常用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量

1、6 種方法測定蛋白質(zhì)含量一、微量凱氏( kjeldahl )定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機物即分解產(chǎn)生氨(消化)，氨又與硫酸作用， 變成硫酸氨。 經(jīng)強堿堿化使之分解放出氨， 借蒸汽將氨蒸至酸液中， 根據(jù)此酸液 被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：nh2ch2cooh+3h2so4 2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4 (nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh 2h2o+na2so4+2nh3 (3)反應(yīng)( 1)、(2)在凱氏瓶完成，反應(yīng)( 3)在凱氏蒸餾裝置中進行。為了加速消化，可以加入 cuso4作催化劑， k2so4

2、 以提高溶液的沸點。收集 氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得 樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去 非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量， 即用樣品中蛋白氮乘以 625 即得。二、雙縮脲法( biuret 法)(一) 實驗原理雙縮脲( nh3conhconh3)是兩個分子脲經(jīng) 180左右加熱，放出一個分子氨 后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與 cuso4 形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲 反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵， 或能過一個中間碳原子相連的 肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比， 而與

3、蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成 分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定圍為 1-10mg 蛋白質(zhì)。干擾這一測定的 物質(zhì)主要有：硫酸銨、 tris 緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì) 少。主要的缺點是靈敏度差。 因此雙縮脲法常用于需要快速， 但并不需要十分精 確的蛋白質(zhì)測定。（二）試劑與器材1. 試劑：（1）標準蛋白質(zhì)溶液：用標準的結(jié)晶牛血清清蛋白（ bsa）或標準酪蛋白， 配制成 10mg/ml 的標準蛋白溶液，可用 bsa濃度 1mg/ml 的 a280為 0.66 來校正 其純度。如有需要， 標準蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量， 計

4、 算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標準蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用 h2o 或 0.9%nacl 配制，酪蛋白用 0 05n naoh配制。（2）雙縮脲試劑：稱以 1.50克硫酸銅（ cuso4?5h2o）和 6.0克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6?4h2o），用 500毫升水溶解，在攪拌下加入 300毫升 10% naoh溶 液，用水稀釋到 1 升，貯存于塑料瓶中（或壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期 保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2. 器材：可見光分光光度計、大試管 15 支、旋渦混合器等。（三）操作方法1. 標準曲線的測定：取 12 支試管分兩組，分別加入 0，0.2

5、，0.4，0.6，0.8， 1.0毫升的標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到 1 毫升，然后加入 4毫升雙縮脲試劑。 充分搖勻后，在室溫（ 2025）下放置 30 分鐘，于 540nm 處進行比色測定。 用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。 取兩組測定的平均值， 以蛋白 質(zhì)的含量為橫座標，光吸收值為縱座標繪制標準曲線。2、樣品的測定：取 23 個試管，用上述同樣的方法，測定未知樣品的蛋白 質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過 10mg/ml。三、folin 酚試劑法（ lowry 法）（一）實驗原理這種蛋白質(zhì)測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方 法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可

6、以訂購），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑， 即 folin 酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯 色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是： 在堿性條件下， 蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合 物。folin 酚試劑中的磷鉬酸鹽 磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基 還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白 的量成正比。folin 酚試劑法最早由 lowry 確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生 物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。 這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高， 比雙縮脲法靈敏得 多，缺點是費時間較長，

7、要精確控制操作時間， 標準曲線也不是嚴格的直線形式， 且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 lowry 反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、 tris 緩沖 液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。 濃度較低的尿素 （0.5%），硫酸納（1%）， 硝酸納（ 1%），三氯乙酸（ 0.5%），乙醇（ 5%），乙醚（ 5%），丙酮（ 0.5%） 等溶液對顯色無影響， 但這些物質(zhì)濃度高時， 必須作校正曲線。 含硫酸銨的溶液， 只須加濃碳酸鈉 氫氧化鈉溶液， 即可顯色測定。 若樣品酸度較高， 顯色后會色 淺，則必須提高碳酸鈉 氫氧化鈉溶液的濃度 12 倍

8、。進行測定時，加 folin 酚試劑時要特別小心，因為該試劑僅在酸性 ph 條件 下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在 ph=10 的情況下發(fā)生，故當 folin 一酚試劑加到堿 性的銅蛋白質(zhì)溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸 磷鎢酸試劑被破壞之 前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達 5mg。通常測定圍是 20250mg。（二）試劑與器材1.試劑（1）試劑甲：（a）10 克 na2co3，2 克 naoh和 0.25 克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6?4h2o）。 溶解于 500 毫升蒸餾水中。（b）0.5克硫酸銅（ cuso4?5h2o）溶解于 1

9、00 毫升蒸餾水中，每次使用前， 將 50 份（a）與 1 份（b）混合，即為試劑甲。（2）試劑乙：在 2升磨口回流瓶中， 加入 100克鎢酸鈉（na2wo4?2h2o）,25 克鉬酸鈉（ na2moo4?2h2o）及 700毫升蒸餾水，再加 50毫升 85%磷酸， 100毫 升濃鹽酸，充分混合，接上回流管， 以小火回流 10小時，回流結(jié)束時， 加入 150 克硫 酸 鋰（ li2so4）， 50 毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰 15分鐘， 以便驅(qū)除過量的溴。 冷卻后溶液呈黃色 （如仍呈綠色， 須再重復(fù)滴加液體溴的步 驟）。稀釋至 1 升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時用標準 n

10、aoh 滴 定，酚酞作指示劑，然后適當稀釋，約加水 1 倍，使最終的酸濃度為 1n 左右。（3）標準蛋白質(zhì)溶液 : 精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 g球蛋白，溶于蒸 餾水，濃度為 250mg/ml 左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用 0.9%nacl 溶 液。2. 器材（1）可見光分光光度計（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管 16 支（三）操作方法1. 標準曲線的測定：取 16支大試管， 1支作空白， 3支留作未知樣品，其 余試管分成兩組，分別加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升標準蛋白質(zhì)溶 液（濃度為 250mg/ml）。用水補足到 1.0毫升，然后每支試管加入

11、5 毫升試劑 甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（ 2025）放置 10 分鐘。再逐管加入 0.5 毫升試劑乙（ folin 酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則 會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置 30 分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試 管作為空白對照，于 700nm 處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫 座標，吸光度值為縱座標，繪制出標準曲線。注意：因 lowry 反應(yīng)的顯色隨時間不斷加深，因此各項操作必須精確控制時 間，即第 1 支試管加入 5毫升試劑甲后，開始計時， 1分鐘后，第 2支試管加入 5毫升試劑甲， 2 分鐘后加第 3 支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲

12、后若已 超過 10分鐘，則第 1支試管可立即加入 0.5毫升試劑乙， 1分鐘后第 2支試管加 入 0.5 毫升試劑乙， 2 分鐘后加第 3 支試管，余此類推。待最后一支試管加完試 劑后，再放置 30 分鐘，然后開始測定光吸收。每分鐘測一個樣品。進行多試管操作時， 為了防止出錯， 每位學(xué)生都必須在實驗記錄本上預(yù)先畫 好下面的表格。表中是每個試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下 的順序，逐管加入。最下面兩排是計算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測得的 吸光度值。folin 酚試劑法實驗表管號4 5 6 7 8 910標準蛋白質(zhì)0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/

13、ml）未知蛋白質(zhì)0.2 0.4 0.6約 250mg/ml )蒸餾水1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4試劑甲5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0試劑乙0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質(zhì)的量（ mg）吸光度值（ a700）2. 樣品的測定：取 1 毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì) 20250微克），按上 述方法進行操作， 取 1 毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。 通常樣品的測定也可 與標準曲線的測定放在一起， 同時進行。 即在標準曲線測定的各試管后面， 再增 加

14、3 個試管。如上表中的 8、 9、 10 試管。根據(jù)所測樣品的吸光度值， 在標準曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量， 從而計算出 樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨 不同的蛋白質(zhì)而變化。 因而本測定法通常只適用于測定蛋白質(zhì)的相對濃度 （相對 于標準蛋白質(zhì)）。四、改良的簡易 folin 酚試劑法（一）試劑1. 試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含 0.5n naoh、 10%na2co3、0.1%酒石酸鉀 和 0.05%硫酸銅，配制時注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后， 最后加入。 2. 試劑乙： 與前面的基本法相同。臨用時加蒸餾水稀釋 8 倍。3. 標準蛋白質(zhì)溶液

15、：同基本法。（二）操作步驟測定標準曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1 毫升，室溫放置 10 分鐘后，試劑乙改為 4毫升。在 55恒溫水浴中保溫 5分鐘。 用流動水冷卻后，在 660nm 下測定其吸光度值。改良的快速簡易法，可獲得與 folin 酚試劑法（即 lowry 基本法）相接近 的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（ bradford 法）（一）實驗原理雙縮脲法（ biuret 法）和 folin 酚試劑法（ lowry 法）的明顯缺點和許多限 制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由 bradford 建立的考馬斯亮蘭法（ bradford 法），是根據(jù)蛋

16、白質(zhì)與染 料相結(jié)合的原理設(shè)計的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點， 因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法?？捡R斯亮蘭 g-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰 的位置（ lmax），由 465nm變?yōu)?595nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng) 研究認為， 染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 （特別是精氨酸） 和芳香族氨基 酸殘基相結(jié)合。在 595nm 下測定的吸光度值 A595 ，與蛋白質(zhì)濃度成正比。bradford 法的突出優(yōu)點是：（1）靈敏度高，據(jù)估計比 lowry 法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達 1mg。 這是因為蛋白質(zhì)

17、與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大， 蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高 的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 lowry 法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程， 大約只要 2分鐘即可完成， 其顏色可 以在 1 小時保持穩(wěn)定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完 全不用像 lowry 法那樣費時和嚴格地控制時間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾 lowry 法的 k+ 、na+、mg2+離子、 tris 緩沖液、糖 和蔗糖、甘油、巰基乙醇、 edta 等均不干擾此測定法。此法的缺點是：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精

18、氨酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此 bradford 法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差， 在制作標準曲線時通常選用 g 球蛋白 為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、tritonx-100、十二烷基硫酸鈉（ sds）和 0.1n的 naoh。（如同 0.1n的酸干擾 lowary 法 一樣）。（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用 beer 定律進行計算，而只能 用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。（二）試劑與器材1. 試劑：（1）標準蛋白質(zhì)溶液， 用 g 球蛋白或 牛血清清蛋白 （bsa），配制成 1.0mg/ml 和 0.1mg

19、/ml 的標準蛋白質(zhì)溶液。（2）考馬斯亮蘭 g250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭 g250，溶于 50ml 95%的乙醇后，再加入 120ml 85%的磷酸，用水稀釋至 1 升。2. 器材：（1）可見光分光光度計（2）旋渦混合器（3）試管 16 支（三）操作方法1. 標準方法（1）取 16支試管， 1支作空白， 3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按 表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用 1.0mg/ml 的標準蛋白質(zhì)溶液給各試 管分別加入： 0、0.01、0.02、0.04、0.06、 0.08、0.1ml，然后用無離子水補充到 0.1ml。最后各試管中分別加入 5.0ml 考馬斯亮蘭

20、g 250 試劑，每加完一管，立 即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未 知樣品的加樣量見下表中的第 8、9、10 管。（2）加完試劑 2-5 分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計上測定各樣 品在 595nm處的光吸收值 a595，空白對照為第 1號試管，即 0.1mlh2o 加 5.0mlg250 試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿， 使用后立即用少量 95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。 塑料比色皿決不可用乙醇或丙 酮長時間浸泡?？捡R斯亮蘭法實驗表管 號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10標準蛋白質(zhì)0 0.01 0.02

21、 0.04 0.06 0.08 0.10（1.0mg/ml）未知蛋白質(zhì)0.02 0.04 0.06（約 1.0mg/ml）蒸餾水0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04考馬斯亮藍g250試劑 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0每管中的蛋白質(zhì)量（ mg）光吸收值a595)（3）用標準蛋白質(zhì)量（ mg）為橫座標，用吸光度值 a595 為縱座標，作圖， 即得到一條標準曲線。由此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的 a595 值，即可查 出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg 牛血清蛋白 /ml 溶液的 a595約為

22、0.50。2. 微量法當樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時（ 10100mg/ml）,可將取樣量（包括補加的水） 加大到 0.5ml 或1.0ml, 空白對照則分別為 0.5ml或 1.0ml h2o, 考馬斯亮藍 g250 試劑仍加 5.0ml, 同時作相應(yīng)的標準曲線，測定 595nm 的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白 /ml 溶液的 a595 約為 0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中， 酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵， 使蛋 白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在 280nm 處，其吸光度（即光密度值） 與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在 238nm 的光吸收值與肽鍵含量成正

23、比。利用一定波長下， 蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系， 可以進 行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度 的鹽，例如生化制備中常用的（ nh4）2so4 等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別 適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測， 因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化， 而 不需知道其絕對值。此法的特點是測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差， 干擾物質(zhì)多， 在用標準曲線法 測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白 質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。 若樣品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等吸收紫外光的物

24、質(zhì)， 會出現(xiàn)較大的干擾。 核酸 的干擾可以通過查校正表， 再進行計算的方法， 加以適當?shù)男Ｕ?但是因為不同 的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的， 雖然經(jīng)過校正， 測定的結(jié)果還是存在一 定的誤差。此外，進行紫外吸收法測定時，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因 ph 的改變而有變 化，因此要注意溶液的 ph 值，測定樣品時的 ph要與測定標準曲線的 ph 相一致。下面介紹四種紫外吸收法：1. 280nm 的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm 處具有最大吸收， 且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測定蛋白質(zhì)溶液在 280nm 處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測定時，將待

25、測蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中， 用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑 （水 或緩沖液）作空白對照，在紫外分光度計上直接讀取 280nm 的吸光度值 a280。 蛋白質(zhì)濃度可控制在 0.11.0mg/ml 左右。通常用 1cm 光徑的標準石英比色皿， 盛有濃度為 1mg/ml 的蛋白質(zhì)溶液時， a280約為 1.0 左右。由此可立即計算出蛋 白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長下的光吸收值（ a11cm）有文獻數(shù)據(jù)可 查，根據(jù)此光吸收值可以較準確地計算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與 （a11cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為 1%，光徑為 1cm 時的光吸收值）的關(guān)系。 文獻值 a11cm,?稱為百分

26、吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度 = (a280 10 )/ a11cm,280nm (mg/ml)(q 1%濃度 ?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ： a11cm=6.3 (280nm)溶菌酶 ：a1 1cm=22.8 (280nm)若查不到待測蛋白質(zhì)的 a11cm 值，則可選用一種與待測蛋白質(zhì)的酪氨酸 和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標準蛋白質(zhì)， 用標準曲線法進行測定。 標準蛋白 質(zhì)溶液配制的濃度為 1.0mg/ml 。常用的標準蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（ bsa）。標準曲線的測定：取6 支試管，按下表編號并加入試劑：3 4561.02.03.0 4.0 5.03.02.01.0 0管號 12b

27、sa(1.0mg/ml)0h2o5.04.0a280用第 1 管為空白對照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計上測定吸光度 a280，以 a280 為縱座標，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（ mg）為橫座標作圖， 標準曲線應(yīng)為直線，利用此標準曲線，根據(jù)測出的未知樣品的 a280 值，即可查 出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用 2至6管 a280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì) 濃度計算出該蛋白質(zhì)的 a11cm,280nm2. 280nm和 260nm 的吸收差法核酸對紫外光有很強的吸收， 在 280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強 10 倍（每克）， 但核酸在 260nm 處的吸收更強，其吸收高峰在 260nm 附近。核

28、酸 260nm 處的消 光系數(shù)是 280nm 處的 2 倍，而蛋白質(zhì)則相反， 280nm 紫外吸收值大于 260nm 的 吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值： a280/a260 ? 1.8純核酸的光吸收比值： a280/a260 ? 0.5含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其 a280和 a260，由此吸收差值，用下 面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度 （mg/ml）=1.45 a280 0.74 a260此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì) （酵母烯醇化酶） 和核 酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的。3. 215nm與 225nm 的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用 280nm 的光吸收測定時，可用 215nm 與 225nm 吸收值之差，通過標準曲線法來測定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。用已知濃度的標準蛋白質(zhì)，配制成 20100 mg/ml 的一系列 5.0ml 的蛋白質(zhì) 溶液，分別測定 215nm和 225nm的吸光度值，并計算出吸收差：吸收差 d= a215 a225以吸收差 d 為縱座標， 蛋白質(zhì)濃度為橫座標， 繪出標準曲線。 再測出未知樣