層析填料CaptoMMC的使用說明

1、Capto MMC皇家藥院Captor MMC是一種耐鹽的多模式的生物處理媒介，在使用填充床色譜法從 大量的培養(yǎng)液中純化蛋白質(zhì)時(shí)可以作為捕獲介質(zhì)和中間純化介質(zhì)。Capto MMC在提高生產(chǎn)力的同時(shí)降低了生產(chǎn)成本： 在高電導(dǎo)率下具有很高的動(dòng)態(tài)載量；高容 量的吞吐量；新的選擇性；更小的操作單元。1生物處理媒介生物處理媒介因?yàn)樯a(chǎn)規(guī)模的色譜層析而得到發(fā)展。 所有的生物處理媒介均 經(jīng)驗(yàn)證方法進(jìn)行生產(chǎn)，并且經(jīng)過測(cè)試以滿足生產(chǎn)的需求。安全的訂購和交付模式 能夠?yàn)橐?guī)模生產(chǎn)需要的媒介提供可靠的供應(yīng)。法規(guī)支持文件 （RSF）可用來協(xié)助工 藝驗(yàn)證和提交給監(jiān)管機(jī)構(gòu)。生物處理媒介可以覆蓋從捕獲到精純的所有純化步驟。2

2、 Capto MMC的特性Capto MMC具有多種官能團(tuán)的配體，多種作用方式的官能團(tuán)使配體具有不 同于傳統(tǒng)離子交換劑的選擇性，且在高鹽條件下仍具有結(jié)合蛋白質(zhì)的活性。Capto MMC與大分子間存在多種作用方式，其中最顯著就是離子作用，氫 鍵和疏水作用。Capto MMC是為了提高介質(zhì)在捕獲和中間純化步驟中的速度和通量而設(shè) 計(jì)的。通過提高高鹽濃度下的容量和低反壓條件下的流速，而減短生產(chǎn)周期和提 供生產(chǎn)力。該媒介以高流速的瓊脂糖為基質(zhì)，典型的大規(guī)模柱子（直徑為1m,柱床高度為20cm）在頂板壓力低于3bar時(shí)流速為600cm/h或者更高。高交聯(lián)度的瓊脂糖基質(zhì)提供了很高的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。容量、洗

3、脫行為和壓力/流速等特性不受層析過程常用溶液的影響。Capto MMC 5ebicirQse 6 Fast FlawCapto MMC和瓊脂糖6快速的壓力-流速特性比較，工作條件Toble 1 Choracter istics of Capto Nl 卜1 匚.Matrixhighly cross-li nked agaroseFunctional groupmultimodcl week cation exchangerTotnl iomc ropanty0.07-0 09 mmol H7ml mediumParticle size*75 pm （dlFlow velocityct leas

4、t 600 cm/h Ino 1 m diurnyter column with 20 cm hEd heicht at 20 T using process buffers wrth the seme viscosity as water 口t 45 rrg GSA/ml medium at 30 mS/crnpH stability1short term2 - 1Along term2-12Working temDerature5M tc+30X匚 hemical stabilityol commonly used aqueous buffers, 1M acetic acid.1 M s

5、odium hydroxide1.8 M ureah b M guanidine hytirochlorideF and 70% ethanolftvaidoxidizing agents, calhnic detergents3方法設(shè)計(jì)和優(yōu)化設(shè)計(jì)和優(yōu)化生物大分子分離方法的目的是確定實(shí)驗(yàn)條件， 在盡可能短的時(shí)間 和盡可能高的產(chǎn)品回收率的條件下提高目的分子的最大吸附量。在結(jié)合蛋白時(shí)，Capto MMC的作用類似于弱陽離子交換劑。因?yàn)樵试S在高 電導(dǎo)率條件下吸附蛋白， 所以可能不需要為了提高填料的結(jié)合能力而去篩選最優(yōu) 化的加載電導(dǎo)率。然而加載電導(dǎo)率可能會(huì)影響吸附選擇性。Capto MMC 在高電導(dǎo)率

6、條件下對(duì)蛋白的有效捕獲的特性在許多情況下會(huì)限 制提高鹽濃度以洗脫蛋白質(zhì)的方法的使用。通?？梢酝ㄟ^聯(lián)合改變pH、緩沖液濃度和洗脫鹽而摸索到最優(yōu)的洗脫條件。 為了建立最優(yōu)的洗脫方案， 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是 一種研究多種參數(shù)對(duì)蛋白回收率的影響的有效方法， 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法的例子如應(yīng)用 說明 11-0035-48 所述，或者可以應(yīng)用最優(yōu)化的梯度洗脫方法。4 建議的純化方案使培養(yǎng)液的pH比目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)低個(gè)pH。需要根據(jù)具體的目標(biāo)分子確 定精確的 pH。使用與培養(yǎng)液相同 pH 的起始緩沖液平衡柱子；上樣；用起始緩沖液洗去未 結(jié)合的樣品；按照以下方式洗脫目標(biāo)蛋白：通過使用低于目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)、 、個(gè) pH 的緩沖液或者

7、使用 pH 梯度緩沖液篩選 最優(yōu)洗脫pH。如果需要可以將目標(biāo)蛋白開始洗脫的 pH作為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化。在步驟 1 確定的 pH 條件下，使用、的鹽溶液篩選洗脫的鹽濃度。 如果需要進(jìn)一步優(yōu)化，可以提高緩沖鹽的濃度，如從 50Mm250mM 。 如果目標(biāo)蛋白仍然以級(jí)分的不對(duì)稱峰洗脫，可以更換洗脫鹽，如NaCl 改為NH4CL。尿素和有機(jī)修飾劑等添加劑某些蛋白的回收率。5 通量的優(yōu)化優(yōu)化方案主要需要考慮產(chǎn)品回收率和吞吐量之間的關(guān)系。 使用實(shí)際給料過程 的前沿分析檢測(cè)對(duì)目標(biāo)蛋白的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力。 由于在樣本應(yīng)用程序中， 動(dòng)態(tài)結(jié)合 能力是流速的函數(shù)，突破能力必須通過各種不同的停留時(shí)間來定義（流速） ，以 顯示

8、最佳的吞吐量水平。6 放大在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的方法得到優(yōu)化之后，可以按比例進(jìn)行放大。根據(jù)載量的需要選擇柱床體積。選擇一個(gè)直徑合適的柱子使柱床高度能達(dá)到1045cm之間，為了充分利用CaptoMMC ，在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)我們建議柱床的高度為 20cm 或更高。 在進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)時(shí)，在增加柱子直徑和體積流量的同時(shí)通常都會(huì)保持柱床高度 和流速恒定。 然而，在優(yōu)化方案時(shí)會(huì)優(yōu)先選擇小的柱體積， 這是為了節(jié)省樣品和 緩沖液，如優(yōu)化動(dòng)態(tài)結(jié)合能力等參數(shù)時(shí)會(huì)選擇比最終高度更低的柱子高度。 只要 保留時(shí)間是恒定的， 目標(biāo)分子的結(jié)合能力就保持不變。 其它的因素如關(guān)鍵雜質(zhì)的 清洗會(huì)隨著柱床高度的改變而改變， 需要在最終柱床高度進(jìn)

9、行驗(yàn)證。 滯留時(shí)間近 似等于柱床高度與流速的比值。7 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模柱子的填裝以下是關(guān)于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模柱子的填裝的說明：10cm柱床高度的Tricorn 5/100,Tricorn 10/100, XK 16/20 ;40cm 的 XK 16/70。需要更詳細(xì)的了解 Tricorn 的填裝， 可以查看相關(guān)資料。填裝 Tricorn 5/100 and 10/100材料： Capto MMC ；玻璃過濾漏斗；塑料勺；過濾瓶；量筒； 20%乙醇媒介的量：所需的Capto MMC可以通過以下公式計(jì)算：柱子的橫截面積 （cm2） x 柱床高度（cm） X壓縮因子（媒介的沉降體積/填裝后媒介的體積）。壓縮因子近

10、似 等于。例如：柱床高度為10cm的Tricorn 5/100需要的沉降媒介體積為：x 10X =9ml 準(zhǔn)備懸浮液：懸浮液的體積等于沉降媒介體積除以懸浮液的濃度。填裝的時(shí)候， 懸浮液的濃度應(yīng)該達(dá)到 60%。平衡所有的物料至室溫， 將玻璃過濾漏斗安裝到過 濾瓶上。將填料傾倒至漏斗并用20%乙醇洗滌（每1ml填料使用6ml的20%乙醇）。 將沉降的填料轉(zhuǎn)移至燒杯加入適量的 20%的乙醇。為了最終得到一個(gè)準(zhǔn)確的柱床 高度，懸浮液過夜靜置或 3000rpm 離心 3min 后，使用量筒進(jìn)行測(cè)量，度數(shù)前應(yīng) 等待5min。也可以先使用過量的填料裝住然后再移去多余的填料。填裝步驟1.8 裝柱效果的評(píng)價(jià)通過

11、測(cè)定柱效來檢查裝柱的質(zhì)量。在裝柱和柱子的工作壽命之間應(yīng)定期測(cè)定 柱效，特別是柱子的分離性能降低的時(shí)候。 柱子效果的最好的表達(dá)方式是在同等 高度條件下的理論塔板（HEPT）和非對(duì)稱因子（As）,使用1%的丙酮溶液作為 樣品，可以很容易的檢測(cè)出以上兩者的值。氯化鈉也可以作為檢測(cè)物質(zhì)，使用 2M、的氯化鈉水溶液作為洗脫液。注解：計(jì)算出來的塔板數(shù)會(huì)隨著檢測(cè)條件的 變化而變化， 它只能作為一個(gè)參考值。 保持測(cè)試條件和設(shè)備的穩(wěn)定對(duì)于結(jié)果的可 比性是非常重要的。溶質(zhì)、溶劑、洗脫液、上樣體積、流速、 液體通路 、溫度等 的變化都會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。為了達(dá)到最佳的效果，上樣體積應(yīng)為柱床最大體積的 %，流速應(yīng)為 1

12、530cm/h。 如果定義一個(gè)與柱效相關(guān)的驗(yàn)收極限， 柱子的理論塔板數(shù)可以作為柱子使用的驗(yàn) 收標(biāo)準(zhǔn)。理論塔板（HETP）和不對(duì)稱因子（As）的測(cè)量方法：HETP=L/N N=X （VR/Wh）2L 為柱床高度（ cm）N 為理論塔板數(shù)VR 為從進(jìn)樣開始至峰最高值的洗脫體積Wh 為 1/2 最高峰處的峰寬 折合板高常作為柱效比較的參數(shù)?？赏ㄟ^以下公式計(jì)算： HETP/d d為填料的粒徑，指導(dǎo)性原則：3通常都可以接受。吸收峰應(yīng)該是對(duì)稱，不對(duì)稱因子應(yīng)盡可能接近與 1 （08之間均可以接受） 。 峰形的改變常常是柱床發(fā)生改變的第一個(gè)跡象。不對(duì)稱因子的計(jì)算方法： A S=b/aa為10%峰高處的半峰寬（

13、前）b為10%峰高處的半峰寬（后）。以丙酮為標(biāo)志物，通過紫外檢測(cè)的計(jì)算 HETP和As的經(jīng)典方法，如下圖所示Fig* 3. A typical test chromatogrom showing the parameters used for HETP and As calculations.9保養(yǎng)為了能使Capto MMC在工作壽命期間保持最好的分離效果，按以下步驟進(jìn) 行保養(yǎng)。平衡在裝柱之后或進(jìn)行層析操作之前，使用至少5個(gè)柱床體積的起始緩沖液沖洗， 或者直到流穿的電導(dǎo)和pH值保持不變。再生每次分離后，用高離子強(qiáng)度的溶液洗脫可逆性的結(jié)合物（例如 2M NaCL的 緩沖液），此外將pH調(diào)至101

14、1。使用至少5個(gè)柱床體積的起始緩沖液沖洗，或 者直到流穿的電導(dǎo)和pH值保持不變。原位清洗原位清洗是指除去柱子再生之后仍殘留的脂肪、內(nèi)毒素、沉淀或變性蛋白質(zhì) 等污漬。在用粗料液上樣的時(shí)候常會(huì)帶來這樣的雜質(zhì)。定期的原位清洗能夠防止污漬在柱床的堆積，還可以保持 Capto MMC的載量、流速和常規(guī)性能。應(yīng)根據(jù)污漬類型的不同設(shè)置特定的原位清洗步驟。原位清洗的頻率取決于環(huán)境和料液的情況，但是對(duì)于捕獲來說，建議每次循環(huán)后都進(jìn)行一次原位清洗。CIP protocolsPrecipitated, hydrophobically bound Wosh with 1 M NaOH at 40 匚m/h with

15、proteins or lipoproteinsreversed flow direction. Contact time1-2 hours, dependent on feed.Ionically bound proteinsWash with 05-2 column volumes of 2M NoCi with reversed flowdirection. Contact tirr&lO-lS min.Lipids ond very hydrophobic proteins Wash with 2-4 column volumes of up to 70% ethanol* or 30% iso-propanol with reversed flow direction. Contact time 1-2 hours, dependent on feed.Alter仃口lively, wash with 2-4 column volumes of 0.1% non-ionic detergent with reversed flow direction. Contact tirriE 1-2 hours, dependent on feed* Spec it c regulations may ap