23SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定酵母蔗糖酶的相對(duì)-北京工業(yè)大學(xué)

1、酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)的研究丁潔，臧清，王然，馬翌婷，馬雪梅（北京工業(yè)大學(xué)，生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，生物化學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京100022）摘 要：采用SDS抽提法從酵母中提取蔗糖酶，在 SDS摩爾濃度0.5 mmol/L，溫度40C, 提取時(shí)間10 h，pH值5.5的提取條件下，進(jìn)行抽提得到粗酶，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 %的乙醇分級(jí)沉淀、Mo no Q陰離子交換柱層析純化后，制得高純度的酵母蔗糖酶。利用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定不 同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)酵母蔗糖酶溶液的吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定酵母蔗糖酶樣液的 吸光度值，從而得出該蔗糖酶樣液的濃度，分別為：A樣液279.53卩g /mL B樣液873.18

2、卩g/mL 0最后利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定酵母蔗糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量是60kDa。關(guān)鍵詞：酵母蔗糖酶；SDS法提??；考馬斯亮藍(lán)法；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳Study on Purification and Properties of Invertase from YeastDING Jie, ZANG Qi ng, WANG Ra n, MA Y i-ti ng, MA Xue-mei *(Beiji ng Uni versity of Tech no logy, College of Life Scie nee and Bio-e ngin eeri ng, Laboratory o

3、fBiochemical tech no logy, Beiji ng, Chi na, 100022)Abstract: The experiment extracted invertase from breweyeast using SDS extraction. Under the condition of the SDS concentration 0.5mmol/L, temperature for 40 C , time for 10h, pH value for 5.5 to get coarse en zyme extract ion. Then the purified in

4、v ertase was obta ined by precipitatatio n with 50% ethyl alcohol and Mono Q chromatography. The absorba nee of yeast in vertase soluti on can be determined by Coomassie Brilliant Blue, then draw the standard curve of yeast invertase solution so that we can know the concentration of yeast invertase

5、solution: A samples of 279.53 卩 g/mL, B samples of 873.18卩 g/mL. The relative molecular mass of the yeast invertase was determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.Key words : Yeast In vertase ; SDS Extract ion; Coomassie Brillia nt Blue; SDS Polyacrylamide gel electrophoresis作者簡(jiǎn)介：丁潔（1992 ）

6、，女，北京人，學(xué)生。E-mail:xmma通訊作者：馬雪梅，女，教授，致力于病毒性疾病，遺傳性疾病、腫瘤相關(guān)疾病的診斷等方面的研究工作。蔗糖酶(Sucrase , EC 3. 2. 1.26)又稱轉(zhuǎn) 化酶(Invertase)?？勺饔糜?的,2糖苷鍵，將 蔗糖水解為D-葡萄糖和D-果糖。由于果糖甜 度高，約為蔗糖的1.361.60倍，在工業(yè)上 具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值?？捎靡赞D(zhuǎn)化蔗糖，增 加甜味，制造人造蜂蜜，防止高濃度糖漿中 的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的軟心糖， 還可為果葡糖漿的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的方法10本文以SDS抽提法從酵母中提取蔗糖酶， 經(jīng)乙醇分級(jí)沉淀、Mono Q陰離子交換柱層析 純化

7、后，制得高純度的酵母蔗糖酶。利用標(biāo) 準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行濃度分析，最后通過(guò) SDS聚 丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)蛋白的方法得到酵母 蔗糖酶的相對(duì)分子量。1材料與儀器1.1材料酵母(市售)。12主要化學(xué)試劑和儀器十二烷基硫酸鈉(SDS)，Serva公司提供； 等電點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品，Amersham公司提供；其余試 劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或生化試劑。牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液、考馬斯亮藍(lán)G-250、30%聚丙烯酰胺儲(chǔ)存夜、1.5M Tris-HCI、AP、 TEMED、溴酚藍(lán)、生理鹽水、去離子水、無(wú) 水乙醇等。UV22201型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)， Shimadzu公司制造；Waters 650型高級(jí)蛋白 純化系統(tǒng)，Waters公

8、司制造；Phast System全 自動(dòng)快速水平電泳儀，Amersham公司制造； 高速冷凍離心機(jī)，Hitachi公司制造；冷凍干 燥器，Labconeo公司制造；電泳儀，Bio2Rad 公司制造；精密酸度計(jì)，Orion公司制造。2方法2.1酵母蔗糖酶的提取與純化2.1.1酵母提純酵母離心(8 000 r/min) 15 min后收集 菌體。將收集到的菌體用蒸餾水洗滌，離心， 再洗滌，重復(fù)數(shù)次，直到菌體呈白色，傾出 上清液，將不含雜質(zhì)的干凈的酵母保存待用。 2.1.2粗酶液的制備準(zhǔn)確稱取離心分離后的酵母10g，加入60mL 0.5mmol的SDS溶液溶解，在pH為5.5、 40C水浴中加熱10

9、h后取出，4C、12000r/min 離心15mi n。清液即為粗制酶液。4C保存。 2.1.3乙醇分級(jí)純化在粗酶液中加人乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)30%, 4C放置過(guò)夜，4C、12000 r/min 離心15 min，取上清液，再追加乙醇使其終質(zhì)量分 數(shù)達(dá) 50%。4C放置 1 h. 4C、12000 r/min 離心15 min,棄上清液，沉淀用雙蒸水溶解， 4C保存。經(jīng)SDS抽提法提取，質(zhì)量分?jǐn)?shù)50% 的乙醇沉淀所礙的酶液對(duì)透析液(pH 7.3、0.05moI/L，Tris-HCI緩沖液)充分透析，所得 透析液4C保存。2.1.4 MonoQ陰離子交換柱層析酵母蔗糖酶經(jīng)上步純化后，上 MonoQ

10、(10/10)陰離子交換柱(用 pH7.3、0.05 mol/L。Tris-HCI緩沖液充分平衡過(guò)),然后用 0I mol/L、60 min線性梯度的NaCI溶液(內(nèi) 含 pH 7.3、0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液)洗脫。體積流量為0.5mL/min，每管收集3 mL。，紫 外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。測(cè)定各管洗脫液的蔗 糖酶活性與蛋白質(zhì)含量，合并蔗糖酶活力高 的若干管洗脫液，經(jīng)過(guò)對(duì)水透析脫鹽，冷凍 干燥后即為純化的酵母蔗糖酶。2.1.5蔗糖酶活性的測(cè)定稀釋酶液0.5 mL,加入0.3 mL pH值為4.6、0.1 mol/L 的 NaAc-HAc 緩沖液，0.2 mL 0.1

11、 mol/L的蔗糖溶液，37T準(zhǔn)確反應(yīng)15min 后，加0.125 mL l mol/L的NaOH溶液中止反 應(yīng)。用DNS法在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定形成的 還原糖量。在該條件下，蔗糖酶液1 min轉(zhuǎn)化 底物蔗糖生成1yg葡萄糖定義為1個(gè)活力單 位2。2.2考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酵母蔗糖酶的濃 度2.2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制表2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制表AvV 口呂號(hào)1234567母液蛋白質(zhì)母液/ pL018.7537.5056.2575.0093.75112.50生理鹽水/ pL150.00131.25112.5093.7575.0056.2537.50考馬斯亮藍(lán)G250/ pL2850285028

12、502850285028502850總體系/ pL3000300030003000300030003000蛋白質(zhì)濃度/(p g/mL)0100200300400500600800根據(jù)表2.1，配制7份梯度濃度的蛋白質(zhì) 標(biāo)準(zhǔn)溶液，室溫靜置3min，在595nm波長(zhǎng)處 比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.2酵母蔗糖酶樣液濃度的測(cè)定取一支干凈試管，加入樣品液 1.0mL及 考馬斯亮藍(lán)染液4.0mL,混勻，室溫靜置3min， 于波長(zhǎng)595nm處比色，讀取吸光度，由樣品 液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出含量。2.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定酵 母蔗糖酶的相對(duì)分子量2.3.1酵母蔗糖酶樣品的處理2.3.1.1低

13、相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蔗糖酶樣品的制備分裝標(biāo)準(zhǔn)蔗糖酶樣品，即每個(gè)包裝加入200 yL去離子水充分溶解，然后分裝于 200 個(gè)小塑料離心管。分裝后每份體積10 L，每 種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的含量為2 Pg，-20 C保存。用 時(shí)加入等體積的樣品緩沖液，混勻，在沸水 浴中加熱3min，待電泳時(shí)用于上樣。2.3.1.2待測(cè)蔗糖酶樣品的制備取蛋白樣品0.5mg,加入0.01mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）1mL溶解。加入等體積的樣品緩沖液，混勻，在沸水浴中加熱3min，待電泳時(shí)用于上樣。2.3.2凝膠的制備2.3.2.1分離膠的制備表2.210%的SDS-PAGE分離膠6mL體積配方表試劑30%聚丙烯酰胺 儲(chǔ)存夜

14、ddH2O1.5M Tris-HCl (PH8.8)1%SDS1%APTEMED用量/mL2.41.981.50.060.060.007根據(jù)表2.2,配制分離膠于:一燒杯中，混封上層水加速聚合，當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界勻，用移液槍將混勻的溶液緩慢沿板角注入限時(shí)表明聚合好。兩塊玻璃板之間，至2/3的位置。注入完畢后，2.3.2.2濃縮膠的制備表2.3 5%的SDS-PAGE濃縮膠2mL體積配方表試劑30%聚丙烯酰胺 儲(chǔ)存夜ddH2O1.5M Tris-HCl (PH6.8)100g/LSDS100g/LAPTEMED用量/mL0.331.40.250.020.020.002用濾紙吸干水后，根據(jù)表2.3

15、,配制濃縮 膠于一燒杯中，混勻，用移液槍將混勻的溶 液緩慢沿板角注入兩塊玻璃板之間并溢出， 迅速插入梳子，待濃縮膠凝固。2.3.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳待濃縮膠凝固后，向電泳槽中倒?jié)M電泳 液，小心地取出梳子，向凹槽中分別注入 5 yLarker溶液和5加過(guò)溴酚藍(lán)指示劑的 蔗糖酶樣液。連接好電泳儀后，接通電源，調(diào)節(jié)電壓為50V （約8V/cm），當(dāng)溴酚藍(lán)前沿 進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，待溴酚藍(lán) 下行到距膠末1cm停止電泳。2.3.4凝膠的染色、脫色及照相電泳結(jié)束后，將凝膠板取下，切去濃縮膠，并進(jìn)行方位標(biāo)記，剝膠，放入已裝有染 色液的培養(yǎng)皿中，染色0.5-1h。染色完畢后，倒出染色液，

16、并換脫色液2-3次，直至凝膠的藍(lán)色背景褪盡，蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止，最后 在進(jìn)行照相觀察。3結(jié)果3.1考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酵母蔗糖酶的 濃度3.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將配制好的不同濃度梯度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn) 溶液放到分光光度計(jì)上測(cè)吸光度值，得到一 系列數(shù)據(jù)。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液/（卩g /m）蔗糖酶樣液AB1X1Y1/2Y0.4861.2140.753表3.1不同濃度梯度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和對(duì)應(yīng)的吸光度值及蔗糖酶樣液的吸光度值蛋白質(zhì)濃度0100200300400500600/（卩 g/mL）吸光值 A 00.2090.3570.4960.6370.8461.043根據(jù)表3.1，繪制蛋白質(zhì)濃度對(duì)吸光度值液濃度為279.5

17、3卩g/mL ; B樣液濃度為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（卩g/mL）A值度光吸圖3.2 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程及 R2值。873.18卩g /mL3.2 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蔗糖 酶的相對(duì)分子質(zhì)量圖3.1蛋白質(zhì)濃度對(duì)吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線3.1.2蔗糖酶樣液濃度的計(jì)算根據(jù)圖3.1所示標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)得未知濃 度的蔗糖酶樣液A、B的吸光度值代入回歸方 程，得到A、B溶液的濃度。計(jì)算結(jié)果：A樣彩塾用常盂口 Marker. WSM (M?S kDak圖 3.3 Maker-P7709s-NEB圖3.2中，從左至右第四條帶為本人的電 泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。又根據(jù)圖3.3,蔗糖酶樣品的電

18、 泳結(jié)果位于58kDa和80kDa之間，故可估計(jì) 出蔗糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量為60kDa。4討論4.1選擇SDS抽提法的原因?qū)τ赟DS抽提法、凍融法和甲苯自溶法 三種提取方法，從酶活性來(lái)看，SDS抽提法 的酶活性最高，是甲苯自溶法的1120倍和凍 融法的2倍。從提取效率來(lái)看,SDS抽提法 較高，是凍融法的2倍。并且，SDS抽提法 還具有操作簡(jiǎn)便易行、生產(chǎn)成本低、回收率 高等特點(diǎn)，更適合酵母蔗糖酶的工業(yè)化大規(guī) 模生產(chǎn)。4.2稀釋蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液方法的選擇制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，我們選擇的稀釋方法 是每一次都直接從母液中吸取溶液配制，而 不是逐級(jí)稀釋溶液。我們認(rèn)為這樣做的優(yōu)點(diǎn)有：第一，計(jì)算簡(jiǎn)單，操作方便；第二，

19、結(jié) 果的準(zhǔn)確度比較高，不容易出錯(cuò)；第三，中 間某一梯度稀釋出現(xiàn)問(wèn)題容易改正，不會(huì)因 其導(dǎo)致后面的稀釋出現(xiàn)問(wèn)題。而且，我們的 最終得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為0.9947,可見(jiàn) 相關(guān)性較好。4.3考馬斯亮藍(lán)法的優(yōu)缺點(diǎn)考馬斯亮藍(lán)法的優(yōu)點(diǎn)：第一，靈敏度高， 最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg；第二，測(cè)定快 速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑；第三，干擾物 質(zhì)少?？捡R斯亮藍(lán)法的缺點(diǎn)：第一，由于各種 蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不 同，因此考馬斯亮藍(lán)法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定 時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選 用g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的 偏差；第二，仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定， 主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、

20、 Trit on X-100、 十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH; 第三，標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不 能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線 來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。4.4濃縮膠和分離膠pH值不同的原因在SDS-PAGE不連續(xù)電泳中，濃縮膠和 分離膠的pH值不同，前者主要表現(xiàn)為濃縮效 用，后者表現(xiàn)為電荷效用和分子篩效用。制膠緩沖液使用的是 Tris HCl緩沖系 統(tǒng)，濃縮膠的pH6.8，分離膠的pH8.8;而電 泳緩沖液使用的Tris 甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃 縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，而甘氨酸的等 電點(diǎn)為5.97,因此甘氨酸僅少數(shù)解離為負(fù)離 子，在電場(chǎng)中移動(dòng)速度很慢，而 Cl離子幾乎 全部解離。兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶， 蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)，三類離子的 遷移速率為Cl一般蛋白質(zhì) 甘氨酸，電泳開(kāi) 始后，Cl離子泳動(dòng)快，在其后留下一個(gè)低離 子濃度