duì) BBF 的影響5.1 醇提部分的進(jìn)一步提取17值值長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究取金銀花的醇提部分，用少量水分散，分別氯仿和正丁醇萃取，得氯仿萃取和正丁醇萃取兩個(gè)部分，分別回收氯仿、正丁醇，得金銀花氯仿萃取物和金銀花正丁醇萃取物。同法，制得黃芩氯仿萃取物和黃芩正丁醇萃取物。5.2 考察對(duì)大腸桿菌 BBF 的影響5.2.1 黃芩藥材醇提部分的萃取物對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響將黃芩藥材醇提部分的氯仿和正丁醇萃取物分別加水配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法一”的方法培養(yǎng)，14 列、58 列、912 列分別為

35、黃芩水、黃芩正丁醇、黃芩氯仿，結(jié)果見(jiàn)圖 18。黃芩醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌形成的影響黃芩水黃芩正丁醇黃芩氯仿 濃度圖 18黃芩醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響5.2.2 金銀花藥材醇提部分的萃取物對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響依照 5.2.1 方法，將金銀花藥材醇提部分培養(yǎng)、點(diǎn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖 19。金銀花醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌形成的影響金銀花水金銀花正丁醇金銀花氯仿 濃度圖 19金銀花醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌 BBF 形成的影響18值值長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究5.2.3 黃芩藥材醇提部分的萃取物對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用將黃芩藥材醇提部分的氯仿和正丁醇萃取物分別加

36、水配制成 10mg/ml 的藥液，依照“3.1 培養(yǎng)方法二”的方法培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖 20。黃芩醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌的抑制作用黃芩水黃芩正丁醇黃芩氯仿 濃度圖 20黃芩醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用5.2.4 金銀花藥材醇提部分的萃取物對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用依照 5.2.3 方法，將金銀花藥材醇提部分培養(yǎng)、點(diǎn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖 21。金銀花醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌的抑制作用金銀花水金銀花正丁醇金銀花氯仿 濃度圖 21金銀花醇提的萃取部分對(duì)大腸桿菌 BBF 的抑制作用5.2.5 黃芩藥材醇提部分的萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響依照 5.2.1 方法，將黃芩藥材醇提的萃取部分培養(yǎng)、點(diǎn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖 22。19值值長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 屆碩士學(xué)位論文實(shí)驗(yàn)研究黃芩醇提的萃取部分對(duì)金黃色葡萄球菌形成的影響黃芩水黃芩正丁醇黃芩氯仿 濃度圖 22黃芩醇提的萃取部分對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響5.2.6 金銀花藥材醇提部分的萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌 BBF 形成的影響依照 5.2.2 方法，將金銀花藥材醇提的萃取部分培養(yǎng)、點(diǎn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖 23。金銀花醇提的萃取部分對(duì)金黃色葡萄球菌形成的影響金銀花水金銀