吸收光檢測原理及應(yīng)用

1、吸收光檢測原理及應(yīng)用 1. 檢測原理 a）布格-朗伯-比爾定律，是光吸收的基本定律，適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質(zhì), 包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。比爾 -朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和 光電比色法的定量基礎(chǔ)。 b）朗伯-比爾定律：0D = ?C光吸收值（0D）與濃度成正比 c）比爾一朗伯定律數(shù)學(xué)表達(dá)式 ：A=lg（1/T）=Kbc A為吸光度,T為透射比，是透射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度K為摩爾吸收系數(shù)它與吸收物質(zhì)的性 質(zhì)及入射光的波長入有關(guān) c為吸光物質(zhì)的濃度b為吸收層厚度 d）物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時，其吸光度A與吸 光物質(zhì)的濃度c及吸收

2、層厚度b成正比。 2. 吸收光的應(yīng)用 a）生物大分子定量：基于 260nm、280吸收光檢測-核酸定量 核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 吸收紫外光的性質(zhì)是嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及 一切含有它們的物質(zhì)，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的性質(zhì)。最佳測量 值的范圍為0.1至1.0。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不 同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于 50卩g / mL 的 dsDNA, 37 卩 g / mL 的 ssDNA, 40 卩 g/mL 的 RNA, 30 卩 g/mL 的寡核苷酸。 ii. A

3、280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估 純DNA的A260/A280比值為1.8,純RNA為2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳 香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。 iii. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估 純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于 2.0表明樣品被碳水化合物 （糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。 iv. A320nm或A340nm為檢測溶液樣品的濁度，該值應(yīng)該接近0.0。假如不是，標(biāo)明溶 液中有懸浮物，需要純化樣品。 v. 核酸的吸光值受 pH值和緩沖液離子濃度影響。

4、只有在一定的 pH值和低離子濃度的 條件下（如10 mM Tris-HCI pH8.0），才能得到精確的檢測結(jié)果。 b）生物大分子定量：基于260nm、280吸收光檢測-蛋白定量 i. 蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在 275280nm 具有一個吸收紫外吸收高峰。 在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從 朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.11.0mg/mL。 ii. 由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋 白質(zhì)溶液在280nm的光吸收值也不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為1.0

5、 mg/mL的1800種 蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在 280nm的吸光度在0.33.0之間，平均值為1.25 0.51。所 以此種方法測量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn) 。 iii. 若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm處來測量蛋白質(zhì)含 量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比 280nm更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰 恰相反，因此可利用 280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質(zhì)的含量。 iv. 常用下列經(jīng)驗公式計算：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） =1.45A280-0.74A260 ; （A280和 A260分別為蛋白質(zhì)溶液在 280nm和260nm處測得的吸光度值） v. 還可以通過下述經(jīng)驗

6、公式直接計算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量： 蛋白質(zhì)濃度（mg/mL） =F* A280*D*1/d ;其中A280為蛋白質(zhì)溶液在 280nm處測得 的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm） ;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子 c）酶聯(lián)免疫吸附實驗-ELISA疾病因子，動物疫病，食品安全 i. 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某 種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的 活性。 ii. 在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟 與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體 復(fù)

7、合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一 定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中 受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的 催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度 。 iii. 如今ELISA方法已被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面， ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結(jié)核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍(lán)舌病 等的診斷中已為廣泛采用的標(biāo)準(zhǔn)方法。 d）細(xì)菌、細(xì)胞生長密度及生長曲線繪制：基于OD600吸光值 i. 單細(xì)胞微生物的發(fā)酵具有四個階段，即I

8、調(diào)整期（延滯期）、n對數(shù)期（生長旺盛 期）、川平衡期（穩(wěn)定期）、w死亡期（衰亡期）。 ii. 生長曲線可表示細(xì)菌從開始生長到死亡的全過程的動態(tài)。不同的微生物有不同的生 長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微 生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。 iii. 測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數(shù)板法、平板菌落計數(shù)法、稱重法和比 濁法等。本實驗 采用比濁法測定，由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可 利用分光光度計測定細(xì)菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值 （OD600）與其對應(yīng)的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生

9、長曲線。注 意，由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測定的生長 曲線的衰亡期不明顯。 e）細(xì)胞的毒性及增值：MTT、XTT、CCK8 i. 檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫 色結(jié)晶甲臢（Zo）（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜 （DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臢（Za），用酶標(biāo)儀在490nm波長處（英文說明書寫的 是570nm）測定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成 正比。根據(jù)測得的吸光度值（ OD值），來判斷活細(xì)胞數(shù)量， OD值越大，細(xì)胞活性 越強(qiáng)（如果是測藥物毒性，則表示藥物

10、毒性越?。?。 ii. XTT作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲臢產(chǎn)物。當(dāng) XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲臢產(chǎn)物的吸光 度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。 優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定 較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。 缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。 iii. Cell Counting Kit簡稱CCK試劑盒，是一種基于 WST-8 （化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝苯 基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒 性的

11、快速高靈敏度檢測試劑盒。 WST-8屬于MTT的升級產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以 被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色 的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450mM波長處測 定OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。 CCK法應(yīng)用非常廣泛，如藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗 以及生物因子的活性檢測等。 f）報告基因：B -半乳糖苷酶、GUS等 i. 報告基因（reporter gene）是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是 一個其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)

12、序列相融 合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利 用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。 ii. B半乳糖苷酶：B半乳糖苷酶由大腸桿菌lacZ基因編碼，可催化半乳糖苷水解。最 大優(yōu)勢是易于用免疫組織化學(xué)法觀測其原位表達(dá)，是最常用的監(jiān)測轉(zhuǎn)染率的報道基 因之一。以鄰一硝基苯一B D半乳吡喃糖苷（ONPG）為底物可用標(biāo)準(zhǔn)的比色法 檢測酶活性，其檢測動力學(xué)范圍為6個數(shù)量級。 氯酚紅一B D半乳吡喃糖苷（CPRG是另一個可用比色法檢測酶活性的底物， 其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和熒光素二半乳糖苷（FDG）為底物則可用 熒光法檢測其活性。此法可檢測單個細(xì)胞的酶活性，并可用于流式細(xì)胞學(xué)（FACS 分析。如以二氧雜環(huán)丁烷為底物，可用化學(xué)發(fā)光法檢測酶活性，其檢測動力學(xué)范圍 最大，靈敏度最高，與用生物發(fā)光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。 iii. gus基因存在于E.coli等一些細(xì)菌基因組內(nèi)，編碼B-葡萄糖苷酸酶。B -葡萄糖苷酸 酶是一個水解酶，以B -葡萄糖苷酸酯類物質(zhì)為底物，其反應(yīng)產(chǎn)物可用多種方法檢測 出來。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此這個基因被廣 泛應(yīng)用于基因調(diào)控的研究中。 g