Loading Buffer煮細(xì)胞抽提總蛋白Protocol mRNA的分離純化

1、 Loading Buffer煮細(xì)胞抽提總蛋白Protocol 6的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（2000rpm5min） 1.細(xì)胞計(jì)數(shù)（約110； 2. 預(yù)冷1PBS 500ul重懸洗一次，轉(zhuǎn)至500ul EP管（2000rpm5min）； 3. 去上清，后甩一次，將上清去盡； 6的細(xì)胞加50ul loading buffer 加入210loading； 4. 按每15. Vortex一下，煮1015min一次23次直至無(wú)粘絲； 6. 每次煮好將其放于冰上，靜置約2min，Vortex一下，再甩一下； 7. 三次后用槍吸起，如沒(méi)有粘絲，即可； 8. 每次上樣約5ul（50ug/ul蛋白） RIPA裂

2、解抽提總蛋白Protocol 7的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（2000rpm5min）； 1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1102. 預(yù)冷1PBS 1ml重懸洗2次，轉(zhuǎn)至1.5ml EP管（2000rpm5min）； 3. 去上清，后甩一次，將上清去盡； 4. 按照如下比例加入裂解試劑： 7細(xì)胞 300ul/110 ： RIPA PMSF ： 3ul(1:100) Cocktail ： 0.3ul(1:1000) 5. 吹打均勻，冰上放置30-40min，中間每10分鐘Vortex一次； 6. 4預(yù)冷離心：10000rpm 10min； 7. 收集上清，轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷新EP管，即為總蛋白。 【為了濃縮蛋白，加RIP

3、A的量改為200ul或者更低，可稍微延長(zhǎng)冰上裂解時(shí)間，而RIPA（1）PMSF（1：100）Cocktail（1：1000）的比例不變 】 核，漿蛋白抽提Protocol 一. 收核-漿蛋白 收漿蛋白 7的細(xì)胞），離心收集細(xì)胞（1100rpm5min10）1. ； 細(xì)胞計(jì)數(shù)（約1.5用4預(yù)冷的PBS重懸，轉(zhuǎn)至1.5mL2. 的EP管中，離心（4000rpm5min，4）； 7 cell，重懸，4放置10min，3. 離心（加入A Buffer 1mL/1102500rpm去上清，3min，4）； 7 cell4. ，重懸，4放置3min，離心加入A Buffer 250uL/1.510（500

4、0rpm去上清，1min，4），吸取上清（上清是漿蛋白）； 收核蛋白 再用A Buffer 500uL/1.5107 cell，重懸，4放置3min，離心（5000rpm5. ，把上清完全吸干凈；，吸走上清，12000rpm30sec1min，4）6. 放置40min（每RAPI)50uL，重懸（振蕩），4剩余沉淀中加入B Buffer (或者 振蕩一次）；隔10min7. ，取上清即為核蛋白，80保存。 ）離心（1200010min，4 Buffer A的配制： 終濃度 母液 配40Ml (10ml)溶液所需的量 Hepes PH 7.9 10mM 1M 400uL (100 ul) MgC

5、l2 1.5mM 2M 30uL (7.5 ul) KCl 10mM 250mM 1.6mL (400 ul) DTT 0.5mM 0.1M 200uL (50 ul) ! O補(bǔ)足至要求體積ddH剩余體積用2 的配制：Buffer ABuffer A(2ml) = 1960ul Buffer A + 40uL 10%NP-40 + 20uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin Buffer A(1ml) = 980ul Buffer A + 20uL 10%NP-40 + 10uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin （Aprotinin可以用cockt

6、ail代替,而且只要核蛋白的時(shí)候可以不加） Buffer B 的配制： 終濃度 母液 配40mL(10ml)溶液所需的量 Hepes PH 7.9 20mM 1M 800uL (200 uL) 甘油 25% 5020mL (5 mL) NaCl 0.42M 3M 5.6mL ( 1.4 mL) EDTA 0.2mM 0.5M 16uL ( 4 uL) DTT 0.5mM 0.1M 200uL ( 50 uL) NP-40 0.2% 10800uL ( 200 uL) ! 補(bǔ)足至要求體積ddHO剩余體積用2 的配制：Buffer B) 代替cockltail可以用 = 1mL Buffer B

7、+ 10uL 10mg/mLPMSF + 0.5uL Aprotinin(Buffer B 核基質(zhì)蛋白抽提Protocol 7的細(xì)胞），離心（1100rpm5min細(xì)胞計(jì)數(shù)（約110）收集細(xì)胞； 、1 2、 用4預(yù)冷的PBS重懸，將細(xì)胞移至1.5ml EP管中，1PBS洗一遍； 7的細(xì)胞，裂解細(xì)胞，至冰上15-30min； 300ul RIPA/110加3、 RIPAPMSF（1：100）Cocktail（1：1000） 4、 4預(yù)冷離心：13000rpm 10-15min； 5、 將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的已4預(yù)冷的1.5ml EP管，冰上備用(總蛋白)； 6、 用PBS洗管底的pellet2

8、遍； 7、 加入U(xiǎn)rea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets，vortex 10min； 8、 4預(yù)冷離心：13000rpm 10min；用BufferA 90ul稀釋，此為核基質(zhì)蛋白。 RIPA（PH 8.0）： 150mM NaCL 1% NP-40 0.5% DOC 0.1% SDS 50mM Tris Urea-Lysis buffer（PH 8.0）： 100mM NaH2PO4 10mM Tris-HCL 300mM NaCL 8M urea Buffer A： 100mM NaH2PO4 10mM Tris-HCL 300mM NaCL 1% Triton

9、 X-100 cytoplasmic cell fractions were prepared by incubating the cells in icecold Iso-Hi buffer 140 mM NaCl 25 mM Tris pH 7.4 1.5 mM MgCl2) 0.5% Nonidet P-40 for 5 min and then subjecting them to low-speed centrifugation to collect the nuclei. Nuclei were incubated in high-salt extraction buffer 20

10、 mM HEPES (pH 7.9) 25% (v/v) glycerol 0.5 MNaCl 1.5 mM MgCl2 0.2 mM EDTA 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 0.5 mM DTT; for 1 h at 4C. The DNA-particulate fraction was pelleted by microcentrifugation (15,000 rpm), washed once in high-salt buffer, solubilized in radioimmunoprecipitation assa

11、y buffer(RIPA), and sonicated to sheer the DNA. Equal amounts of all fractions were precipitated with trichloroacetic sulfate dodecyl sodium a on separated and buffer, sample protein in resuspended acid, (SDS)10% polyacrylamide gel. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble

12、 extract from isolated (nuclear extraction) buffer A : 10 mM HEPES (pH 7.9 at 4C) 1.5 mM MgCl2 10 mM KC1 0.5 mM DTT; buffer B 0.3 M HEPES (pH 7.9) 1.4 M KC1 0.03 M MgCl2; buffer C 20 mM HEPES (pH 7.9) 25% (v/v) glycerol 0.42 MNaCl 1.5 mM MgCl2 0.2 mM EDTA 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)

13、0.5 mM DTT; buffer D 20 mM HEPES (pH 7.9) 20% (v/v) glycerol, 0.1M KCl, 0.2 mM EDTA 0.5 mM PMSF 0.5 mM DTT DTT and PMSF were added fresh to the buffers just before use. 1，Pelleted cells were then suspended in five volumes of 4C phosphate buffered saline and collected by centrifugation as detailed ab

14、ove; subsequent steps were performed at 4C. 2，The cells were suspended in five packed cell pellet volumes of buffer A and allowed to stand for 10 min. 3，The cells were collected by centrifugation as before and suspended in two packed cell pellet volumes (volume prior to the initial wash with buffer

15、A) of buffer A and lysed by 10 strokes of a Kontes all glass Dounce homogenizer (B type pestle). The homogenate was checked microscopically for cell lysis and centrifuged for 10 min at 2000 rpm in a Sorvall HG4L rotor to pellet nuclei. The pellet obtained from the low speed centrifugation of the hom

16、ogenate was subjected to a second centrifugation for 20 min at 25,000 ga (Sorvall SS34 rotor), to remove residual cytoplasmic material an d this pellet was designated as crude nuclei. These crude nuclei were resuspended in 3 ml of buffer C per 109 cells with a Kontes all glass Dounce homogenizer (10

17、 strokes with a type B pestle). The resulting suspension was stirred gently with a magnetic stirring bar for 30 min and then centrifuged for 30 min at 25,000 g (Sorval SS34 rotor). The resulting clear supernatant was dialyzed against 50 volumes of buffer D for five hours. The dialysate was centrifug

18、ed at 25,000 g (Sorvall SS34 rotor) for 20 min and the resulting precipitate discarded. The supernatant, designated the nuclear extract, was frozen as aliquots in liquid nitrogen and stored at -80. The protein concentration was usually 6 to 8 mg per ml and 15 to 20 mg of protein were obtained from 1

19、09 cells. mRNA的分離純化 【實(shí)驗(yàn)原理】分子是單順?lè)醋?，是編碼蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。真核生物的所有蛋白真核生物的mRNA的分離純化是克隆基因、提高的翻譯產(chǎn)物，因此，高質(zhì)量mRNA質(zhì)歸根到底都是mRNA1x10-5g RNAcDNA文庫(kù)構(gòu)建效率的決定性因素。哺乳動(dòng)物平均每個(gè)細(xì)胞含有約，理論上認(rèn)為每克細(xì)胞可分離出510mg RNA。其中 rRNA為75 85，tRNA占1016，而mRNA僅占1%5，并且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，表達(dá)豐度也不一樣。 真核生物mRNA有特征性的結(jié)構(gòu)，即具有5端帽子結(jié)構(gòu)（m7G）和3端的poly(A)尾巴絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的3端存在2030

20、0個(gè)腺苷酸組成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，這種結(jié)構(gòu)為真核mRNA分子的提取、純化，提供了極為方便的選擇性標(biāo)志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎(chǔ)就在于此。 一般mRNA分離純化的原理就是根據(jù)mRNA 3 末端含有多poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)特性設(shè)計(jì)的。當(dāng)總RNA流經(jīng)寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過(guò)兩次oligo(dT)纖維素柱，即可得到較純的mRNA。 目前常用的mRNA的純化方法有： （1）寡聚（dT）纖維素柱

21、層析法，即分離mRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法； （2）寡聚（dT）纖維素液相離心法，即用寡聚（dT）纖維素直接加入到總的 RNA溶液中并使mRNA與寡聚（dT）纖維素結(jié)合，離心收集寡聚（dT）纖維素mRNA復(fù)合物，再用洗脫液分離mRNA，然后離心除去寡聚（dT）纖維素； ）磁性球珠法等。dT）其它一些方法：如寡聚（3（ 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方法（1）進(jìn)行mRNA的分離純化。 【試劑與器材】 （一）試劑 1 0.1mol/L NaOH ，每組200mL 2 寡聚Oligo（dT）-纖維素 3 加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL 或

22、0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。 4 洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。 配制時(shí)可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65時(shí)，加入經(jīng)65溫育（30min）的10%SDS至終濃度。 5 5

23、 mol/L NaCl，每組10mL 6 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL 7 無(wú)RNase雙蒸水(DEPC水)，每組100mL 8 70%乙醇，每組10mL 注意：溶液5，6的配制都應(yīng)該加0.1% DEPC處理過(guò)夜，溶液1，3，4，8則用經(jīng)0.1% DEPC處理過(guò)的無(wú)RNase雙蒸水配制，Tris應(yīng)選用無(wú)RNase的級(jí)別。溶液配制后，最好能夠按一次實(shí)驗(yàn)所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次實(shí)驗(yàn)只用一份，避免多次操作造成對(duì)溶液的污染。 （二）器材 1 恒溫水浴箱 2 冷凍高速離心機(jī) 3 紫外分光光度計(jì) 4 巴斯德吸管 5 玻璃棉 6 5ml一次性注射器 【

24、操作方法】 （一） oligo(dT)纖維素的預(yù)處理 1 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。 2 將懸浮液裝入填有經(jīng)DEPC水處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無(wú)RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。 3 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小于8.0。 4 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當(dāng)?shù)闹蚕礈炀彌_液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4待用。 （二） 總RNA濃度的調(diào)整 1 把實(shí)驗(yàn)一所提的總RNA轉(zhuǎn)到適合的離心管中

25、，如果總RNA的濃度大于0.55mg/mL，則用無(wú)RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對(duì)除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65水浴加熱5 分鐘，然后迅速插在冰上冷卻。 2 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調(diào)至0.5 mol/L。 （三） mRNA的分離 1 mRNA與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數(shù)次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。于37水浴保溫并溫和搖蕩15分鐘。 總RNA 寡聚Oligo(dT)-纖維素 洗滌

26、緩沖液1，2 洗脫體積(mL) (mL) (mg) (mL) 1.0 0.2 1.0 0.2 1.5 0.2-0.5 0.5 1.5 3.0 0.5-1.0 1.0 3.0 5.0 1.0-2.0 5.0 2.0 的一次性注射器，取適量經(jīng)過(guò)高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端，并把它2 個(gè)5ml轉(zhuǎn)移：取1懸浮液轉(zhuǎn)移到注射器，推進(jìn)塞子纖維素/RNAoligo(dT)-RNase固定在無(wú)的支架上，再把的離心管中（保留至確定獲得足夠RNase直至底部，把含有未結(jié)合上的RNA液體排到無(wú) 的mRNA）。，溫和振蕩，充分重新懸浮洗滌：根據(jù)上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1 3的離心管收集洗出液。測(cè)定每一管的R

27、NasemRNA-oligo(dT)-纖維素，推進(jìn)塞子，用無(wú) 0為時(shí)準(zhǔn)備洗脫。OD260，當(dāng)洗出液中OD或無(wú)倍柱床體積）的洗脫緩沖液2-32洗脫：根據(jù)上表直接用注射器慢慢吸取適量（4 柱床雙蒸水到注射器內(nèi)充分重懸RNasemRNA-oligo(dT)-至1/3纖維素，推進(jìn)塞子以1/2 體積分管收集洗脫液。分鐘，的洗脫液組分于RNAOD260測(cè)定每一管的 5，合并含有2-3，離心2500g4， 纖維素。oligo(dT)-上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，去掉殘余的6 沉淀：洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻后，-2030分鐘或放置過(guò)夜。

28、 7 離心收集：12000g, 4離心15分鐘，小心棄去上清，mRNA沉淀此時(shí)往往看不見，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4離心5 分鐘，小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。將mRNA沉淀溶于適當(dāng)體積的無(wú)RNase的雙蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70）。 8 定量：測(cè)定OD260和OD280，計(jì)算產(chǎn)率以及OD260/OD280的比率（同上一實(shí)驗(yàn)）。 【注意事項(xiàng)與提示】 1 整個(gè)操作過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)oRNase操作環(huán)境規(guī)則。 2 提取的總RNA必須完整，不能被降解，這是mRNA質(zhì)量的先決條件。 3 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比

29、例要適當(dāng)，過(guò)量的總RNA，容易造成mRNA不純。 4 RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結(jié)合前必須置于65加熱5 分鐘，這一步很重要，其作用（1）破壞mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是poly(A+)尾處的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結(jié)合。加熱后應(yīng)立即插入冰上，以免由于溫度的緩慢下降使mRNA又恢復(fù)其二級(jí)結(jié)構(gòu)。 5 應(yīng)注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 6 mRNA制備后，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測(cè)其完整性和有無(wú)DNA污染。提取的mRNA應(yīng)該在0.58.0kb之間呈現(xiàn)彌散狀，無(wú)明顯區(qū)帶，但大部分的mRNA應(yīng)在1-2.0kb范圍內(nèi)（如下圖）。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)一次純化分離的mRNA還會(huì)有微量的rRNA殘留，但一般來(lái)說(shuō)不會(huì)對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成很大的影響，如果樣品充足，可將經(jīng)過(guò)一次純化分離的mRNA 再純化一次，進(jìn)一步提高其純度。 圖3.1 mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖 Lane 1, 0.247.5kb RNA分子量Maker; Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA; Lane 3, 老鼠肝臟mRNA 7 為防止mRNA降解，應(yīng)避免多