大豆幼苗期耐鹽堿性的鑒定與關(guān)聯(lián)分析碩士學(xué)位論文

1、 碩 士 學(xué) 位 論文 大豆幼苗期耐鹽堿性的鑒定與關(guān)聯(lián)分析 指導(dǎo)教師 專業(yè)名稱 作物遺傳育種 研究方向 大豆耐逆遺傳與生物統(tǒng)計(jì) 答辯日期 evaluation and association mapping for soybean salt- alkaline tolerance at seeding stage by zhang wenjie the thesis submitted to nanjing agricultural university nanjing p.r.china in partial fulfillment of the requirements for the m

2、aster degree supervised by prof. zhang yuan-ming completed in june 2012 原 創(chuàng) 性 聲 明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得 的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā) 表或撰寫過(guò)的作品成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以 明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者(需親筆)簽名： 年 月 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向 國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)

3、構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授 權(quán)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可 以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文。 保密，在 年解密后適用本授權(quán)書。本學(xué)位論文屬于不保密。 (請(qǐng)?jiān)谝陨戏娇騼?nèi)打“”) 學(xué)位論文作者(需親筆)簽名： 年 月 日 導(dǎo)師(需親筆)簽名： 年 月 日 目 錄 摘 要 .i abstract.iii 符號(hào)說(shuō)明(英文縮略詞).v 第一章 文獻(xiàn)綜述.1 1.鹽堿脅迫對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響.1 1.1 鹽脅迫對(duì)大豆生長(zhǎng)發(fā)育的影響.1 1.2 堿脅迫對(duì)大豆生長(zhǎng)發(fā)育的影響.1 2 大豆耐鹽、堿性鑒定及大豆種質(zhì)資源耐鹽、堿

4、性評(píng)價(jià).2 2.1 大豆耐鹽堿性鑒定.2 2.1.1 耐鹽堿的鑒定方法.2 2.1.1.1 田間鑒定.2 2.1.1.2 室內(nèi)鑒定.2 2.1.2 大豆鹽害鑒定指標(biāo).3 2.1.2.1 相對(duì)鹽害指數(shù)法.3 2.1.2.2 形態(tài)傷害評(píng)價(jià)法.3 2.1.2.3 綜合指數(shù)法.4 2.1.2.4 測(cè)定鈉離子、氯離子濃度法.4 2.2 大豆種質(zhì)資源耐鹽堿性評(píng)價(jià).5 3 大豆耐鹽性遺傳、qtl 定位和耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展.5 3.1 經(jīng)典遺傳學(xué)研究.5 3.1.1 單基因控制.5 3.1.2 多基因控制.6 3.2 大豆耐鹽堿 qtl 定位的研究進(jìn)展 .6 3.2.1 大豆耐鹽性 qtl 定位研究進(jìn)展.7 3

5、.2.2 大豆耐堿性 qtl 定位研究進(jìn)展.8 3.3 大豆耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展.9 3.3.1 鹽脅迫下鹽離子的吸收、外排和轉(zhuǎn)運(yùn).9 3.3.2 滲透調(diào)節(jié)機(jī)制.9 3.3.3 野生大豆的耐鹽機(jī)理.10 4 關(guān)聯(lián)分析的研究進(jìn)展.10 4.1 關(guān)聯(lián)分析的原理.10 4.1.1 連鎖不平衡.11 4.1.2 連鎖不平衡的度量.11 4.1.3 影響連鎖不平衡的因素及 ld 衰減 .12 4.2 關(guān)聯(lián)分析特點(diǎn).13 4.3 關(guān)聯(lián)分析的方法、步驟與注意事項(xiàng).13 4.3.1 關(guān)聯(lián)分析的方法.13 4.3.2 關(guān)聯(lián)分析的步驟.15 4.3.3 關(guān)聯(lián)分析需注意的問(wèn)題.16 4.4 關(guān)聯(lián)分析在大豆中的應(yīng)用.17

6、 5 本研究的目的與研究?jī)?nèi)容.18 第二章 試驗(yàn)材料與分析方法.21 1 材料與方法.21 1.1 實(shí)驗(yàn)材料.21 1.2 大豆幼苗期耐鹽堿相關(guān)性狀考察.21 1.3 ssr 全基因組掃描 .21 1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器.21 1.3.2 dna 提取.21 1.3.2.1 試劑配制.21 1.3.2.2 dna 提取步驟.22 1.3.3 pcr 擴(kuò)增.22 1.3.4 凝膠電泳檢測(cè).23 1.3.4.1 試劑配制.23 1.3.4.2 凝膠電泳.24 2 數(shù)據(jù)的分析方法.25 2.1 表型數(shù)據(jù)分析.25 2.2 連鎖不平衡分析.25 2.3 群體結(jié)構(gòu)分析.26 2.4 關(guān)聯(lián)分析.26 第三章

7、 結(jié)果與分析.29 1 大豆幼苗期耐鹽堿相關(guān)性狀的表型特征、方差及相關(guān)分析.29 1.1 大豆幼苗期耐鹽堿相關(guān)性狀的表型特征分析.29 1.2 方差分析.31 1.3 相關(guān)和偏相關(guān)分析.33 1.4 連鎖不平衡分析.33 2 大豆幼苗期耐鹽堿性鑒定.35 3、鹽堿指數(shù)的定位結(jié)果.38 3.1 主根長(zhǎng)耐鹽、堿指數(shù)結(jié)果.38 3.2 根鮮重耐鹽、堿指數(shù)結(jié)果.38 3.3 根干重耐鹽、堿指數(shù)結(jié)果.39 3.4 下胚軸長(zhǎng)耐鹽、堿指數(shù)結(jié)果.39 3.5 幼苗生物量耐鹽、堿指數(shù)結(jié)果.43 4 原始表型性狀的定位結(jié)果.43 4.1 主根長(zhǎng)定位結(jié)果.44 4.2 下胚軸長(zhǎng)定位結(jié)果.44 4.3 根干重定位結(jié)果

8、.45 4.4 根鮮重定位結(jié)果.48 4.5 優(yōu)異等位基因的挖掘.48 第四章 討論.51 1.與前人耐鹽、堿性 qtl 定位結(jié)果的比較.51 2.相關(guān)分析與 qtl 成簇現(xiàn)象.52 3.與擬南芥耐鹽、堿基因的比較.54 4.與現(xiàn)有大豆耐鹽、堿基因的比較.55 5.指數(shù)與原始性狀定位結(jié)果的比較.58 6 方法間的比較.63 第五章 全文結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn).65 1 全文結(jié)論.65 2 創(chuàng)新點(diǎn).66 參考文獻(xiàn).67 附 表.79 致 謝.81 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文.82 大豆幼苗期耐鹽堿性的鑒定與關(guān)聯(lián)分析 摘 要 土壤鹽堿化是世界范圍內(nèi)影響農(nóng)作物生產(chǎn)的主要非生物脅迫因子，同時(shí)也是降低 作物產(chǎn)量的

9、主要因子。全世界大概有 20%的農(nóng)業(yè)灌溉用地受到鹽堿的影響。近年來(lái)， 由于不合理農(nóng)業(yè)灌溉進(jìn)一步加重了耕地鹽堿化。為保持大豆在鹽堿化土壤環(huán)境的持續(xù) 生產(chǎn)，培育新品種是一種有效途徑。然而，其先決條件是解析大豆耐鹽堿性的遺傳機(jī) 制。 大豆耐鹽堿性遺傳研究主要是利用雙親分離群體，其結(jié)果對(duì)作物育種貢獻(xiàn)有限。 為克服這一缺陷，利用品種資源群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析是一種有效的方式。為此，本研究 以分層隨機(jī)抽樣方法抽取的 257 份大豆品種為研究材料，在大豆幼苗期分別以濃度 為 100 mm 的 nacl 溶液和 10 mm 的 na2co3溶液作為鹽、堿處理液，以蒸餾水處理 作為對(duì)照，大豆幼苗期主根長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)、根

10、鮮重、根干重和幼苗生物量的表型值以及 各性狀的耐鹽、堿指數(shù)為指標(biāo)，鑒定各大豆品種的耐鹽堿性；利用 135 個(gè) ssr 標(biāo)記掃 描該品種群體獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，通過(guò)上位性關(guān)聯(lián)分析方法（eam）和兩種改進(jìn)的壓 縮混合線性模型方法（ecmlma 和 ecmlm）進(jìn)行大豆耐鹽堿性的關(guān)聯(lián)分析；利用關(guān) 聯(lián)分析結(jié)果，發(fā)掘優(yōu)異等位基因與載體品種，并實(shí)施設(shè)計(jì)育種。其主要結(jié)果如下： 1、以大豆幼苗期根鮮重耐鹽和耐堿指數(shù)為指標(biāo)，鑒定出兩年表現(xiàn)基本一致、重復(fù) 性好的耐鹽品種 2 個(gè)：楓紫田岸豆和白秋 1 號(hào)；鑒定出耐堿品種 8 個(gè)：臨安八月白、嵊 縣田埂豆、遵義棕子豆、北川烏眼窩、楓紫田岸豆、廣西大粒豆、合豆 6 號(hào)和

11、冀豆 13。 楓紫田岸豆既耐鹽又耐堿。 2、以耐鹽堿指數(shù)為指標(biāo)，通過(guò) ecmlm 方法檢測(cè)到 129 個(gè) qtls，其中主根長(zhǎng)、 根鮮重、根干重、下胚軸長(zhǎng)和幼苗生物量分別有 35、24、19、33 和 18 個(gè)；通過(guò) eam 方 法共檢測(cè)到 154 個(gè) qtls，其中主根長(zhǎng)、根鮮重、根干重、下胚軸長(zhǎng)和幼苗生物量分別 有 28、31、22、33 和 40 個(gè)。兩種方法共同檢測(cè)到 30 個(gè) qtls，以 qtl環(huán)境互作為主， 貢獻(xiàn)率為 0.68%-9.38%。以原始觀測(cè)值為指標(biāo)，通過(guò) ecmlma、ecmlm 和 eam 方 法共同檢測(cè)到 20 個(gè) qtls，其中主根長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)、根干重和根鮮重分

12、別有 6、10、1 和 3 個(gè)。上述兩種結(jié)果間既有相同的 qtl，又有一定的互補(bǔ)性。 本研究獲得的大豆耐鹽堿性部分關(guān)聯(lián)標(biāo)記與擬南芥耐鹽基因的大豆同源基因連 鎖，例如 satt453、satt656、satt411、satt687、satt256、satt413、sat_153、satt672 和 satt102。 3、利用關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，估計(jì)各 qtl 的等位基因效應(yīng)，挖掘優(yōu)異等位基因與載體 品種，例如，主根長(zhǎng)耐鹽與耐堿指數(shù)減效最大的等位變異分別為 353 bp（sat_256）和 401 bp（sat_344），其載體品種分別為德興老鼠牙和徐豆 10 號(hào)。發(fā)現(xiàn)白秋 1 號(hào)和北川烏 眼窩均攜帶耐

13、鹽、耐堿的優(yōu)異等位變異，具有育種利用價(jià)值。 關(guān)鍵詞：大豆；耐鹽堿性；抗性鑒定；關(guān)聯(lián)分析;優(yōu)異等位基因 evaluation and association mapping for soybean salt-alkaline tolerance at seeding stage abstract soil salinization is an important abiotic stress for crop production worldwide, and seriously reduced crop yield as well. about 20% of the agricultural

14、irrigation land was affected by salt and alkaline. in recent years, soil salinization is more and more serious owing to unsuitable irrigation. to maintain a sustainable production of soybean in a salt stress environment, developing alkaline-salt tolerant cultivars is an efficient way. however, the p

15、rerequisite for the breeding is to elucidate genetic mechanism of the tolerance. previous studies on soybean alkaline-salt tolerance focus on bi-parental segregation populations, and its results have a limited role in crop breeding. to overcome the shortcoming, an alternative approach is to conduct

16、genome-wide association studies (gwas) in in soybean cultivar resource. in this study, therefore, 257 soybean cultivars randomly selected from china, along with 135 ssr marker information, were used to carry out gwas for the tolerance using enriched compression mixed linear model (ecmlm) and epistat

17、ic association mapping (eam) approaches. evaluation of soybean alkaline-salt tolerance was carried out based on length of main root (lr), fresh and dry weights of roots (fwr and dwr), biomass of seedlings (bs) and length of hypocotyls (lh) for healthy seedlings after treatments with control, 100 mm

18、nacl and 10 mm na2co3 for about one week under greenhouse conditions. using results from gwas, genetic effects of all the alleles for each locus were estimated so that elite allele and its cultivar could be found and breeding by design could be performed. the main results were asd follows. first, us

19、ing fwr index at seedling stage, two cultivars (zifengtianandou and baiqiuno.1) have a stable saline tolerant performance, and eight cultivars (linanbayuebai, shengxiantiangengdou, zunyizongzidou, beichuanwuyanwo, zifengtianandou, guangxi- dalidou, hedou no.6 and jidou no.13) have a stable alkaline

20、tolerant performance in 2009 and 2010. note that zifengtianandou has the above two performances simultaneously. second, with alkaline-salt tolerant indices, a total of 129 main-effect qtl: 35 for lr, 24 for fwr, 19 for dwr, 33 for lh and 18 for bs, were detected by the ecmlm method, whereas a total

21、of 154 qtl: 19 for lr, 27 for fwr, 18 for dwr, 26 for lh and 32 for bs, were identified by the eam. it should be noted that there are 30 common qtl with the heritabilities of 0.68%-9.38%, which are mainly qtl-by-environment interaction. with original observations for the alkaline-salt tolerance, 20

22、common qtl: 6 for lr, 10 for lh, 1 for dwr and 3 for fwr, were identified by ecmlma, ecmlm and eam approaches. some same qtl were observed between the above two kinds of results. more importantly, some alkaline-salt tolerance genes in arabidopsis thaliana and soybean are found to be around the toler

23、ance-associated markers in this study, i.e., satt453, of satt656, satt411, satt687 satt256, satt413 sat_153, satt672, and satt102. finally, the above results from gwas were used to estimate allelic effects so that novel allele and its cultivar could be mined, for example, elite alleles for lr alkali

24、ne-salt tolerance indices were 353 bp (sat_256) and 401 bp (sat_344) and their corresponding cultivars were dexinlaoshuya and xudou no. 10. note that baiqiuno.1 and beichuanwuyanwo have the tolerance to salt and alkaline stresses simultaneously, which are of use in soybean breeding. key words： soybe

25、an; tolerance to alkaline-salt stresses; resistance measurement; genome-wide association study; novel allele 符號(hào)說(shuō)明(英文縮略詞) 縮寫英文名稱中文名稱 ctabcetyltrimethyl ammonium bromide溴代十六烷基三甲胺 edtaethylene diamine tetra-acetic acid乙二胺四乙酸 pvppolyvinyl pyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮 tristris(hydroxymethyl) aminomethane三(羥甲基)氨基甲烷

26、 dnadeoxyribo nucleic acid脫氧核糖核酸 acracrylamide丙烯酰胺 bisbis-acrylamide甲叉雙丙烯酰胺 apammonium persulfate過(guò)硫酸銨 temedn，n，n，n-tetramethylethlenediaminen，n，n，n-四甲基乙二胺 masmolecular marker-assisted selection分子標(biāo)記輔助選擇 pcrpolymerase chain reaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ssrsimple sequence repeats簡(jiǎn)單序列重復(fù) snpsingle nucleotide polymorp

27、hism單核苷酸多態(tài)性 aflpamplified fragment length polymorphism擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性 rapdrandom amplified polymorphic dna隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 dna rflprestriction fragment length polymorphism限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 estexpressed sequence tags表達(dá)序列標(biāo)簽 qtl quantitative trait locus數(shù)量性狀基因座 ldlinkage disequilibrium連鎖不平衡 gwasgenome-wide association study全

28、基因組關(guān)聯(lián)分析 glmgeneral linear model一般線性模型 mlmmixed linear model混合線性模型 namnested association mapping巢式關(guān)聯(lián)作圖 cmlmcompressed mixed linear model壓縮的混合線性模型 eamepistatic association mapping上位性關(guān)聯(lián)分析 ecmlmenriched compressed mixed linear model改進(jìn)的壓縮混合線性模型 ecmlmaenriched compressed mixed linear model advanced 改進(jìn)的壓縮混

29、合線性模型的提高 第一部分 文獻(xiàn)綜述 第一章 文獻(xiàn)綜述 1. 鹽堿脅迫對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響 鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響主要分為兩個(gè)階段。第一階段，主要通過(guò)滲透脅迫抑 制植物幼葉的生長(zhǎng)，該過(guò)程相對(duì)較快。當(dāng)植株根際的鹽溶液濃度達(dá)到臨界水平時(shí) （大豆的臨界值大約為 40 mm nacl） ，植株莖和葉的生長(zhǎng)量開(kāi)始下降，新葉、新芽 的形成減緩，甚至處于休眠狀態(tài)，形成的側(cè)枝也相應(yīng)減少。在單子葉植物中，鹽脅 迫的影響主要表現(xiàn)在植株分蘗數(shù)下降，從而降低植物總?cè)~面積；而在雙子葉植物中 則主要是植株的葉片變小，分支數(shù)下降。第二階段為離子毒害，雖然該過(guò)程比較緩 慢，但加速了成熟葉片的衰老進(jìn)程。當(dāng)植株成熟葉片中鹽濃度達(dá)到離

30、子毒害濃度時(shí)， 老葉衰亡。因此，當(dāng)老葉的死亡速率大于新葉的生長(zhǎng)速率時(shí)，植株光合作用提供的 碳水化合物不能滿足新葉的要求，導(dǎo)致植株生長(zhǎng)率降低。鹽脅迫通過(guò)兩種不同的作 用方式影響植物生長(zhǎng)：第一，土壤中高濃度的鹽使得植株根系難以從土壤中吸取水 分。第二，植物體內(nèi)高濃度的鹽對(duì)植株產(chǎn)生離子毒害，根系外的鹽間接地影響細(xì)胞 生長(zhǎng)，以及相關(guān)的代謝(munns and tester 2008)。 1.1 鹽脅迫對(duì)大豆生長(zhǎng)發(fā)育的影響 大豆屬于中度耐鹽堿作物，鹽和堿的脅迫效應(yīng)主要表現(xiàn)在抑制大豆生長(zhǎng)(maas and hoffman 1977)。在大豆中，高濃度的鹽脅迫使種子發(fā)芽率，植株生物量，作物 產(chǎn)量大幅下降；根

31、、莖的生長(zhǎng)減緩，莖節(jié)數(shù)減少，根冠比提高和干物質(zhì)的積累下降， 甚至導(dǎo)致植株衰亡(abel and arnold 1964; parker et al. 1983; yang and blanchar 1993; panneerselvam et al. 1998; 羅慶云和於丙軍 2001; phang et al. 2008; 賀莉等 2011) 。 但也有研究表明：耐鹽性較強(qiáng)的品種(lee 68)在低鹽(50mm nacl)脅迫下，株高反而 有所提高(羅慶云和於丙軍 2001)。鹽脅迫還會(huì)降低植株根的滲透調(diào)節(jié)能力以及鈉離 子的外排和水分的吸收(an et al. 2001; joly 198

32、9) 。除此之外，鹽脅迫對(duì)大豆根瘤的 形成也有較大影響。有研究表明：鹽脅迫能顯著地降低根瘤數(shù)和根瘤干重(bernstein and ogata 1966; singleton and bohlool 1984)，致使根際間可利用的有效氧下降，刺激 植株無(wú)氧呼吸途徑(serraj et al. 1994)從而導(dǎo)致根瘤生長(zhǎng)受到抑制。鹽脅迫還能顯著的 增加大豆葉片中氯離子和鈉離子含量，而降低鉀、鈣、鎂的累積(abel 1969; an et al. 2001; essa 2002)。還有研究表明：鹽脅迫下大豆植株體內(nèi)的可溶性糖，溶性蛋白質(zhì)， 氨基酸，脯氨酸等有機(jī)小分子也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化(el-sam

33、ad and shaddad 1997)。 1.2 堿脅迫對(duì)大豆生長(zhǎng)發(fā)育的影響 植株受到堿脅迫的最顯著的變化是葉片黃萎和植株矮化。前人在水稻(yang et al. 1994)、小麥 (millar et al. 2007)和番茄(biatczyk et al. 1994)等作物中均有研究。也有 研究表明：堿脅迫通過(guò)降低植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，間接地影響植物生長(zhǎng)。高濃度 的碳酸氫鹽導(dǎo)致向日葵 (alcntara et al. 1988)、花生(zuo and zhang 2008)和玉米 (celik and vahap katkat 2008)出現(xiàn)鐵離子缺乏癥。 堿對(duì)大豆的影響主要體現(xiàn)在三個(gè)方

34、面：第一，高 ph 值；第二，高濃度的鈉離子 造成的滲透脅迫和離子毒害；第三，營(yíng)養(yǎng)缺乏癥(tuyen et al. 2010)。由高 ph 值引發(fā) 的大豆?fàn)I養(yǎng)缺乏已有較多報(bào)道(coulombe et al. 1984; hansen et al. 2003; norvell and adams 2006;rogovska et al. 2007; zocchi et al. 2007)。 2 大豆耐鹽、堿性鑒定及大豆種質(zhì)資源耐鹽、堿性評(píng)價(jià) 2.1 大豆耐鹽堿性鑒定 鹽、堿被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)限制大豆生產(chǎn)的主要因子。因此，鑒定、篩選耐鹽 堿的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源直接為生產(chǎn)利用或?yàn)橛N提供耐鹽、堿親本，對(duì)生

35、產(chǎn)或進(jìn)一步研 究大豆耐鹽性具有重要意義。 2.1.1 耐鹽堿的鑒定方法 大豆的耐鹽堿性鑒定的方法根據(jù)鑒定環(huán)境的不同主要分為田間鑒定和室內(nèi)鑒定。 2.1.1.1 田間鑒定 田間鑒定一般在海水倒灌區(qū)利用抽提地下咸水與淡水配比成不同濃度的鹽溶液 處理大豆植株，從而鑒定不同品種的耐鹽性。邵桂花等(1986)在海水倒灌區(qū)利用抽提 地下水與淡水配比作為處理液，1 行區(qū)，行長(zhǎng) 1-1.5m，每行播種 50 粒，每 20 行設(shè) 1 行對(duì)照，不設(shè)重復(fù)，在出苗期、苗期和花莢期，分別用電導(dǎo)率 10-15ds/m、15- 17ds/m 和 20-24ds/m 的處理液進(jìn)行大豆品種耐鹽性鑒定。馬淑時(shí)和王偉(1994)在

36、大豆 第三片復(fù)葉展開(kāi)時(shí)，利用濃度為 9.0，電導(dǎo)率為 10ds/m 的鹽堿水進(jìn)行處理，處理前 調(diào)查苗數(shù)，處理 5 天后調(diào)查癥狀，試驗(yàn)為雙行區(qū)，行長(zhǎng) 2 米行距 35 厘米每行 30 粒 種子，重復(fù) 3 次對(duì)照品種為吉林 20，以類似于邵桂花等(1986)的相對(duì)鹽害指數(shù)為指 標(biāo)鑒定大豆耐鹽性，并把品種耐鹽性分為高耐、耐、中耐、敏感和高敏 5 種類型。 田間鑒定更接近于實(shí)際大田生產(chǎn)的環(huán)境，但是實(shí)驗(yàn)條件難以控制，年份間差異可能 較大，需多年多點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行鑒定。 2.1.1.2 室內(nèi)鑒定 室內(nèi)鑒定一般在溫室或者在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行。羅慶云和於丙軍 (2001) 在玻璃 溫室中，將事先催芽48小時(shí)的大豆選取

37、胚根長(zhǎng)度一致的大豆芽轉(zhuǎn)入盛有厚度為10 cm 石英砂的塑料杯中，每一杯播種8粒，覆蓋0.5cm的石英砂，然后將其轉(zhuǎn)入液面高度 為5 cm的1/2 hoagland營(yíng)養(yǎng)液的周轉(zhuǎn)箱中，培養(yǎng)至兩葉一心后定苗，以含nacl濃度分 別為0、20、100和150 mm的1/2 hoagland營(yíng)養(yǎng)液分別進(jìn)行培養(yǎng)，14天后，以植株植株 衰亡葉面積占總?cè)~面積的百分率為指標(biāo)鑒定了6個(gè)栽培大豆品種的苗期耐鹽性。 valencia等(2008)在溫室分別用0、40、80、120和160 mm的nacl培養(yǎng)，鑒定了已知的 吸氯品種（williams、clark、hbkr4924和dare）和排氯品種(s-100、le

38、e 68和 hbkr5525)，并確定濃度為120 mm的nacl溶液是區(qū)分吸氯品種和排氯品種最佳濃度。 lee等(2008)將處于v2和v3（2-3片復(fù)葉）時(shí)期的大豆苗栽植于盛有沙土的塑料盆中用 100 mm的nacl溶液處理以葉面枯萎程度和葉氯含量為指標(biāo)鑒定了hutcheson (敏感)、 s-100和forest(耐鹽)等14個(gè)大豆品種。那桂秋等(2009)分別用110 mm的nacl和37.5 mm的na2co3溶液為處理液，分別進(jìn)行鹽、堿脅處理。對(duì)照用蒸餾水代替，在 251的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。在處理后的第7天測(cè)定發(fā)芽率，然后根據(jù)種 子發(fā)芽率計(jì)算鹽、堿害指數(shù)，然后進(jìn)行耐鹽堿性分

39、級(jí)。室內(nèi)鑒定具有時(shí)間短、容量 大、重復(fù)性強(qiáng)和環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)。 表1-1 大豆幼苗期耐鹽、堿性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（馬淑時(shí)和王偉 1994) table 1-1 the standars of salt and alkaline index on soybean seeding stage (ma and wang 1994) 級(jí)別 level 鹽堿害指數(shù) salt or alkaline injury index 耐鹽堿類型 salt or alkaline tolerance type 1020.00高耐 high tolerance（ht） 220.0140.00耐 tolerance（t） 340

40、.0160.00中耐 middle tolerance（mt） 460.0180.00敏感 sensitivity（s） 580.01100.00高敏 high sensitivity（hs） 2.1.2 大豆鹽害鑒定指標(biāo) 2.1.2.1 相對(duì)鹽害指數(shù)法 在大豆萌發(fā)期測(cè)定發(fā)芽率，將發(fā)芽率換算為相對(duì)鹽、堿害指數(shù)，是對(duì)照發(fā)芽率 與處理發(fā)芽率的差值占對(duì)照發(fā)芽率的百分比，然后依據(jù)鹽堿害指數(shù)將大豆品種分為 高耐、耐、中耐、敏感和高敏 5 種類型（表 1-1）(邵桂花等 1986; 馬淑時(shí)和王偉 1994;那桂秋等 2009)。 2.1.2.2 形態(tài)傷害評(píng)價(jià)法 通過(guò)測(cè)定鹽堿脅迫下大豆的生長(zhǎng)狀況以及形態(tài)表現(xiàn)

41、進(jìn)行耐鹽堿級(jí)別劃分。鹽害 調(diào)查方法有兩種：（1）單株分類記載法（表 1-2） ，通過(guò)計(jì)算鹽害指數(shù)評(píng)定耐鹽級(jí)別； （2）田間直接分級(jí)法：依據(jù)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)按品種鹽害癥狀在田間直接分級(jí)(邵桂花等 1986，1987；馬淑時(shí)和王偉 1994)。lee 等(2004)用 f2:5群體定位大豆耐鹽 qtl 時(shí)， 將鹽害級(jí)別劃分為 05 級(jí)(0：所有植株死亡；3：出現(xiàn)鹽斑；5：植株葉片正常綠色)。 pantalone 等(1997)和 an 等(2001)將大豆單株鹽害癥狀分為 5 級(jí)：1=正常(沒(méi)有明顯 鹽斑)，2=輕微鹽斑(25%的葉面積出現(xiàn)鹽斑)，3=中度鹽害(50%的葉面積出現(xiàn)鹽斑)， 4=嚴(yán)重失綠(7

42、5%的葉面積出現(xiàn)鹽斑)，5=死亡(植株變褐萎焉)，每個(gè)品種植株平均值 作為該品種的耐鹽級(jí)別。 2.1.2.3 綜合指數(shù)法 寇賀等（2007）通過(guò)測(cè)定大豆萌發(fā)期的發(fā)芽率和幼苗期各形態(tài)指標(biāo)并將發(fā)芽率 作為因變量進(jìn)行通經(jīng)分析，建立了大豆耐鹽性鑒定的綜合指標(biāo)體系。 2.1.2.4 測(cè)定鈉離子、氯離子濃度法 通過(guò)測(cè)定地上部分或根部各組織的離子濃度鑒定大豆品種的方法(羅慶云和於丙 軍 2001; lee et al. 2008; valencia et al. 2008; 劉光宇等 2011)。 單株分類記載法： 表 1-2 大豆幼苗期單株鹽害癥狀分類標(biāo)準(zhǔn)（邵桂花等 1986） table 1-2 the

43、 standard of classification of salt damage on soybean seeding stage（shao et.al. 1986） 鹽害級(jí)別 （level） 鹽害癥狀 salt stress symptoms in individual plant 0植株生長(zhǎng)正常，葉片率，無(wú)鹽害癥狀 1植株生長(zhǎng)正常，受害葉面積10%或有 4 片綠葉 2植株生長(zhǎng)基本正常，受害葉面積 25%或有 3 片綠葉 3植株生長(zhǎng)受抑制，受害葉面積 50%或有 2 片綠葉 4植株生長(zhǎng)嚴(yán)重受抑制，受害葉面積 75%或有 1 片綠葉 5植株死亡或僅有心葉存活，受害葉面積 75%以上 注：綠

44、葉是指完全展開(kāi)葉，且有一半葉片未受害 出苗期以受害葉面積為標(biāo)準(zhǔn)，苗期則以綠葉數(shù)為分類標(biāo)準(zhǔn)。 鹽害指數(shù)的計(jì)算： 鹽害指數(shù)（%）=分類記載的株數(shù)該級(jí)別數(shù)值乘積的總和100 調(diào)查株數(shù)5 2.2 大豆種質(zhì)資源耐鹽堿性評(píng)價(jià) 邵桂花等（1986）在1983-1985年三年間通過(guò)萌芽期、苗期和花莢期的鑒定共鑒 定了4000多份大豆品種。其中分析統(tǒng)計(jì)了1716個(gè)耐鹽和比較耐鹽的品種，鑒定出在 不同生育階段耐鹽和比較耐鹽品種415個(gè)。其中，出苗期242個(gè)占14.1%，苗期和花莢 期各占5%左右分別為85和82個(gè)；篩選出文豐7號(hào)、晉豆33、鐵豐8號(hào)、單豆2號(hào)以及美 國(guó)大豆mansoy、morse和一些鹽敏感品種h

45、ark和union等。馬淑時(shí)和王偉 (1994)在 1986-1990年間，對(duì)1020份大豆品種進(jìn)行了耐鹽性鑒定，經(jīng)重復(fù)鑒定，篩選出芽期和 苗期耐鹽品種42份，高耐鹽品種11份，試驗(yàn)表明：大豆品種發(fā)芽期耐鹽堿性與苗期 耐鹽堿性無(wú)相關(guān)性。羅慶云和於丙軍(2001)在大豆苗期考察了nacl脅迫對(duì)大豆苗期生 長(zhǎng)狀況和發(fā)育進(jìn)程，以及大豆體內(nèi)的鉀離子，鈉離子，氯離子的分配情況表明：lee 68和南農(nóng)1138-2的耐鹽性較強(qiáng)，南農(nóng)88-31為中度耐鹽大豆品種蘇協(xié)1號(hào)和jackson的耐 鹽性較差，中子黃豆乙耐鹽性最弱。於丙軍和羅慶云(2001)在發(fā)芽期和苗期兩個(gè)階段 利用發(fā)芽指數(shù)、鹽害指數(shù)和耐鹽系數(shù)等指標(biāo)

46、鑒定出苗期耐鹽性較強(qiáng)的是n5461和lee 68，耐鹽性較弱的有n23232和n23674等。王聰?shù)?2009)在苗期以nacl致死濃度為評(píng) 價(jià)指標(biāo)，從15個(gè)菜用大豆品種中篩選出2個(gè)耐鹽品種（綠領(lǐng)特早和天峰） ，2個(gè)眼敏感 品種（理想高產(chǎn)95-1和綠領(lǐng)3號(hào)） 。那桂秋等(2009)分別用不同濃度的鹽和堿處理以鹽 害指數(shù)為指標(biāo)鑒定了100份大豆品種，篩選出高耐鹽品種5個(gè)，耐鹽品種21個(gè)，中度 耐鹽品種41個(gè)，敏感品種22個(gè)，高度敏感品種11個(gè)；高耐堿品種7個(gè)，耐堿品種16個(gè)， 中度耐堿品種24個(gè)，敏感品種37個(gè)，高度敏感品種16個(gè)，且同一品中耐鹽堿趨勢(shì)基 本一致。劉光宇等(2011)通過(guò)大豆葉片

47、鹽害癥狀分級(jí)鑒定出耐鹽大豆品種科豐14號(hào)、 文豐7號(hào)、冀豆12、豫豆18和avery等品種。 3 大豆耐鹽性遺傳、qtl 定位和耐鹽機(jī)理研究進(jìn)展 3.1 經(jīng)典遺傳學(xué)研究 植物耐鹽堿性的遺傳機(jī)制比較復(fù)雜。abel（1969）研究認(rèn)為單一顯性基因控制 大豆品種 lee 的耐鹽性。邵桂花等(1994)的研究也表明：大豆的耐鹽性受一對(duì)基因控 制，且耐鹽為顯性，鹽敏感為隱性，正反交組合表現(xiàn)完全一致，表明屬核基因控制， 不存在母本或細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。但是，也有研究表明植物的耐鹽、堿性受多基因控制。 在擬南芥(katori et al. 2010)、番茄(foolad et al. 1997)、水稻(wang e

48、t al. 2011)和大豆 (chen et al. 2008)的耐鹽性均受多基因控制。 3.1.1 單基因控制 在大豆中，abel 在 1969 年首先研究了大豆耐鹽性的遺傳機(jī)理，分別以吸氯品種 (jackson、n53-505 和 b54-842)與排氯品種（lee 和 n53-509) 雜交，通過(guò)親本及其后 代群體鑒定耐鹽性。研究結(jié)果表明：cl-積累能力相似的親本間雜交衍生的 f2、f3代 家系表現(xiàn)與親本的耐鹽性表現(xiàn)一致。在 cl-積累能力不同的親本間的 8 個(gè)雜交組合中， f2代排氯和吸氯的分離比為 3:1，f2代的排氯植株的分離比為 1:2，吸氯植株沒(méi)有分 離。無(wú)論輪回親本是排氯品

49、種還是吸氯品種，f1代回交排氯和吸氯的分離比為 1:1， 說(shuō)明大豆耐鹽性受單個(gè)顯性基因控制。其中基因 ncl 控制排氯，ncl 控制吸氯。邵桂 花等（1994）也通過(guò)耐鹽性品種和鹽敏感品種雜交研究了大豆耐鹽性。在鹽堿地結(jié) 合澆灌鹽水和淡水配比為 1:1 的混合液，鑒定了 1716 份中國(guó)大豆和 260 份美國(guó)大豆。 結(jié)果表明：當(dāng)雙親是耐鹽品種時(shí)，f1、f2和 f3表現(xiàn)為耐鹽。當(dāng)雙親是鹽敏感品種時(shí)， f1、f2和 f3表現(xiàn)為鹽敏感。當(dāng)耐鹽品種與鹽敏感品種雜交時(shí)，f1表現(xiàn)為耐鹽。f2代 耐鹽與鹽敏感的分離比為 3：1。大豆的耐鹽性受一對(duì)基因控制，且耐鹽為顯性，鹽 敏感為隱性，正反交組合表現(xiàn)完全一致

50、，表明屬核基因控制，不存在母本或細(xì)胞質(zhì) 效應(yīng)，研究結(jié)果與 abel 在 1969 年的結(jié)論相似。 在野生大豆中，lee等(2009)以耐鹽品系pi483463和s-100以及鹽敏感品種 hutcheson分別雜交，親本和其衍生的后裔群體用100mm的nacl溶液處理評(píng)估耐鹽性。 在pi483463與hutcheson雜交衍生的f2后代中，耐鹽與鹽敏感的分離比為3:1，f 2:3 家 系耐鹽和鹽敏感的分離比為1:2:1。用pi483463與s-100雜交衍生的f2代耐鹽和鹽敏感 的分離比為15：1，這說(shuō)明兩個(gè)不同種質(zhì)資源的攜帶的耐鹽基因不同。他們認(rèn)為 pi483463受單一顯性基因控制耐鹽性，這

51、與s-100中攜帶的耐鹽基因不同。這說(shuō)明 ncl2是一個(gè)新的耐鹽性等位基因。 3.1.2 多基因控制 隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)大豆耐鹽堿性受多基因控制。羅慶云等 （2004）以栽培大豆南農(nóng)1138-2(耐鹽)和南農(nóng)88-31(較耐鹽)分別與jackson(鹽敏感) 2 套雜交組合，通過(guò)pl、p2、fl、f2和f2：3苗期植株耐鹽性調(diào)查，利用主基因+多基因混 合遺傳模型聯(lián)合分離分析了栽培大豆耐鹽性的遺傳規(guī)律。結(jié)果表明：南農(nóng)88- 31jackson和南農(nóng)1138-2南農(nóng)88-31耐鹽性遺傳均符合加性-顯性-上位性多基因遺 傳模式，在高世代選擇耐鹽性植株的效率較高，從f2:3估計(jì)南農(nóng)88-31

52、jackson組合 的nac1耐性微效基因遺傳率為82.13%；南農(nóng)1138-2南農(nóng)88-31組合的耐鹽性微效基 因遺傳率為67.47%。chen et al. (2008)也發(fā)現(xiàn)大豆耐鹽性受主效qtl和微效qtl共同 作用。 3.2 大豆耐鹽堿 qtl 定位的研究進(jìn)展 目前已有很多關(guān)于植物耐鹽性基因克隆的報(bào)道(munns 2005)。這些基因在調(diào)節(jié)植 物耐鹽性生理的過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。在擬南芥中，quesada (2002)以 102 個(gè)野生 品種和 ler-0 和 col-4 雜交衍生的 100 個(gè) f8 個(gè)體組成的 ril 群體分析了擬南芥的耐 鹽性。他們檢測(cè)到了 6 個(gè)萌發(fā)期耐鹽的

53、qtls 以及 5 個(gè)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期耐鹽的 qtls，并 分析了與 qtl 相關(guān)的候選基因。clerkx 等(2004)用 landsberg erecta (ler) shakdara (sha)衍生的 114 個(gè) f9 個(gè)體組成的 ril 群體定位了一個(gè)位于 5 號(hào)染色體上的萌發(fā)期耐 鹽的 qtl，該 qtl 解釋了 49.4%的表型變異。derose-wilson and gaut (2011)在擬南 芥萌芽期和幼苗期結(jié)合 qtl 作圖、關(guān)聯(lián)作圖和表達(dá)譜數(shù)據(jù)定位了耐鹽相關(guān)的基因組 區(qū)域，并分析了可能的候選基因。目前，很多調(diào)控?cái)M南芥耐鹽性的基因也被成功克 隆。ren 等(2010)利用自然變異

54、的擬南芥品種定位了一個(gè)萌發(fā)期和幼苗期耐鹽并且對(duì) 脫落酸（aba）敏感的 qtl，該 qtl 與擬南芥根長(zhǎng)（root length）和綠苗率 （percentage of green seedlings）相關(guān)。用 landsberg erecta (ler; 鹽、aba 敏感) shakdara (sha; 耐鹽、aba)衍生的重組自交群體進(jìn)行 qtl 作圖并克隆了主效 qtl- ras1（response to aba and salt 1） 。同時(shí)還分析了 ras1 的作用模式：ras1 通過(guò) 提高擬南芥對(duì) aba 萌發(fā)期和幼苗期敏感性提高其耐鹽性。sos（salt overly sensi

55、tive）是鹽脅迫下調(diào)節(jié)離子平衡的主要途徑，sos2 控制著 sos1 (atnhx7)介導(dǎo) 鈉離子從細(xì)胞質(zhì)的外排和液泡的 na+ /h+反轉(zhuǎn)運(yùn)子介導(dǎo)的將 na+截留到液泡中(shi et al. 2000; qiu et al. 2004)。擬南芥中 athkt1 的作用是調(diào)節(jié)鈉離子和鉀離子平衡 (berthomieu et al. 2003)。在水稻中，wang 等(2011)發(fā)現(xiàn)了 16 個(gè)控制水稻種子發(fā)芽期 的耐鹽性 qtls，每一個(gè) qtl 解釋了 4.643.7%的表型變異。lin 等(2004)報(bào)道了兩 個(gè)效應(yīng)較大的主效 qtls：qsnc-7 是控制水稻莖稈鈉離子濃度的 qtl

56、，qskc-1 是控 制水稻莖稈部鉀離子濃度的 qtl，這兩個(gè) qtl 分別解釋了 48.5%和 40.1% 的總變異。 ren 等(2005)成功克隆了一個(gè)水稻耐鹽 qtl-skc1。skc1 編碼了一個(gè) hkt 類型的選 擇性向木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)（卸載）na+的轉(zhuǎn)運(yùn)子。huang 等(2009)克隆了一個(gè)負(fù)向調(diào)節(jié)水稻 氣孔關(guān)閉的基因dst（drought and salt tolerance） 。該基因缺失導(dǎo)致水稻氣孔關(guān)閉， 氣孔密度下降，以增強(qiáng)耐旱耐、耐鹽性。thomson 等(2010)以 ir29 和 pokkail 衍生的 140 個(gè)重組自交系（ril）定位了一個(gè)位于 1 號(hào)染色體的水稻苗

57、期耐鹽的 qtl，主要 調(diào)節(jié)莖部 na+/k+離子平衡。 3.2.1 大豆耐鹽性 qtl 定位研究進(jìn)展 目前也有較多關(guān)于大豆耐鹽堿遺傳研究的報(bào)道，但是研究還相對(duì)比較薄弱。lee 等（2004）年首先以鹽敏感品種 s-100 和耐鹽品種 tokyo 雜交，同時(shí)利用鹽漬土和 溫室盆栽方法對(duì) f2:5群體的耐鹽性進(jìn)行鑒定，通過(guò)多重回歸分析，發(fā)現(xiàn)位于 n 連鎖 群上分子標(biāo)記 sat_091 與耐鹽性緊密關(guān)聯(lián)。利用 mapmanager 軟件將該基因定位于 satt237 和 sat_091 之間，區(qū)間大小 3.6 cm。該 qtl 在大田、溫室和聯(lián)合環(huán)境中分別 解釋了 41、60和 79遺傳變異。ch

58、en 等(2008)以科豐 1 號(hào)（耐鹽，salt tolerant）與南農(nóng) 1138-2（鹽敏感，salt sensitive）雜交衍生的 184 個(gè) f7:11家系組成的 重組自交系作為作圖群體，用 winqtlcart 軟件檢測(cè)到了 8 個(gè)大豆耐鹽 qtls，其中 一個(gè)主效 qtl 在大田和溫室環(huán)境中均被檢測(cè)到，該主效 qtl 位于 g 連鎖群的 sat_164 和 sat_358 標(biāo)記之間。hamwieh 和 xu (2008)以鹽敏感的栽培大豆 jackson 與 耐鹽的野生大豆 jws156-1 雜交衍生的 f2群體（n=225），發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位于 n 連鎖群 的耐鹽性主效 qtl，

59、位于 satt339 與 satt237 之間，該 qtl 具有較強(qiáng)的顯性效應(yīng)，解 釋了 68.7%耐鹽性的表型變異。他們認(rèn)為耐鹽性 qtl 對(duì)鹽敏感具有顯性作用，耐鹽 qtl 在野生和栽培大豆中都是保守的。hamwieh 等(2011)利用 ft-abyara9c01 和晉 豆 no.690197 雜交衍生的兩個(gè)重組自交系群體（ril）群體發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位于 n 連鎖群 上的 qtl，位于標(biāo)記 sat_091 與 sat_304 之間，該 qtl 在兩個(gè)群體中分別解釋了 44.0 和 47.1%的大豆耐鹽性的總變異。lee 等(2009) 報(bào)道了野生大豆 pi483463 有一 個(gè)不同于栽培大豆

60、 s-100 的顯性基因控制大豆耐鹽性。xu 和 tuyen（未發(fā)表）以栽 培大豆 jackson 與野生耐鹽大豆 jws061-1 雜交衍生的 117 個(gè) f6代 ril 的群體用于耐 鹽性 qtl 定位，研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)耐鹽的主效 qtl，該 qtl 解釋了 31.5%的耐鹽性 的表型變異，位于 n 連鎖群的標(biāo)記 sat_091 與 satt339 之間。該結(jié)果證明了在野生大 豆和栽培大豆之間耐鹽性基因的保守性。陳華濤等(2011)利用科豐 1 號(hào)和南農(nóng) 1138-2 為親本構(gòu)建的重組自交系群體進(jìn)行大豆苗期耐鹽性的遺傳及 qtl 定位分析。研究以 每個(gè)家系的平均存活時(shí)間為耐鹽指標(biāo)，采用主基因