MAL基因在原發(fā)食管癌組織表達(dá)及臨床意義

1、MAL基因在原發(fā)食管癌組織表達(dá)及臨床意義作者：陳皓作者單位：泰安市中心醫(yī)院腫瘤外科，山東泰安 271000【摘要】目的探討MAL基因表達(dá)下調(diào)與食管癌病理分期、 組織學(xué)分級的相關(guān)性。方法 采用RT-PCR和半定量RT-PCR方法檢 測45例食管癌組織和癌旁食管黏膜組織中MAL基因的表達(dá)。結(jié)果40例食管癌組織中MAL mRNA表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁食管黏膜 組織(X2=30.59,P0.01);IH期病人的MAL基因表達(dá)水平顯著高 于皿期病人(t=5.952, PV0.001),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性病人 MAL mRNA表 達(dá)水平顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性病人(t=6.743, PV0.001)。結(jié)論MAL

2、 mRNA在食管癌組織中的表達(dá)與臨床分期、組織學(xué)分級等臨床病理因 素有一定相關(guān)性，可作為判斷食管癌惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及預(yù)后的實(shí) 驗(yàn)室指標(biāo)?！娟P(guān)鍵詞】 食管腫瘤;MAL基因;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)THE EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OFMAL GENE IN PRIMAR Y ESOPHAGUS CANCER CHEN HAO (Departme nt of On cology, Taia n Central Hospital, Taia n 271000, Chi na)ABSTRACT Objective To explore the releva

3、nee betwee n MAL gene expressi on, cli ni cal stage and histologic grade of esophagus can cer. Methods The MAL gene expressi on in 45 can cer patie nts was detected with RT-PCR and semi-qua ntitative RT-PCR tech ni que. ResultsThe mRNA expressi on of MAL in 40 can cer tissue samples was lower than t

4、hat in the surro unding esophagus mucous membra nX( 2=30.59,P0.01). The gene expression in stage? and II patients was higher than that in stage 皿 patients (t=5.952,P0.001). Those with lymph node metastasis showed lower gene expressi on tha n patie nts without (t=6.743,P0.001). Con clusi on In esopha

5、gus can cer, the MAL gene expressi on was associated with histologic grade and cli ni cal stage, which can be used for determ ining tumor malig nancy and predict ing its prog no sis.KEY WORDS Esophageal n eoplasms; MAL gene; Reverse tran scriptase polymerase cha in reacti onMAL基因是由ALONSO等1于1987年分離得到

6、的抑制腫 瘤生長的新基因，MAL基因失活及異常與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的發(fā) 生發(fā)展和臨床預(yù)后等有一定關(guān)系。近年來，MAL基因與食管癌的關(guān)系已成為研究的熱點(diǎn)。本研究利用定性和半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)方法檢測食管癌組織及其癌旁組織中MAL基因的表達(dá)情況，旨在探討MAL基因在食管癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，及其與臨 床病理因素的關(guān)系，為食管癌發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。1材料與方法1.1標(biāo)本來源1.1.1病例選擇 2004年6月2006年3月 ，泰安 市中心醫(yī)院 住院的食管癌病人45例，男25例，女20例;年齡3679歲，平均57.5歲。術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，未行放、化療治療。手術(shù)方式均為

7、經(jīng)左胸行食管癌次全切除胃-食管弓上或弓下吻合術(shù)，術(shù)中無肉眼可 見腫瘤殘留。術(shù)后病理檢查均證實(shí)為鱗癌。按 UICC食管癌分期標(biāo)準(zhǔn) (1997)進(jìn)行分期。1.1.2標(biāo)本取材和保存 食管癌組織及癌旁組織取自食管癌病人手術(shù)標(biāo)本，組織離體后立即無菌取材，從腫瘤生長活躍無壞死的 部位取下約1 cm3癌組織及5 cm外癌旁組織，標(biāo)本30 min內(nèi)送實(shí)驗(yàn) 室，新鮮提取總RNA;不能保證30 min內(nèi)制備樣品的，在取材后放 -80 C冰箱保存?zhèn)錅y。1.2檢測方法采用半定量 RT-PCR法檢測MAL mRNA的相對表達(dá)水平。 總RNA提?。翰捎肨rizol提取總RNA，并進(jìn)行純度和濃度測定。 RT反應(yīng):于DEPC

8、處理的Eppendof管中，加入1 Mg總RNA、 MMLV及隨機(jī)引物等，快速離心混勻后，37 C 1 h, 95 C 10 min 滅活MMLV，快速離心使蒸氣沉于管底。 PCR反應(yīng)：于0.5 mL Eppendof管中加入RT反應(yīng)產(chǎn)物、PCR反應(yīng)體系、MAL上游引物(5 -AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3 )、MAL 下游弓 I物(5 -ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3 )、B -actin 上游引物(5 -GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 )，以及 B -actin 下游弓 I物(5 -CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 )，擴(kuò)增片段

9、長度為 500 bp;95 C 5 min，離心使蒸氣沉于管底，加Taq DNA聚合酶，快速離 心混勻。循環(huán)條件：94 C 1 min, 58 C 1 min , 72 C 1 min，循環(huán) 35次，末次延伸7 min。電泳鑒定，觀察目的基因，實(shí)驗(yàn)中僅出現(xiàn)一 條500 bp B -actin條帶為MAL mRNA陰性;同時出現(xiàn)166 bp條帶為MAL mRNA陽性。采用數(shù)字圖像分析儀2200系統(tǒng)觀察拍照并進(jìn)行半 定量分析，以MAL/ B -actin比值作為MAL mRNA相對表達(dá)量，若比 值小于25%為表達(dá)缺失，若比值小于50%則為低表達(dá)，低表達(dá)與表 達(dá)缺失均為異常表達(dá)。1.3統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用

10、SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，對定性 RT-PCR結(jié)果進(jìn)行X 2檢 驗(yàn)及確切概率法；對半定量RT-PCR結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1食管癌組織和癌旁組織中 MAL mRNA的定性檢查結(jié)果 比較45例食管癌組織中未見MAL表達(dá)者28例，弱表達(dá)者12例; 癌旁組織食管黏膜組織 MAL mRNA全部呈陽性表達(dá)。食管癌組織中 MAL mRNA表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁食管黏膜組織，差異有顯著性 (X2=30.59,P0.01)。見圖 1。圖1 RT-PCR檢測食管癌組織MAL mRNA的表達(dá)、為食管癌組織MAL mRNA表達(dá)陽性;、為食管癌組織MAL mRNA表達(dá)陰性;為X174/Hae皿分子質(zhì)量標(biāo)志物2.

11、2 MAL mRNA 的半定量 RT-PCR檢測2.2.1食管癌組織和癌旁組織中 MAL mRNA表達(dá)水平比較 本文45例食管癌組織MAL mRNA相對表達(dá)水平為0.90士 0.11,而癌 旁組織中MAL mRNA的表達(dá)水平為1.51 士 0.27，兩者比較差異有統(tǒng) 計學(xué)意義（t=2.329, P0.05）。2.2.2食管癌組織MAL mRNA表達(dá)水平與臨床病理分期的 關(guān)系MAL mRNA表達(dá)水平與食管癌病人性別、年齡無關(guān)，但隨臨床 分期的增高，其表達(dá)水平明顯降低（PV0.001）,且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者 MAL mRNA表達(dá)水平顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者（P0.001）。見表1。 表1食管癌組織M

12、AL mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系3討論MAL基因定位于2q13,共含有4個外顯子，其cDNA長為1 051 bp。MAL是T淋巴細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白，它強(qiáng)烈表達(dá)于正常食管 上皮細(xì)胞，1987年ALONSO等1報道具有特征性的 MAL cDNA 克 隆呈現(xiàn)在成熟T淋巴細(xì)胞上。現(xiàn)已證實(shí)，MAL是組成向頂端運(yùn)輸?shù)?細(xì)胞膜和分泌性蛋白的必不可少的組成部分26?；贛AL的功能 是誘發(fā)廣泛的大量囊泡形成，有作者提出,MAL在頂端傳送體的形成 中扮演著重要角色7,8?，F(xiàn)在已有許多研究證明，MAL表達(dá)和人類 食管惡性腫瘤相關(guān)。有學(xué)者報道，MAL基因在食管癌發(fā)生的不同階 段均表達(dá)下調(diào)，且從不同角度分析和

13、探討 MAL基因表達(dá)下調(diào)的可能 機(jī)制，MAL的不表達(dá)或表達(dá)下調(diào)在食管癌發(fā)生中可能起決定性作用 9,10。TUGORES等11報道，MAL啟動子區(qū)設(shè)計缺失影響轉(zhuǎn)錄子 失活，沒有觀察到MAL基因組區(qū)有遺傳性的修改，而且在 13例食管癌細(xì)胞株中有3例MAL啟動子發(fā)生甲基化，9例細(xì)胞株中MAL表達(dá)正調(diào)節(jié)。其機(jī)制可能為 MAL啟動子DNA甲基化和組蛋白脫乙 ?；鶇f(xié)同作用于MAL基因?qū)е履[瘤發(fā)生。然而，現(xiàn)在仍沒有明確 MAL基因在癌組織中表達(dá)是否被其他機(jī)制調(diào)節(jié)，如染色體缺失、突 變或其他畸變。功能性測定表明，在癌細(xì)胞中外源性MAL的表達(dá)可引起細(xì)胞運(yùn)動性降低，在活體內(nèi)致瘤性下降。本研究采用定性和半定 量兩種

14、方法研究了食管癌 MAL mRNA的表達(dá)與性別、年齡、臨床分 期及組織學(xué)分級等因素的關(guān)系。結(jié)果顯示，MAL mRNA的表達(dá)缺失在不同性別、年齡中無明顯差異，從而推測食管癌 MAL mRNA的表 達(dá)缺失與性別、年齡無關(guān)，而 MAL基因的表達(dá)與食管癌的組織學(xué)分 級、臨床分期也無相關(guān)性，與文獻(xiàn)12,13 報道不符，可能與病例數(shù)較 少有關(guān)。本文研究結(jié)果顯示，食管癌組織MAL mRNA相對表達(dá)量與 癌旁組織比較差異有顯著性，且隨臨床分期和組織學(xué)分級的增高， 其 表達(dá)水平明顯降低，即 MAL基因在食管癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)。表 明MAL基因表達(dá)下調(diào)是食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個頻發(fā)事件。 國內(nèi)許智雄等14通

15、過PCR分析顯示，在食管癌細(xì)胞系 EC109、 EC8712和EC9706中都存在被分析的 MAL基因片段。本文在研究食管癌組織 MAL基因的表達(dá)同時，也探討了 MAL基因與食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性 組MAL的表達(dá)顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組（P0.05），提示食管癌組 織MAL的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著的相關(guān)性，關(guān)于 MAL基因 如何調(diào)節(jié)食管癌淋巴轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不十分清楚。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是食管癌的獨(dú)立危險因素，MAL的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在顯著的相關(guān)性， 因此，MAL基因的表達(dá)與食管癌的預(yù)后有一定的相關(guān)性。目前，關(guān) 于食管癌MAL基因與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系的同類研究尚未見報道，要

16、 得到更加準(zhǔn)確和客觀的結(jié)果還需要更大樣本量的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 AL0NS0 M A, WEISSMAN S M. cDNA clo ning andseque nee of MAL, a hydrophobic protein associated with huma n T-cell differe ntiatio nJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1987,84:1997-2001.2 CHEONG K H, ZACCHETTI D, SCHNEEBERGER E E, etal. VIP17/MAL, a lipid raft-associated protei

17、 n, is invo Ived in apical tran sport in MDCK cellsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1999,96(11):6241-6248.3 PUERTOLLANO R, ALONSO M A. MAL, an in tegraleleme nt of the apical sort ing machi nery, is an iti nera nt prote in that cycles betwee n the tran s-Golgi n etwork and the plasma membra neJ. Mol Biol

18、Cell, 1999,10:3435-3447.4 ALONSO M, BARTON D, FRANCKE U. MAL, amembra ne protein associated with huma n T-cell differe ntiatio n, isen coded on huma n chromosome 2, regi on cen-q13J. Cytoge net Cell Gen et, 1987,46:570-575.5 MARTIN-BELMONTE F, PUERTOLLANO R, MILLAN J,et al. Expressi on of the MAL ge

19、ne in the thyroid: the MAL proteolipid, a comp onent of glycolipid-e nriched membra nes, is apically distributed in thyroid folliclesJ. En docri nology, 1998,134:2077-2084.6 MARTIN-BELMONTE F, ARV AN P, ALONSO M A. MAL mediates apical tran sport of secretory protei ns in pola-rized epithelial Madin-

20、Darby canine kid ney cellsJ. J Biol Chem, 2001,276:49337-49342.7 PUERTOLLANO R, LI S, LISANTI M P, et al. The MAL proteolipid is n ecessary for no rmal apical tran sport and accurate sort ing of the in flue nza virus hemagglut inin in Madin-Darby canine kid ney cellsJ. J Cell Biol, 1999,272:18311-18

21、315.8 PUERTOLLANO R, MARTINEZ-MENARGUEZ J A, BATISTA A, et al. An in tact dilys in e-like motif in the carboxyl term inus of MAL is required for no rmal apical tran sport of the in flue nza virus hemaggluti nin cargo prote in in epithelial Madin-Darby canine kid ney cellsJ. Mol Biol Cell, 2001,12(6):1869-1883.9 MIMORI K, SHIRAISHI T, MASHINO K, et al. MAL gene expressi on in esophageal can cer suppresses motility, inv asi on and tumorige nicity and enhan ces apoptosis throu