實驗四血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳PPT課件

1、2021年4月30日星期五1 cellulose acetate membrane electrophoresiscellulose acetate membrane electrophoresis 實驗四實驗四 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳 2021年4月30日星期五2 【實驗?zāi)康膶嶒災(zāi)康摹?F 掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理掌握電泳法分離血清蛋白質(zhì)的原理 F 掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義掌握血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳的操作方法及臨床意義 2021年4月30日星期五3 電泳：電泳：帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象帶電粒子在電場的作

2、用下，向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象 電泳技術(shù)電泳技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術(shù)：利用電泳現(xiàn)象對混合物進行分離分析的技術(shù) 【實驗原理實驗原理】 2021年4月30日星期五4 Pr C O O - N H 2 Pr C O O - N H 3 + Pr C O O H N H 3 + H OH H OH pHpI pH=pI pH 纖維狀分子纖維狀分子 Q Q越多，越多，u u越大；越大； 分子小，分子小，r r越小，越小，u u越大；越大； 2021年4月30日星期五7 2.2.緩沖溶液：緩沖溶液： pHpH值：值：(pH-pI)(pH-pI)越大，越大，Q Q越多，越多，u

3、u越大越大 離子強度離子強度(I)(I)： I I越大，電動電勢越小，越大，電動電勢越小，u u越??；越??； I I越小，電動電勢越大，越小，電動電勢越大，u u越大，越大， 但樣品易擴散。但樣品易擴散。 離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持離子強度如果過低，緩沖液的緩沖容量小，不易維持pHpH恒定恒定 選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在選擇離子強度時要兩者兼顧，一般離子強度的選擇范圍在0.020.020.20.2之間。之間。 VQ u= X6r 2021年4月30日星期五8 電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也稱電勢梯度。電場強度：電泳支持物上每厘米的電位降，也

4、稱電勢梯度。 3.3.電場強度電場強度(X)(X) X X越大，越大，u u越快。越快。 支持物越短，支持物越短， X X越大，越大， u u越快。越快。 電場強度越大或支持物越短，電場強度越大或支持物越短，電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。電流將隨之增加，產(chǎn)熱也增加，影響分離效果。 在進行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變在進行高壓電泳的時候必須用冷卻裝置，否則可引起蛋白質(zhì)等樣品發(fā)生熱變 性而無法分離性而無法分離 VQ u= X6r 2021年4月30日星期五9 4.4.支持介質(zhì)：支持介質(zhì)： 纖維薄膜纖維薄膜( (玻璃纖維薄膜，醋酸纖維薄膜玻璃纖維薄膜，醋酸

5、纖維薄膜) ) 凝膠凝膠( (瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖凝膠，聚丙烯酰胺凝膠) ) 2021年4月30日星期五10 負極 正極 表面帶負電荷 帶正電荷的水層攜帶粒子向負極移動 如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快；如果樣品原本是移向負極的，則泳動的速度加快； 如果樣品原本是如果樣品原本是移向正極的，則泳動的速度減慢。移向正極的，則泳動的速度減慢。 電滲作用電滲作用： 電滲：電滲：在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。在電場作用下液體對固體支持物相對移動的現(xiàn)象。 以紙電泳為例以紙電泳為例: 2021年4月30日星期五11 區(qū)帶電泳的分類區(qū)帶電泳的分類 （一）支持物物理性狀（一）

6、支持物物理性狀 1 1濾紙及其它纖維濾紙及其它纖維( (如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖如玻璃纖維、醋酸纖維、聚氯乙烯纖 維薄膜維薄膜) )電泳電泳 2 2粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳；粉末電泳：如纖維素粉、淀粉電泳； 3 3凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳；凝膠電泳：如瓊脂、瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠電泳； 4 4絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。絲線電泳：尼龍絲、人造絲電泳。 2021年4月30日星期五12 （二）支持物裝置形式：（二）支持物裝置形式： 1 1平板式電泳：支持物水平放置；平板式電泳：支持物水平放置； 2 2垂直板式電泳：聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳；垂直板式電泳：

7、聚丙烯酰胺凝膠可做成垂直板式電泳； 3 3垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳垂直柱式電泳：聚丙烯酰胺盤狀電泳 2021年4月30日星期五13 ( (三三)pH)pH連續(xù)性：連續(xù)性： 1 1連續(xù)連續(xù)pH pH 電泳：即整個電泳過程電泳：即整個電泳過程pH pH 保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳保持不變，如常用的紙電泳、醋酸纖維薄膜電泳 等。等。 2 2非連續(xù)非連續(xù)pH pH 電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的電泳：緩沖液和電泳支持物間有不同的pH pH 的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤的電泳，如聚丙烯酰胺凝膠盤 狀電脈，等電聚焦電泳等狀電脈，等電聚焦電泳等 2021年4月30日星期五14 F

8、醋酸纖維薄膜為支持物醋酸纖維薄膜為支持物 F pH=8.6pH=8.6的巴比妥緩沖液的巴比妥緩沖液 F 血清蛋白的血清蛋白的pIpI均小于均小于8.68.6 F 負電荷負電荷 F 電泳時向正極移動電泳時向正極移動 F 由于遷移率不同而被分離由于遷移率不同而被分離 2021年4月30日星期五15 2 2 1 1清蛋白清蛋白 F 分子越小，泳動速度越快分子越小，泳動速度越快 F 帶電量越多，泳動速度越快帶電量越多，泳動速度越快 2021年4月30日星期五16 膜條經(jīng)過氨基黑膜條經(jīng)過氨基黑10B10B染色后顯出清晰色帶。染色后顯出清晰色帶。 2.2.定性定性, ,定量定量 各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合

9、量基本成正比。各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比。 可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中?？蓪⒏魃珟Ъ糸_，分別溶于堿性溶液中。 用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分數(shù)。用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分數(shù)。 2021年4月30日星期五17 醋酸纖維薄膜醋酸纖維薄膜： 醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜 廣泛應(yīng)用醫(yī)學臨床各種生物分子的分離分析廣泛應(yīng)用醫(yī)學臨床各種生物分子的分離分析 血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白 脂蛋白、糖蛋白脂蛋白、糖蛋白 甲胎蛋白、類固醇及同工酶等甲胎蛋白、類固醇及同工酶等 2021年4月30日星期五18 優(yōu)點：優(yōu)點： 簡單快速簡單

10、快速 缺點缺點 分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，分辨率較低（聚丙烯酰胺凝膠電泳，PAGEPAGE） 不適于制備（薄膜厚度約不適于制備（薄膜厚度約1010100m100m，樣品用量很少），樣品用量很少） 2021年4月30日星期五19 【器材及試劑器材及試劑】 1 1、器材：、器材： 醋酸纖維薄膜（醋酸纖維薄膜（2 28cm8cm） 常壓電泳儀常壓電泳儀 竹鑷竹鑷 點樣器點樣器 人血清或雞血清人血清或雞血清 粗濾紙粗濾紙 2 2、試劑：、試劑： 巴比妥緩沖液巴比妥緩沖液 氨基黑氨基黑10B0.2510B0.25染色液染色液 漂洗液漂洗液 透明液透明液 2021年4月30日星期五20 操作操作 （

11、一）儀器與薄膜的準備（一）儀器與薄膜的準備 1 1、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇、醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇 2.2.電泳槽的準備電泳槽的準備 3 3、電極槽的平衡、電極槽的平衡 2021年4月30日星期五21 （二）點樣（二）點樣 取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上取出薄膜，無光澤面向上平放在濾紙上 點樣區(qū)距陰極端點樣區(qū)距陰極端1.5 cm1.5 cm 血清均勻涂在點樣器表面血清均勻涂在點樣器表面 將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，使血清完全滲透至薄膜內(nèi) 形成一定寬度、粗細均勻的直線形成一定寬度、粗細均勻的直線 實驗的關(guān)鍵實驗的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的

12、電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié) 2021年4月30日星期五22 （三）電泳（三）電泳 點樣端薄膜平貼點樣端薄膜平貼陰極陰極電泳槽支架濾紙橋電泳槽支架濾紙橋 ( (點樣面朝下點樣面朝下) ) 另一端平貼在另一端平貼在陽極陽極端支架端支架 要求：要求：薄膜薄膜緊貼緊貼濾紙橋并濾紙橋并繃直繃直，薄膜之間相隔幾毫米，薄膜之間相隔幾毫米 蓋電泳槽蓋，平衡蓋電泳槽蓋，平衡10min10min 打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度為打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流強度為0.3mA/0.3mA/片，通電片，通電10min10min 調(diào)節(jié)電流強度為調(diào)節(jié)電流強度為0.5mA/0.5mA/片，電泳片，電泳6

13、06090min90min 電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O O，關(guān)閉電泳儀切斷電源，關(guān)閉電泳儀切斷電源 2021年4月30日星期五23 DYY-5DYY-5型穩(wěn)壓型穩(wěn)壓 穩(wěn)流電泳儀穩(wěn)流電泳儀 DYY-DYY-型型 電泳槽電泳槽 2021年4月30日星期五24 2021年4月30日星期五25 2021年4月30日星期五26 【實驗注意事項實驗注意事項】 不要用手觸摸纖維素膜不要用手觸摸纖維素膜 注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面注意區(qū)分醋酸纖維素薄膜的光面和毛面 點樣位置要在點樣位置要在1.51.5厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近厘米以內(nèi)，不要距邊緣太近 不要重復(fù)點樣不要重復(fù)點樣 膜放進電泳

14、槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極膜放進電泳槽時，將點樣面向下，點樣端靠近陰極 2021年4月30日星期五27 用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少用點樣器點樣時不要點的太多，但也不能太少 線條均勻，用力水平。線條均勻，用力水平。 電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液電泳槽放膜條支架上盡量不要有緩沖液 2021年4月30日星期五28 （四）染色和漂洗（四）染色和漂洗 取出薄膜，直接浸入染色液中，染色取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5 min5 min 自來水沖洗，漂洗液漂洗自來水沖洗，漂洗液漂洗 更換更換3 3次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖譜次漂洗液，脫去顏色，得到色帶清晰的電泳圖

15、譜 2021年4月30日星期五29 【實驗結(jié)果實驗結(jié)果】 繪出電泳圖譜并標明各條帶含義繪出電泳圖譜并標明各條帶含義 2021年4月30日星期五30 2021年4月30日星期五31 臨床意義臨床意義 血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量血漿蛋白是血漿最主要的固體成分，含量606080g/L 80g/L 絕大部分由肝臟合成，僅絕大部分由肝臟合成，僅球蛋白由漿細胞合成球蛋白由漿細胞合成 正常值：正常值： 白蛋白白蛋白57577272 ，1 1球蛋白球蛋白2 25 5 2 2球蛋白球蛋白4 49 9，球蛋白球蛋白6.56.51212 球蛋白球蛋白12122020 2021年4月30日星期五32 可能相

16、關(guān)疾病可能相關(guān)疾病清蛋白清蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 骨髓瘤骨髓瘤* * 腎病綜合癥腎病綜合癥* * * 腎炎腎炎* * 肝硬化肝硬化* * 急性肝壞死急性肝壞死 * * 傳染性肝炎傳染性肝炎* * * 急性感染初期急性感染初期* * * * 慢性炎癥慢性炎癥/ /感染后期感染后期* * 低低 球蛋白血癥球蛋白血癥* * 臨床上還可用臨床上還可用A/GA/G比來表示清球蛋白的量的關(guān)系：比來表示清球蛋白的量的關(guān)系： 正常人正常人A/GA/G1.51.52.52.5 2021年4月30日星期五33 血漿蛋白的主要功能血漿蛋白的主要功能 維持血漿膠體滲透壓維持血

17、漿膠體滲透壓 調(diào)節(jié)血漿調(diào)節(jié)血漿pHpH值，維持酸堿平衡值，維持酸堿平衡 運輸營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等運輸營養(yǎng)物質(zhì)、代謝物、激素、藥物及金屬離子等 免疫作用免疫作用 2021年4月30日星期五34 白蛋白降低：白蛋白降低： 合成能力不足合成能力不足：肝功能下降：肝功能下降 合成原料不足合成原料不足：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期：饑餓，腹瀉，腫瘤晚期 去路增加：去路增加：腎病綜合癥，嚴重燒傷，大出血等腎病綜合癥，嚴重燒傷，大出血等 消耗過多：消耗過多：糖尿病，甲亢等糖尿病，甲亢等 2021年4月30日星期五35 球蛋白增加：球蛋白增加： 感染，多發(fā)性骨髓瘤，自身免疫性疾病等感染，多發(fā)性骨髓

18、瘤，自身免疫性疾病等 球蛋白降低：球蛋白降低： 皮質(zhì)功能亢進，免疫缺陷病皮質(zhì)功能亢進，免疫缺陷病 2021年4月30日星期五36 肝?。焊尾。?A ,A ,2 2-G ,- G ,-G ,- G ,1 1- G , - G- G , - G，A/GA/G下降甚至倒置下降甚至倒置 腎?。耗I病： 早期：早期：選擇性蛋白尿，選擇性蛋白尿，MwMw較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。如白蛋白較小蛋白質(zhì)丟失，含量下降。如白蛋白 后期：后期：非選擇性蛋白尿，非選擇性蛋白尿，MwMw較小的蛋白質(zhì)丟失，含量下降較小的蛋白質(zhì)丟失，含量下降 分子量較大的蛋白質(zhì)（如分子量較大的蛋白質(zhì)（如- - 球蛋白）丟失，含量下降球蛋白）

19、丟失，含量下降 2021年4月30日星期五37 【實驗思考實驗思考】 1 1電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？電泳時，點樣端置于電場的正極還是負極？為什么？ 2 2電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種電泳后，泳動在最前面的是何種蛋白質(zhì)？各譜帶為何種 成分？請分析原因成分？請分析原因 2021年4月30日星期五38 【常見問題及原因常見問題及原因】 1.1.電泳圖譜不齊：電泳圖譜不齊：點樣時血清滴加不均點樣時血清滴加不均 2.2.電泳圖譜出現(xiàn)條痕電泳圖譜出現(xiàn)條痕：點樣后薄膜過干，或電泳槽密閉性不：點樣后薄膜過干，或電泳槽密閉性不 良，或電流過大，造成水分蒸發(fā)薄膜干燥良，或

20、電流過大，造成水分蒸發(fā)薄膜干燥 3.3.分離不良：分離不良：標本滴加過多標本滴加過多 4.4.區(qū)帶過于緊密：區(qū)帶過于緊密：緩沖液離子強度大于緩沖液離子強度大于0.0750.075 2021年4月30日星期五39 5.5.區(qū)帶拖尾：區(qū)帶拖尾：緩沖液離子強度小于緩沖液離子強度小于0.050.05 6. 6. 染色后清蛋白中間色淺：染色后清蛋白中間色淺：染色時間不足，或清蛋白量過高染色時間不足，或清蛋白量過高 減少樣品用量或延長染色時間減少樣品用量或延長染色時間 2021年4月30日星期五40 膜條經(jīng)過氨基黑膜條經(jīng)過氨基黑10B10B染色后顯出清晰色帶。染色后顯出清晰色帶。 2.2.定性定性, ,定量定量 各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比。各色帶蛋白質(zhì)含量與染料結(jié)合量基本成正比。 可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中。可將各色帶剪開，分別溶于堿性溶液中。 用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分數(shù)。用分光光度法計算各種蛋白質(zhì)的百分數(shù)。 2021年4月30日星期五41 醋酸纖維薄膜醋酸纖維薄膜： 醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜醋酸纖維加工的細密且薄的微孔膜 廣泛應(yīng)用醫(yī)學臨床各種生物分子的分離分析廣泛應(yīng)用醫(yī)學臨床各種生物分子的分離分析 血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白 脂蛋白、糖蛋白脂蛋白、糖蛋白 甲胎蛋白、類固醇