分子克隆技術(shù)步驟

1、分子克隆技術(shù)步驟在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過(guò)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，弓I入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再?gòu)暮Y選 的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入 DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。克隆在生物學(xué)中其名詞含義系指一個(gè)細(xì)胞或個(gè)體以無(wú)性繁殖的方式產(chǎn)生一群細(xì)胞或一群個(gè)體，在不發(fā)生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無(wú)性繁殖(細(xì)胞)系；其動(dòng)詞(cione,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術(shù)將特定基因插入載體分子中，即分子克隆技術(shù)。將DNA片段(或基因)與載體D

2、NA分子共價(jià)連接，然后引入寄主細(xì)胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目 的可分為DNA和cDNA克隆兩類。cDNA克隆是以mRNA為原材料，經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA(cDNA)，再與載體 DNA分子連接引入寄主細(xì)胞。每一 cDNA反映一種mRNA的結(jié)構(gòu)，cDNA克隆的分布也反映了 mRNA的分布。特點(diǎn)是： 有些生物，如 RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克??； cDNA克隆易篩選，因?yàn)閏DNA庫(kù)中不包含非結(jié)構(gòu)基因的克隆，而且每一 cDNA克隆只含一個(gè) mRNA的信息； cDNA能在細(xì)菌中表達(dá)。cDNA僅代表某一發(fā)育階段表達(dá)出來(lái)的遺傳信息，只有基因文庫(kù)才包含一個(gè)生物 的完整遺傳信息。1方法：

3、DNA片段的制備：常用以下方法獲得 DNA片段：用限制性核酸內(nèi)切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機(jī)片段；在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工 方法合成對(duì)應(yīng)的基因片段；從mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。載體DNA的選擇： 質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外遺傳因子，DNA呈環(huán)狀，大小為1-200千堿基對(duì)(kb)。在細(xì)胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質(zhì)粒 DNA可通過(guò)轉(zhuǎn)化引入寄主菌。在細(xì)胞中有兩種狀態(tài)，一是緊密型”；二是松馳型”。此外還應(yīng)具有分子量小，易轉(zhuǎn)化，有一至多個(gè)選擇標(biāo)記的特點(diǎn)。質(zhì)粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構(gòu)建原核生物基因文庫(kù)，

4、cDNA庫(kù)和次級(jí)克隆。 噬菌體DNA :常用的 入噬菌體的DNA是雙鏈，長(zhǎng)約49kb，約含50個(gè)基因，其中50%的基因?qū)κ删w的生長(zhǎng)和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區(qū)，進(jìn)行改造后組建一系列具有不同特點(diǎn)的載體分子。入載體系統(tǒng)最適用于構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)和cDNA庫(kù)。M13噬菌體是一種獨(dú)特的載體系統(tǒng)，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內(nèi)是雙鏈環(huán)狀分子，象質(zhì)粒一樣自主制復(fù)，制備方法同質(zhì)粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈 DNA，用于DNA順序分析、定點(diǎn)突變和核酸雜交。 拷斯(Cos)質(zhì)粒：是一類帶有噬菌體

5、DNA粘性末端順序的質(zhì)粒 DNA分子。是噬菌體質(zhì)粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶 45kb的外源DNA片段。也能象一般質(zhì)粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉(zhuǎn)化寄主菌。這類載體常被用來(lái)構(gòu)建高等生物基因文庫(kù)。(3) DNA片段與載體連接：DNA分子與載體分子連接是克隆過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，方法有：粘性末端連 接，DNA片段兩端的互補(bǔ)堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復(fù)原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別不同順序，去卩能產(chǎn)生相同末端。平頭末端 連接，用物理方法制備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些 DNA連接酶

6、作用下連接起來(lái)，但連接效率不如粘性末端高；同聚寡核苷酸末端連接。人工接頭分子連接，在 平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段，經(jīng)限制性內(nèi)切 酶作用后就會(huì)產(chǎn)生粘性末端。連接反應(yīng)需注意載體 DNA與DNA片段的比率。以 入或Cos質(zhì)粒為載體時(shí)，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質(zhì)粒為載體時(shí)，形成環(huán)狀分子，比率常為1 : 1。(4) 引入寄主細(xì)胞：常用兩種方法：轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，方法是將重組質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過(guò)的宿主細(xì)胞混合置于冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養(yǎng)基上，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用選擇性培養(yǎng)基篩選重組子，通

7、常重組分子的轉(zhuǎn)化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高， 有許多DNA分子無(wú)轉(zhuǎn)化能力，而且重組后的DNA分子比原載體 DNA分子大，轉(zhuǎn)化困難。轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒類侵染宿主菌的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，一 般轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率比轉(zhuǎn)化高。(5) 克隆的選擇： 直接篩選：有些載體帶有可辨認(rèn)的遺傳標(biāo)記，能有效地將重組分子與本底區(qū)分。例如：有些入噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會(huì)從原來(lái)的混濁變?yōu)榍辶粒贿€有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色；有些入噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。 間接篩選：有引起載體分子帶有一個(gè)或多個(gè)抗

8、藥性標(biāo)記基因，當(dāng)外源DNA插入到抗藥基因區(qū)后，基因失活，抗性消失。如一質(zhì)粒有 A和B兩個(gè)抗藥性基因，當(dāng)外源基因插入到B基因區(qū)后，便只抗 A藥而不抗B藥。因此能在 A藥培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)而不能在B藥培養(yǎng)上生長(zhǎng)的便是重組分子。 核酸雜交：廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。陽(yáng)性點(diǎn)的位置就是所需要的克隆。 免疫學(xué)方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達(dá)，就可以用特異的蛋白質(zhì)抗體為探針，進(jìn)行原位雜交，選 擇特異的克隆。2重要意義與應(yīng)用：分子克隆技術(shù)是70年代才發(fā)展起來(lái)的，它的出現(xiàn)和應(yīng)用開辟了分子遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)

9、域，打開了人類了解、 識(shí)別、分離和改造基因，創(chuàng)造新物種的大門。它的成就對(duì)于工業(yè)、農(nóng)牧業(yè)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，并將為解決 世界面臨的能源、食品和環(huán)保三大危機(jī)開拓一條新的出路。在醫(yī)學(xué)方面，利用分子克隆技術(shù)已將胰島素，人、牛和雞的生長(zhǎng)激素、人的干擾素、松馳素、促紅細(xì)胞生長(zhǎng) 激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用發(fā)酵工業(yè)進(jìn)行了大規(guī)模生產(chǎn)。還可提高 微生物本身所產(chǎn)生的蛋白酶類和抗生素類藥物的產(chǎn)量。在基因治療方面。通過(guò)遺傳工程看到癌細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠腫瘤細(xì)胞，在溫度高時(shí)可逆轉(zhuǎn)為正常細(xì)胞。為治療半乳糖血癥，用帶有大腸桿菌乳糖操縱子的入噬菌體去感染半

10、乳糖血癥患者的離體培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞的半乳糖苷酶達(dá)到了正常水平，并確實(shí)能代謝半乳糖。在工業(yè)生產(chǎn)方面，以分子克隆技術(shù)為主體的基因工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程，四者緊密聯(lián)系、常綜 合利用。許多化學(xué)試劑如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環(huán)氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等都可能利用分子克 隆技術(shù)得到產(chǎn)品。在環(huán)境保護(hù)方面，人們根據(jù)需要進(jìn)行基因操作，將某種微生物的基因轉(zhuǎn)入另一微生物，創(chuàng) 造一些對(duì)有害物質(zhì)降解能力更強(qiáng)的新菌種，以分解工業(yè)污水中的有毒物質(zhì)。在食品工業(yè)方面，細(xì)菌可為人類 生產(chǎn)有價(jià)值的蛋白質(zhì)、氨基酸和糖等。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，植物遺傳工程對(duì)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量、培育新的農(nóng)作物品種提供了可能。有許多外源基因?qū)?/p>

11、 入植物獲得成功。分子克隆一一主要步驟分子克隆可以分為以下幾個(gè)步驟：（1）帶有目的基因的 DNA片段的獲得（2）重組DNA分子的構(gòu)建（3）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選（4）特定重組克隆的 鑒別1. 帶有目的基因的DNA片段的獲得：可以用限制內(nèi)切酶降解基因組 DNA再配合使用其他實(shí)驗(yàn)手段得到待定的DNA片段，可以用 超速離心的方法分離出具有特定核苷酸組成的 DNA片段，可以用mRNA做模板，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ) DNA即cDNA也可以用 化學(xué)合成的方法直接合成一段 DNA2. 重組DNA分子的構(gòu)建：重組DNA分子中包括兩部分，一部分是 外源DNA即目的DNA片段，另一部分是載體DNA用作載

12、體的，有質(zhì) 粒、噬菌體或病毒DNA它們的基本特征是能夠獨(dú)立復(fù)制。如果用同一種限制性內(nèi)切酶切割這兩種DNA則它們的末端完全相同，由于有互補(bǔ)的單鏈末端序列存在，在連接酶的作用下，就可以形成重組DNA分子。在沒有互補(bǔ)單鏈末端的情況下，也可以用酶學(xué)方法造成一個(gè)互補(bǔ)單鏈末端之后再進(jìn)行連接。3. 重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選:重組DNA分子必須進(jìn)入宿主細(xì)胞中，才能得到擴(kuò)增和表達(dá)這個(gè)過(guò)程叫做轉(zhuǎn)化。大腸桿菌是目前使用最廣泛 的宿主細(xì)胞。除此以外其他細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等也可作為宿主細(xì)胞，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要加以選 擇。在被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中，不同的單個(gè)細(xì)胞（在平板上表現(xiàn)為單個(gè)菌落，亦稱克?。┲锌赡芎?/p>

13、不同的重組質(zhì)?；蚍侵亟M質(zhì)粒，因此必須進(jìn)行篩選，以便確定哪些是重組克隆。篩選可以使用抗菌素抗性或其他方法， 依載體的性質(zhì)而定。4. 特定重組克隆的鑒別：由于重組克隆往往是較多的， 而在某 一克隆實(shí)驗(yàn)中，我們感興趣的目的克隆只有一個(gè)或幾個(gè)，所以需要進(jìn)步鑒別。使用的方法主要有核酸雜交法和免疫化學(xué)法。此外，找出了目的克隆之后， 還需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的，進(jìn)一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的結(jié)構(gòu)和功能。主要有酶切圖譜的制定，基因在 DNA片段上的精確定位，確定是否有內(nèi)含子，DNA序列分析，離體翻譯實(shí)驗(yàn)，外源基因在某些宿主細(xì)胞中的表達(dá)及產(chǎn)物的提純等。重組DNA分子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)分離制備待克隆的 DNA片段

14、將靶DNA片段與載體在體外進(jìn)行連接胞篩選、鑒定陽(yáng)性重組子重組子的擴(kuò)增。分子克隆方法DNA片段的制備常用以下方法獲得 DNA片段：用限制性核酸內(nèi)切酶將高分子量DNA切成一定大小的 DNA片段；用物理方法（如超聲波）取得DNA隨機(jī)片段；在已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對(duì)應(yīng)的基 因片段；從 mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA。載體DNA的選擇 質(zhì)粒：質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外遺傳因子，DNA呈環(huán)狀，大小為1-200千堿基對(duì)（kb）。在細(xì)胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質(zhì)粒DNA可通過(guò)轉(zhuǎn)化引入寄主菌。 在細(xì)胞中有兩種狀態(tài)， 一是緊密型”二是松 弛型”此外還應(yīng)具有分子量小，易轉(zhuǎn)化，有一至多個(gè)選擇標(biāo)記的

15、特點(diǎn)。質(zhì)粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用于構(gòu)建原核生物基因文庫(kù)，cDNA庫(kù)和次級(jí)克隆。 噬菌體DNA :常用的 入噬菌體的DNA是雙鏈，長(zhǎng)約 49kb,約含50個(gè)基因，其中50%的基因?qū)κ删w的生長(zhǎng)和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區(qū)，進(jìn)行改造后組建一系列具有不同特點(diǎn)的載體分子。入載體系統(tǒng)最適用于構(gòu)建真核生物基因文庫(kù)和cDNA庫(kù)。M13噬菌體是一種獨(dú)特的載體系統(tǒng)， 它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA（RF） 在寄主菌內(nèi)是雙鏈環(huán)狀分子，象質(zhì)粒一樣自主制復(fù)，制備方法同質(zhì)粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地制備單鏈

16、 DNA，用于DNA順序分析、定點(diǎn)突變和核酸雜交。 拷斯（Cos）質(zhì)粒：是一類帶有噬菌體 DNA粘性末端順序的質(zhì)粒 DNA分子。是噬菌體質(zhì)?；旌衔?。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質(zhì)粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉(zhuǎn)化寄主菌。這類載體常被用來(lái)構(gòu)建高等生物基因文庫(kù)。DNA片段與載體連接DNA分子與載體分子連接是克隆過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，方法有： 粘性末端連接，DNA片段兩端的互補(bǔ)堿基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內(nèi)切酶消化DNA可產(chǎn)生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復(fù)原樣，有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別不同順序，去卩能產(chǎn)生相同末端。 平頭末端連接，用物理方法制備的DN

17、A往往是平頭末端，有些酶也可產(chǎn)生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來(lái)，但連接效率不如粘性末端高； 同聚寡核苷酸末端連接。 人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶作用后就會(huì)產(chǎn)生粘性末端。連接反應(yīng)需注意載體 DNA與DNA片段的比率。以入或Cos質(zhì)粒為載體時(shí)，形成線性多連體 DNA分子， 載體與DNA片段的比率高些為佳。以質(zhì)粒為載體時(shí)，形成環(huán)狀分子，比率常為1 : 1。引入寄主細(xì)胞常用兩種方法： 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，方法是將重組質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA（M13）與氯化鈣處理過(guò)的宿主細(xì)胞混合置于冰上，待DNA

18、被吸收后鋪在平板培養(yǎng)基上，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使用選擇性培養(yǎng)基篩選重組子，通常重組分子的轉(zhuǎn)化 效率比非重組 DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無(wú)轉(zhuǎn)化能力，而且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉(zhuǎn)化困難。 轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒類侵染宿主菌的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，一般轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率比轉(zhuǎn)化高。克隆的選擇 直接篩選：有些載體帶有可辨認(rèn)的 遺傳標(biāo)記，能有效地將重組分子與本底區(qū)分。例如：有些入噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會(huì)從原來(lái)的混濁變?yōu)榍辶粒贿€有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍(lán)色變?yōu)闊o(wú)色；有些入噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的

19、噬菌體均為重組分子。 間接篩選：有引起載體分子帶有一個(gè)或多個(gè)抗藥性標(biāo)記基因，當(dāng)外源DNA插入到抗藥基因區(qū)后，基因失活，抗性消失。如一質(zhì)粒有A和B兩個(gè)抗藥性基因，當(dāng)外源基因插入到B基因區(qū)后，便只抗 A藥而不抗B藥。因此能在 A藥培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)而不能在B藥培養(yǎng)上生長(zhǎng)的便是重組分子。 核酸雜交：廣泛用于篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然后與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。陽(yáng)性點(diǎn)的位置就是所需要的克隆。 免疫學(xué)方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達(dá)，就可以用特異的蛋白質(zhì)抗體為探針，進(jìn)行原位雜交， 選擇特異的克隆。分子克隆技術(shù)（質(zhì)粒DNA和DNA插

20、入片段的制備、連接反應(yīng)以及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化）分子克?。∕olecular Cloning ）是指由一個(gè)祖先分子復(fù)制生成的和祖先分子完全相同的分子群，發(fā)生在基因 水平上的分子克隆稱基因克隆（DNA克?。＃ㄒ唬┵|(zhì)粒DNA的制備（二）DNA插入片段的制備 1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 2、DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（三）連接反應(yīng)（四）重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化關(guān)鍵詞：分子克隆質(zhì)粒 DNADNA插入片段連接反應(yīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克?。–lone）是指通過(guò)無(wú)性繁殖過(guò)程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。分子克?。∕olecular Cloning ）是指由一個(gè)祖先分子復(fù)制生成的和祖先分子完全相同的分子群，發(fā)生在基因水平上的分子克隆稱基

21、因克?。―NA克隆）。其基本原理是：將編碼某一多肽或蛋白質(zhì)的基因（外源基因）組裝到細(xì)菌質(zhì)粒（質(zhì)粒是細(xì)菌 染色體外的雙鏈環(huán)狀 DNA分子）中，再將這種質(zhì)粒（重組質(zhì)粒）轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，這樣重組質(zhì)粒就隨大 腸桿菌的增殖而復(fù)制，從而表達(dá)出外源基因編碼的相應(yīng)多肽或蛋白質(zhì)。由于質(zhì)粒具有不相容性，即同一類群 的不同質(zhì)粒常不能在同一菌株內(nèi)穩(wěn)定共存，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)就會(huì)分別進(jìn)入到不同的子代細(xì)胞中，所以來(lái)源于一 個(gè)菌株的質(zhì)粒是一個(gè)分子克隆，而隨質(zhì)粒復(fù)制出的外源基因也就是一個(gè)分子克隆。（一）質(zhì)粒DNA的制備質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的能獨(dú)立復(fù)制的雙鏈閉環(huán)DNA分子，它能賦予細(xì)菌（宿主細(xì)胞）某些特定的遺傳表型。質(zhì)粒并非細(xì)

22、菌生長(zhǎng)所必需，但由于其編碼一些對(duì)宿主細(xì)菌有利的酶類，從而使宿主細(xì)菌具有抵抗不 利自身生長(zhǎng)的因素如抗藥性等的能力。目前發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒主要分為F質(zhì)粒（性質(zhì)粒），R質(zhì)粒（抗藥性質(zhì)粒），E.coli質(zhì)粒（大腸桿菌腸毒素質(zhì)粒）。根據(jù)質(zhì)粒在一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)產(chǎn)生拷貝的數(shù)量，可將質(zhì)粒分為嚴(yán)緊型（低 拷貝，復(fù)制1-2次）和松弛型（高拷貝，復(fù)制10-200次）。由于質(zhì)粒的不相容性細(xì)菌經(jīng)分裂后就只留下了拷貝數(shù)較高的一種質(zhì)粒，例如R1和R2兩種抗藥性質(zhì)粒同屬于一類，由于不相容性使它們不能共存于同一細(xì)菌中，但不同類群的質(zhì)粒可以在一個(gè)細(xì)菌中共存。質(zhì)粒存在于細(xì)菌中，所以制備質(zhì)粒DNA時(shí)，首先應(yīng)將含有質(zhì)粒的細(xì)菌在含有相應(yīng)抗生素的液

23、體培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，使質(zhì)粒在細(xì)菌中得到擴(kuò)增。通過(guò)離心收集細(xì)菌，經(jīng)堿裂解細(xì)菌，使質(zhì)粒和細(xì)菌染色體DNA變性，然后再加中和液，使溶液 PH值恢復(fù)到中性，這樣質(zhì)粒DNA又可以復(fù)性至天然雙鏈構(gòu)象狀態(tài)，而細(xì)菌染色體DNA不能或很難復(fù)性所以仍處在變性狀態(tài)，這些變性的染色體 DNA與變性蛋白質(zhì)纏繞在一起，易被離心去處，而質(zhì)粒 DNA仍存在于水相中，再 用無(wú)水乙醇沉質(zhì)粒 DNA，最后經(jīng)離心即可得到質(zhì)粒DNA。（二）DNA插入片段的制備DNA插入片段是指我們所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達(dá)的基因。獲得DNA插入片段是分子克隆過(guò)程中的第一步。目前有幾種方法，如限制性內(nèi)切酶直接分離法、文庫(kù)篩選法、體

24、外擴(kuò)增法、人工合成法等，下面以逆轉(zhuǎn)錄-DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為例介紹獲得外源基因DNA插入片段的方法。1逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)所謂逆轉(zhuǎn)錄，就是以 mRNA為模板合成一條互補(bǔ) DNA鏈（即cDNA）的過(guò)程，在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中所用的是逆轉(zhuǎn) 錄酶，即以RNA為模板的DNA聚合酶，它也具有 5-3 DNA聚合酶活性，在合成新的核苷酸鏈時(shí)也需要引 物。由于真核基因組DNA由內(nèi)含子和外顯子組成，內(nèi)含子不編碼蛋白質(zhì)，因此體外擴(kuò)增基因組 DNA會(huì)給某些研 究造成困難，以mRNA為模板的基因擴(kuò)增可避免這種問(wèn)題的發(fā)生，因此從某種意義上來(lái)說(shuō)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)更具 實(shí)用性。制備cDNA時(shí)，首先要從細(xì)胞中提取 mRNA，以mRNA為模板，在

25、mRNA的poly（A）尾上結(jié)合12-18個(gè)寡聚（dT）片段作為合成的起始引物， 在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一條 cDNA鏈。然后用RNA酶消化DNA-RNA 雜交鏈中的RNA，剩下的單鏈DNA的3端往往有自發(fā)回折形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)， 正好可以作為合成第二條 DNA 鏈的引物。第二條 DNA鏈的合成可以用 DNA聚合酶I,也可以用逆轉(zhuǎn)錄酶。雙鏈 DNA合成后，用S1核 酸酶切去發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即獲得平端的雙鏈 cDNA。2、DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）PCR技術(shù)是在模板 DNA、引物和4種脫氧核糖核酸存在下，DNA聚合酶催化的一種體外酶促反應(yīng)。PCR技術(shù)的特異性取決于引物和模板 DNA結(jié)合的特異性。反應(yīng)

26、由三個(gè)步驟組成：1、變性：通過(guò)加熱使 DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈 DNA解離成單鏈DNA ;2、 退火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)，使含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于模板DNA的引物與模板DNA在局部形成雜交雙鏈；3、延伸：在4種dNTP底物和Mg2+存在的條件下，DNA聚合酶由5-3方向合成新的與模板 DNA互補(bǔ)的 DNA鏈。以上反應(yīng)為一個(gè)循環(huán)，通常進(jìn)行 25-30個(gè)循環(huán)，由此介于兩個(gè)引物之間的特異性 DNA片段得到大 量復(fù)制，數(shù)量可達(dá) 2X107-8拷貝。PCR引物決定PCR的特異性，引物的設(shè)計(jì)就顯得尤為重要。下面以已知DNA序列設(shè)計(jì)引物為例介紹設(shè)計(jì)引物應(yīng)考慮的幾個(gè)方面：1、 GC比值：眾所周知，堿基對(duì)中的GC之間有

27、三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GC和AT在引物序列中的合 理比例是設(shè)定PCR中退火溫度的重要依據(jù)。通常在一個(gè)引物中GC和AT各半即可。2、長(zhǎng)度：通常15-20bp即可。由于目的不同，有時(shí)引物長(zhǎng)些，但太短會(huì)影響引物的特異性。3、 方向：設(shè)計(jì)出的引物永遠(yuǎn)是 5-3方向,所以正向引物是與一股模板DNA序列相一致的，而反向引物則與這 股模板DNA序列相互補(bǔ)。4、 酶切位點(diǎn)：如果想克隆所放大的DNA片段，通常在引物的 5端設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，使進(jìn)一步的 克隆工作更容易。一對(duì)引物可用一種或兩種酶切位點(diǎn)，這取決于設(shè)計(jì)者，兩種不同的酶切位點(diǎn)使克隆具有方向性。5、 啟始和終止密碼：如果想表達(dá)所放大的DNA

28、片段，所用的克隆載體又不含啟始密碼和終止密碼，應(yīng)將其設(shè)計(jì)在引物的酶切位點(diǎn)之后，特異性DNA序列之前。6、 其它：如果表達(dá)的融合蛋白用親合層析方法純化，可將必要的序列設(shè)計(jì)在引物中以使所表達(dá)的融合蛋白易于純化。（三）連接反應(yīng)將載體質(zhì)粒DNA和外源基因DNA在DNA連接酶的作用下，雙鏈DNA片段相鄰的5端磷酸與3端羥基之間 形成磷酸二酯鍵，形成重組質(zhì)粒，這是分子克隆技術(shù)的核心步驟。在連接反應(yīng)進(jìn)行之前，質(zhì)粒和外源基因 DNA分別用同樣的限制性內(nèi)切酶消化，使它們成為含有同樣粘性末端或鈍端的線性DNA，這是連接成功的先決條件。下面介紹連接反應(yīng)的程序。1模板DNA的準(zhǔn)備在進(jìn)行DNA重組以前，通常要先將 DN

29、A分子用限制性內(nèi)切酶消化，使兩種 DNA分子的末端產(chǎn)生相同的粘 性末端或平齊末端。通常按下列比例進(jìn)行：1. 雙蒸溜水適量2. 10 酶緩沖液 1/10容量3. DNA多少卩14. 限制性內(nèi)切酶 1/10容量（每微克 DNA用1-10單位） 總?cè)萘浚ǜ鶕?jù) DNA分子量來(lái)確定，通常 10-100卩?；旌虾?7C溫育30-120min。2、連接反應(yīng)在DNA連接酶的作用下，將外源基因DNA片段和線性質(zhì)粒 DNA連接起來(lái)構(gòu)成重組質(zhì)粒的過(guò)程。通常按下列比例進(jìn)行：1. 雙蒸溜水適量2. 10 酶緩沖液 1/10容量3. 質(zhì)粒DNA適量4. DNA插入片段適量5. 限制性內(nèi)切酶 1/10容量（每微克DNA用1

30、-10單位）總?cè)萘浚ǜ鶕?jù) DNA分子量來(lái)確定，通常 10-20卩?；旌虾笾?4-16C水浴6-12小時(shí)。注意通常DNA插入片段的量是載體 DNA的3倍，這需根據(jù) DNA分子量計(jì)算，而不取決于濃度。（四）重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化DNA插入片段和質(zhì)粒 DNA在體外連接形成重組質(zhì)粒后，需要被導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)才能進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)。接受重 組DNA分子的細(xì)胞稱作受體細(xì)胞或宿主細(xì)胞。受體細(xì)胞分為原核細(xì)胞（如大腸桿菌）和真核細(xì)胞（如酵母、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞）。原核細(xì)胞即可作為基因復(fù)制擴(kuò)增的場(chǎng)所，也可作為基因表達(dá)的場(chǎng)所；真核細(xì)胞一般用作基因表達(dá)系統(tǒng)。一般將重組 DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化（transformation