實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)課件

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)2 工程:通過構(gòu)想、設(shè)計(jì)，按照人們的意愿制作、改造某一事物，以達(dá)到 預(yù)想的目的。 生物工程： 按照工程學(xué)原理，對(duì)生物體或生物大分子進(jìn)行改造或利用，用于生 產(chǎn)、研究、檢定和創(chuàng)造新物種的綜合性科學(xué)技術(shù)。 遺傳（基因）工程 蛋白質(zhì)工程 酶工程 細(xì)胞工程 微生物工程 胚胎工程 組織工程 分子水平分子水平 細(xì)胞水平細(xì)胞水平 組織水平組織水平 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)3 胚胎工程（Embryonic engineering）又稱胚胎技術(shù),是指用工程學(xué)的原理對(duì) 動(dòng)物的胚胎進(jìn)行某種技術(shù)操作或改造，使之獲得人們所需要?jiǎng)游锏囊幌盗猩?物技術(shù)的總稱,包括以下四大技術(shù)體系： 一

2、、胚胎操作基本技術(shù) 1.超數(shù)排卵和卵母細(xì)胞、精子、受精卵的采集 2.體外受精 3.胚胎性別控制 4.胚胎分割 5.胚胎培養(yǎng) 6.胚胎移植 7.胚胎冷凍保存 二、體細(xì)胞克隆技術(shù) 三、干細(xì)胞技術(shù) 四、外源基因?qū)爰夹g(shù) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)4 1 1在畜牧業(yè)方面：在畜牧業(yè)方面：通過建立超數(shù)排卵、受精卵通過建立超數(shù)排卵、受精卵/ /卵母卵母 細(xì)胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體細(xì)胞的采集、體外受精、胚胎切割、胚胎性別控制、體 細(xì)胞克隆以及胚胎移植技術(shù)，加快良種家畜的繁殖和家細(xì)胞克隆以及胚胎移植技術(shù)，加快良種家畜的繁殖和家 畜品種的改良。畜品種的改良。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)5 已在乳腺表達(dá)的

3、生 物活性蛋白并進(jìn)入 臨床2期或3期試驗(yàn)： 抗凝血酶一 抗胰蛋白酶 蛋白C 乳鐵蛋白 乳糖酶 2在生物制藥方面：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將具有藥用價(jià)值的 生物活性蛋白的基因整合到宿主的染色體上，使其在 乳汁、血液、尿液等體液中表達(dá)。通過收集、純化這 些體液中的生物活性蛋白，用于預(yù)防和治療某些人類 的疾病。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)6 3在醫(yī)學(xué)方面：通過建立卵母細(xì)胞的采集、體外 受精、顯微受精以及胚胎移植技術(shù)，用于不孕癥 的治療；通過對(duì)胚胎培養(yǎng)和檢測(cè)，剔除具有遺傳 性疾病的胚胎，達(dá)到優(yōu)生優(yōu)育的目的。 4在生命科學(xué)研究方面：闡明哺乳動(dòng)物早期胚胎 發(fā)生、發(fā)育機(jī)制等基礎(chǔ)理論 5在拯救瀕危野生動(dòng)物方面：通過野生動(dòng)物生

4、殖 細(xì)胞和組織的冷凍保存、體細(xì)胞克隆和胚胎移植 技術(shù)，擴(kuò)大野生動(dòng)物的種群。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)8 胚胎操作的整個(gè)過程局限在胚胎的早期發(fā)育 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)9 解剖取附睪尾部解剖取附睪尾部精子的獲取和培養(yǎng)精子的獲取和培養(yǎng) 1.精子的采集 嚙齒類小動(dòng)物精子的采集大都從體成熟雄性動(dòng)物的附睪獲取。將動(dòng)物 處死后，分離附睪尾部，用眼科剪子在頂端剪一小口，用手指輕柔擠出 濃稠的液滴，置培養(yǎng)液中培養(yǎng)。 大動(dòng)物的精液采集可采用假陰道或電刺激方法促進(jìn)雄性射精，收集精 液。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)10 2.卵母細(xì)胞和受精卵的采集 在哺乳動(dòng)物中獲得卵母細(xì)胞的途徑有兩條： 從體內(nèi)成熟并排到

5、輸卵管中去，需通過處死動(dòng)物或外科手術(shù)獲?。蝗绻诮慌?后，則可獲取受精卵或早期胚胎。 取自屠宰淘汰的或剛死亡的雌性動(dòng)物的卵巢，從卵巢中分離卵母細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)而 得。 小鼠解剖取輸卵管小鼠解剖取輸卵管從輸卵管壺腹部取卵母細(xì)胞從輸卵管壺腹部取卵母細(xì)胞/ /受精卵的方法受精卵的方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)11 3.超數(shù)排卵（Superovolation）技術(shù)： 通過注射激素刺激卵巢大量排卵。經(jīng)超數(shù)排卵處理，動(dòng)物 卵巢大量的卵泡同時(shí)成熟并排出，排卵數(shù)可增加幾倍至十 幾倍，一次可獲得大量的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚胎。 所用激素有促卵泡激素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素 (HCG)和孕馬血清促性腺激素（PMSG）

6、、孕酮和前列腺素 （PG）等，以前三種常用。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)12 檢查陰栓： 妊娠0.5天 中午12時(shí)中午12時(shí)上午8時(shí) 24小時(shí) 24小時(shí) 20小時(shí) 注射PMSG注射hCG 小鼠超數(shù)排卵程序 放到種公鼠籠內(nèi) 受精卵 注射PMSG注射hCG 晚上5-6時(shí)晚上5-6時(shí) 24小時(shí)24小時(shí) 卵母細(xì)胞 采 集 15小時(shí) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)13 q 體外受精（In vitro fertilization）是指成熟精子與卵母細(xì)胞在體 外環(huán)境下完成受精的過程。這一過程包括卵母細(xì)胞的收集或未成熟卵母 細(xì)胞的培養(yǎng)成熟、精子的獲取、獲能處理、受精及受精后胚胎培養(yǎng)等。 q 體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（IVF）

7、又稱試管嬰兒。 二、體外受精二、體外受精 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)14 性別控制的研究，是畜牧業(yè)生物技術(shù)中一項(xiàng)重要的高 新技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，可以使畜牧上大動(dòng)物的繁殖按 照人們的意愿只生產(chǎn)同一性別動(dòng)物。 在醫(yī)學(xué)上，性別控制的研究也具有積極的意義。有的遺 傳性疾病屬于性連鎖遺傳，例如進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良，為X 連鎖隱性遺傳，男性發(fā)病，女性攜帶異常基因但不發(fā)病。 攜帶此致病基因的女性懷孕后如做胚胎性別鑒定，則可避 免男性患兒的出生。 三、胚胎性別控制三、胚胎性別控制 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)15 性別控制技術(shù) 通過對(duì)X精子與Y精子分離以控制性別 在胚胎移植前對(duì)胚胎的性別進(jìn)行鑒定以控制性 別 通過控制飼料特性

8、、受精環(huán)境如改變精液或陰 道的PH值等來控制性別。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)16 （一）分離X精子與Y精子以控制性別 分離X精子與Y精子的依據(jù)：X、Y精子在體積、密 度、電荷、運(yùn)動(dòng)性和DNA含量、表面抗原等方面存 在差異。將X和Y精子分離再通過人工授精可以有 效地達(dá)到性別控制的目的。 目前將X和Y精子分離的方法有沉降法、電泳法、 免疫法和流式細(xì)胞儀法等。流式細(xì)胞儀法是當(dāng)前 分離X、Y精子較準(zhǔn)確的方法，具有重復(fù)性、科學(xué) 性和有效性的特點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)17 應(yīng)用流式細(xì)胞儀分離X 和Y精子的原理： X精子的DNA含量比Y精子 的高。對(duì)于奶牛，X精子 比Y精子DNA含量高3.8， 由于染料著色量

9、與精子 DNA含量成正比，因此X精 子吸收的染料多，發(fā)出的 熒光就比Y精子強(qiáng)。 正常人染色體正常人染色體 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)18 具體的做法是： 先用DNA特異性染料對(duì) 精子進(jìn)行活體染色，然 后精子連同少量稀釋液 逐個(gè)通過激光束。探測(cè) 器根據(jù)精子的發(fā)光強(qiáng)度 把電信號(hào)傳遞給計(jì)算機(jī)， 計(jì)算機(jī)指令液滴充電使 發(fā)光強(qiáng)度高的液滴帶正 電，弱的帶負(fù)電。即X 精子帶上正電荷，Y精 子帶上負(fù)電荷。當(dāng)經(jīng)過 高壓電場(chǎng)時(shí)會(huì)向不同方 向偏轉(zhuǎn)，達(dá)到分離的目 的。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)19 （二）對(duì)胚胎進(jìn)行鑒定以控制性別 在胚胎移植前對(duì)胚胎的部分組織用染色體檢查、 間接免疫熒光法和PCR法進(jìn)行性別鑒定。其中PCR法 因

10、有可靠的操作程序，具有高效、快速的特點(diǎn)，近 年來得到迅速的發(fā)展。 Y染色體短臂上有決定雄性的DNA片段-SRY基因 (sex-determining region of Y-chromosome,全稱:Y 染色體性別決定區(qū))，為胚胎性別鑒定提供了可靠 的途徑。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)20 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)21 受精卵受精卵2 2細(xì)胞胚細(xì)胞胚4 4細(xì)胞胚細(xì)胞胚 8 8細(xì)胞胚細(xì)胞胚桑椹胚桑椹胚囊囊 胚胚 胚胎培養(yǎng)是指將獲得的早期胚胎在體外人工環(huán)境中進(jìn)胚胎培養(yǎng)是指將獲得的早期胚胎在體外人工環(huán)境中進(jìn) 行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預(yù)某一發(fā)育過程的可能性。行培養(yǎng)，以觀察其發(fā)育或人工干預(yù)某一發(fā)育過程的可能

11、性。 四、胚胎培養(yǎng)四、胚胎培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)22 胚胎培養(yǎng)一般應(yīng)用于以下幾個(gè)方面： 1未成熟卵母細(xì)胞通過體外培養(yǎng)，成熟后進(jìn)行體外受精。 2受精卵通過體外培養(yǎng)發(fā)育成各階段的早期胚胎，用于胚 胎移植或胚胎冷凍保存。 3冷凍保存胚胎解凍后，通過體外培養(yǎng)，篩選成活胚胎用 于胚胎移植。 4通過研究胚胎發(fā)育的環(huán)境和條件，不斷完善胚胎培養(yǎng)條 件，揭示胚胎細(xì)胞的生長發(fā)育和分化的奧秘。 目前胚胎培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)可以將未成熟卵在體外成熟，并 通過體外受精發(fā)育成各階段的早期胚胎。即使如此，在體外 胚胎培養(yǎng)也只能發(fā)育到囊胚期，需要在囊胚期前移植到動(dòng)物 的子宮內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)23 -胚胎工程的最后一道工序

12、 將受精卵或發(fā)育到一定時(shí)期的早期胚胎,移植 到受體動(dòng)物生殖管道的一定部位,能在子宮內(nèi)著 床、生長、發(fā)育、分娩、出生仔代動(dòng)物的技術(shù)稱 為胚胎移植。 幾乎所有的胚胎工程技術(shù)在體外完成對(duì)胚胎的 操作后，都需經(jīng)過胚胎移植這一步驟，得到我們 所要的動(dòng)物。 五、胚胎移植五、胚胎移植 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)24 體外培養(yǎng)的胚胎必須移植到同步發(fā)情的雌性動(dòng)物 生殖管道內(nèi)。解決同步發(fā)情的方法有兩種： 1.利用自然同期發(fā)情的母畜，此法在實(shí)踐上較難辦 到； 2.通過注射某些藥物(如孕激素、雌激素等)誘發(fā)同 期發(fā)情。 不同發(fā)育階段的胚胎移植的部位不同。受精卵和 2細(xì)胞胚胎應(yīng)移植到輸卵管內(nèi)，而桑椹胚和囊胚期 胚胎應(yīng)移植到子

13、宮內(nèi)，以跟正常妊娠生殖生理變 化同步。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)25 同一種屬內(nèi)的不同品 種品系可互相進(jìn)行胚 胎移植。如近交系 C57BL/6J小鼠的胚胎 可移植到雌性封閉群 ICR的生殖管道內(nèi)； 日本大耳白兔的胚胎 可移植到雌性新西蘭 兔的生殖管道內(nèi)。這 一特點(diǎn)在畜牧業(yè)特別 有用，如為了加快良 種奶牛的繁殖，可將 良種奶牛的胚胎移植 到普通黃牛的生殖管 道內(nèi)，借腹懷胎。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)26 q 胚胎冷凍保存（embryo cryopreservation）技術(shù) 是指在低溫（-196液氮內(nèi)）條件下利用低溫保護(hù) 劑保存生殖細(xì)胞及胚胎的一門技術(shù)。 六、胚胎冷凍保存六、胚胎冷凍保存 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工

14、程技術(shù)27 （一）胚胎冷凍保存的機(jī)制 q 低溫降低了胚胎內(nèi)的生化反應(yīng)速度。并且溫度越低，保 存時(shí)間就越長。 q 低溫?fù)p傷：如果冷卻速度過慢，胞外溶液中水分大量結(jié) 冰，溶液濃度提高，胞內(nèi)水分大量滲出，導(dǎo)致細(xì)胞的強(qiáng)烈收 縮和細(xì)胞處于高濃度的溶液中時(shí)間過長，從而造成化學(xué)損傷； 如果冷卻速度過快，胞內(nèi)水分來不及通過細(xì)胞膜向外滲出， 胞內(nèi)溶液過冷而結(jié)冰，從而造成物理損傷。 同樣，在復(fù)溫（解凍）過程中，如果復(fù)溫速率不當(dāng)也可能 引起細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰（重結(jié)冰）而損傷。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)28 q 采用低溫保護(hù)劑防止低溫?fù)p傷： 二甲基亞砜（DMSO）、聚乙烯砒咯烷酮(pvp)、甲 醇、乙二醇、羥甲基淀粉（HES）等

15、可以避免或減少結(jié) 冰的程度與速度，降低細(xì)胞周圍未凍結(jié)溶液中的電解 質(zhì)濃度，從而避免或減少胚胎冷凍過程中所發(fā)生的物 理和化學(xué)損傷。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)29 （二）胚胎冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用 1. 應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保種和珍稀或?yàn)l危動(dòng)物 種質(zhì)保存。 應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎的長途運(yùn)輸。 應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物凈化。 應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物育種和野生動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物化。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)30 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)31 q 克?。╟lone）的概念 克隆是指無性繁殖或拷貝。 無性生殖在植物中很常見，在動(dòng)物中過 去認(rèn)為是不可能的。 動(dòng)物克隆是指生物體通過體細(xì)胞核移植 生產(chǎn)出基因型幾乎與供體完全相同的后代。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎

16、工程技術(shù)32 q 核移植（Nuclear transfer）是指將動(dòng)物細(xì)胞的 細(xì)胞核移植到另一個(gè)體的去核卵母細(xì)胞胞質(zhì)中，通 過電激活，使供體核重編程序，形成的重構(gòu)卵發(fā)育 成胚胎，最后通過胚胎移植，使之發(fā)育成個(gè)體。 q 如果受體去核卵和供體移入的核來自同種動(dòng)物， 則稱種內(nèi)核移植，來自不同的種則稱為種間核移植。 q核移植由于沒有經(jīng)過精子和卵子的受精過程，核移 植動(dòng)物的全部遺傳信息來自供體核細(xì)胞，等于是復(fù) 制了提供細(xì)胞核的動(dòng)物，因而把它俗稱為“克隆”。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)33 根據(jù)供體核的來源不同，核移植包括以 下幾種： 胚胎細(xì)胞核移植：未著床的囊胚（未分化） 胚胎干細(xì)胞核移植（未分化） 胎兒成纖

17、維細(xì)胞：出生前的胎兒（未分化或 低分化） 1.成年體細(xì)胞（已分化） 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)34 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)35 加快良種家畜的繁殖速度 與體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合，能制備大家畜 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 拯救瀕危野生動(dòng)物 治療性克隆，用于再生醫(yī)學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)36 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)37 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)38 一、概述 干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的 細(xì)胞。根據(jù)發(fā)育階段，可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cells，ES細(xì)胞)和成體干細(xì)胞(adult stem cells，AS細(xì)胞)。 ES細(xì)胞存在于囊胚期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中，是全能性、無限 增殖的

18、干細(xì)胞，在胚胎的生長發(fā)育過程中具有分化形成胎 兒所有類型細(xì)胞、組織和器官的潛能。 AS細(xì)胞是ES細(xì)胞定植于胎兒和成人的各種組織和器官中的 “種子”，具有自我更新和分化為組織特異細(xì)胞的能力， 即分化為相應(yīng)組織和器官中細(xì)胞的“專能”細(xì)胞，包括神 經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、精 原干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞等。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)39 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)40 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細(xì)胞) 2006 年, Takahashi 等首次發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子基 因能夠使已分化的細(xì)胞重編程回歸到胚胎細(xì)胞狀態(tài)

19、。他們 通過慢病毒載體介導(dǎo)將Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4 4 種 轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)胄∈笃つw成纖維細(xì)胞, 獲得了具有強(qiáng)大 的自我更新能力和分化潛能的多能性干細(xì)胞, 命名為“誘 導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞” (Induced pluripotent stem cells, iPS 細(xì)胞)。這一研究克服了ES細(xì)胞和AS細(xì)胞應(yīng)用 存在的諸多問題，展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景，受到了整個(gè)生 命科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前研究中較為理想的供體細(xì)胞 主要有血細(xì)胞(如T 細(xì)胞和B 細(xì)胞等)、脂肪細(xì)胞和皮膚成 纖維細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)41 二、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞) q 來源：ES細(xì)胞是從胚胎發(fā)育早期囊胚（人胚

20、胎受精后 約5-7天，小鼠胚胎受精后3-4天）中的內(nèi)細(xì)胞群分離 出來的未分化細(xì)胞。 q 內(nèi)細(xì)胞群:具有未分化特性，可進(jìn)一步分裂,分化形成 內(nèi)、中、外三個(gè)胚層。 外胚層將分化為皮膚、眼睛和神經(jīng)系統(tǒng)等， 中胚層將形成骨骼、血液和肌肉等組織， 內(nèi)胚層將分化為肝、肺和腸等。 q 由于內(nèi)細(xì)胞群可以發(fā)育成完整的個(gè)體，因而這些細(xì)胞 被認(rèn)為具有全能性。當(dāng)內(nèi)細(xì)胞群分離出來后在培養(yǎng)皿 中培養(yǎng)時(shí)，我們稱之為ES細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)42 目前除了從目前除了從小鼠、大鼠小鼠、大鼠和和 人人分離得到并建立分離得到并建立ESES細(xì)胞系外，細(xì)胞系外， 還未從其它動(dòng)物的囊胚中分離還未從其它動(dòng)物的囊胚中分離 到到ESES

21、細(xì)胞系。細(xì)胞系。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)43 （二）ES細(xì)胞的培養(yǎng) q ES細(xì)胞的培養(yǎng)條件極其苛刻，對(duì)培養(yǎng)液、試 劑、胎牛血清、水等均需采用胚胎級(jí)，對(duì)培養(yǎng)器 皿等必須清洗干凈。一旦條件不適合，ES細(xì)胞容 易發(fā)生分化，從而失去ES細(xì)胞的特性。 q 未分化ES細(xì)胞的培養(yǎng)一般需要與用絲裂霉素 處理過的成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層（Feeder cell）共 培養(yǎng)，飼養(yǎng)層細(xì)胞為ES細(xì)胞提供細(xì)胞因子來維持 其未分化狀態(tài)。在培養(yǎng)液中加用白血病抑制因子 （Leukemia Inhibitory Factor，LIF）能更有 效地維持未分化的ES細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)44 （三）ES細(xì)胞的鑒定 q ES細(xì)胞是一種正常

22、的胚胎性干細(xì)胞，具有正常的染色體核型和體內(nèi)外分化的潛能。 在建系之初需要對(duì)其核型、分化能力和細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行鑒定 1核型 2體外分化試驗(yàn) 將ES細(xì)胞在無飼養(yǎng)層、低胎牛血清的培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，數(shù) 天后形成胚樣小體（embryoid bodies）的內(nèi)皮樣大型細(xì)胞團(tuán)；向成纖維細(xì)胞、心 肌細(xì)胞以及造血細(xì)胞的分化。 3體內(nèi)分化試驗(yàn) 將ES細(xì)胞懸液注射到同性別小鼠的腹股溝皮下，2周后注射部 位出現(xiàn)腫塊，病理檢查為畸胎瘤。畸胎瘤內(nèi)部有多種細(xì)胞生長，如上皮細(xì)胞、骨骼 肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及干細(xì)胞集落等，也可看到各胚層組 織的分化，如軟骨、肌肉組織、上皮組織及腺體等。 4ES細(xì)胞的標(biāo)志物 O

23、ct-4: Oct-4（也叫Oct-3或Oct3/4）屬POU轉(zhuǎn)錄因子一員，它在全能胚胎干細(xì) 胞(ES)和生殖細(xì)胞表達(dá)。該表達(dá)對(duì)于維持干細(xì)胞的自我更新和多能性是必要的。ES 的分化導(dǎo)致Oct-4的下調(diào)。 SSEAs: 人ES細(xì)胞表達(dá)SSEA-3和SSEA-4，但不表達(dá)SSEA-1。小鼠ES細(xì)胞表達(dá) SSEA-1，但不表達(dá)SSEA-3或SSEA-4。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)45 （四）胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用 1.用于研究哺乳動(dòng)物個(gè)體的發(fā)生發(fā)育規(guī)律 由于ES細(xì)胞可分化為胚胎內(nèi)胚層、中胚層和外 胚層中任何一種類型細(xì)胞，因此可用遺傳標(biāo)記的ES 細(xì)胞(如標(biāo)記半乳糖苷酶基因)注入囊胚腔，通過組 織化學(xué)染色追蹤ES

24、細(xì)胞的分化特點(diǎn)，探索胚胎發(fā)育 過程中細(xì)胞分化、組織和器官形成的規(guī)律。小鼠的 ES細(xì)胞已成為研究哺乳動(dòng)物早期發(fā)育規(guī)律的重要工 具之一。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)46 2.在體外研究細(xì)胞的分化規(guī)律 ES細(xì)胞僅在飼養(yǎng)層細(xì)胞上或在添加白血病抑制 因子(LIF)或白細(xì)胞介素-6(IL-6)的培養(yǎng)液中維持 不分化狀態(tài)。當(dāng)培養(yǎng)液中添加分化誘導(dǎo)劑，如牛黃 酸(RA)、二甲基亞砜(DMSO)、丁酰環(huán)腺苷酸和3-甲 氧基苯甲酰胺等，可誘導(dǎo)ES細(xì)胞發(fā)生不同類型的分 化，通過研究ES的分化特點(diǎn)可揭示細(xì)胞分化和凋亡 機(jī)理。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)47 3.用于研究基因的功能和制備基因敲除動(dòng)物 由于用ES細(xì)胞可進(jìn)行基因打靶，容

25、易獲得 基因敲除或定向插入外源基因的ES細(xì)胞，因此 是基因敲除和基因插入的首選細(xì)胞。 通過篩選獲得陽性細(xì)胞，然后用嵌合體或 細(xì)胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用于研究未 知基因的生物學(xué)功能。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)48 4. 治療人類的某些難治性疾病 人類由于細(xì)胞壞死、退化或功能異常引起的 疾病，如帕金森綜合癥、少年糖尿病和老年癡呆 癥等，已成為醫(yī)學(xué)上尚未攻克的頑癥。利用ES細(xì) 胞可以誘導(dǎo)分化形成新的組織 細(xì)胞的特性，移 植ES細(xì)胞可使壞死或退化的部位得以修復(fù)并恢復(fù) 正常功能。目前，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，用ES細(xì)胞誘 導(dǎo)分化出的某些組織細(xì)胞已成功地治愈糖尿病、 肝衰竭、心衰竭和成骨不良等疑難病癥。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)

26、物胚胎工程技術(shù)49 5.培育出人造組織器官，用于器官移植 隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過ES細(xì)胞體外 誘導(dǎo)分化，還可以培育出人造組織器官，解決目 前臨床上存在的供體器官不足和器官移植后免疫 排斥的問題。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)50 三、成體干細(xì)胞 1. 成體干細(xì)胞（AS細(xì)胞）的來源 AS細(xì)胞位于出生后體內(nèi)分化成熟的組織之中， 具有自我更新和分化潛能，它在分裂時(shí)可產(chǎn)生 兩個(gè)子代細(xì)胞，一個(gè)與原來干細(xì)胞完全一致， 另一個(gè)向前分化，形成相應(yīng)組織的多功能干細(xì) 胞，通過分化增殖和更新衰老細(xì)胞來構(gòu)筑相應(yīng) 的器官，維持正常生理功能?，F(xiàn)在可從骨髓和 血液、胎盤、臍帶、肌肉、大腦、皮膚、脂肪 、滑膜等多種組織中獲取各

27、種多能干細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)51 2. AS2. AS細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化 取所要分離AS細(xì)胞的組織，用酶消化法分散細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。再用各 種技術(shù)從體外培養(yǎng)細(xì)胞中分離AS細(xì)胞，如用免疫磁珠分離系統(tǒng)分離乳腺 AS細(xì)胞。 同ES細(xì)胞一樣，AS細(xì)胞的誘導(dǎo)定向分化需要細(xì)胞因子、激素等刺激，如 IL-l、IL-11、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）等。 通常情況下，供體干細(xì)胞在受體中分化為與其組織來源一致的細(xì)胞。然 而在某些情況下干細(xì)胞的分化并不遵循這種規(guī)律，如神經(jīng)外胚層來源的 NSC能分化為中胚層來源的細(xì)胞如肌細(xì)胞，肌肉干細(xì)胞會(huì)分化為各種血 細(xì)胞系等。 所有干

28、細(xì)胞中，來源于骨髓的干細(xì)胞在多向性分化方面具有較大的潛能 ，分為造血干細(xì)胞(HSC)和骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)52 3. AS細(xì)胞的鑒定 各種AS細(xì)胞都有自己的標(biāo)記物，可利用標(biāo)記物進(jìn)行 鑒定。 4. AS細(xì)胞的應(yīng)用 疾病的替代治療和移植治療 如用造血干細(xì)胞治療白血病，造血干細(xì)胞在體外誘 導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞來修復(fù)受損傷的心肌，治療心力 衰竭。骨髓來源干細(xì)胞及其他來源干細(xì)胞都可以分 化得到成骨細(xì)胞，通過將細(xì)胞與支架材料結(jié)合后移 植于骨骼受損部位，用于修復(fù)骨骼缺損。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)53 四、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞 1.iPS細(xì)胞的來源 iPS 細(xì)胞建立的過程主要包括: 分離和

29、培養(yǎng)宿主細(xì)胞； 通過病毒介導(dǎo)或基因轉(zhuǎn)染的方式將若干個(gè)多能性相關(guān)的 基因（Oct4、Sox2、c-Myc 和Klf4）導(dǎo)入宿主細(xì)胞； 將病毒感染后的細(xì)胞種植于飼養(yǎng)層細(xì)胞上, 用ES細(xì)胞專 用培養(yǎng)體系中培養(yǎng), 同時(shí)在培養(yǎng)液中根據(jù)需要加入相應(yīng) 的小分子化合物，以促進(jìn)重編程。 2.iPS細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)定向分化 其培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)定向分化的條件基本與ES細(xì)胞相同。 3.iPS細(xì)胞的鑒定 iPS 細(xì)胞的鑒定與ES細(xì)胞相同。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)54 如何獲得人ES細(xì)胞 傳統(tǒng)技術(shù) 1. 用病人的皮膚細(xì)胞核移植到人去核卵母細(xì)胞 人卵母細(xì)胞來源問題 2. 用病人的皮膚細(xì)胞核移植到動(dòng)物去核卵母細(xì)胞 倫理問題 新技

30、術(shù) 1. 用ES細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄基因?qū)肴似つw細(xì)胞，直接轉(zhuǎn)化成 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）(2007年） 安全問題 2. miRNAs直接將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPS(2010年） 以病毒為載體，向老鼠的成纖維細(xì)胞中注入4個(gè)基因，將其改造為 細(xì)胞，然后在此基礎(chǔ)上培育出一個(gè)老鼠胚胎，再把它植入代孕實(shí) 驗(yàn)鼠的體內(nèi)。20天后，一只黑色的小老鼠出生。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)55 4.iPS細(xì)胞的應(yīng)用 iPS 細(xì)胞與ES細(xì)胞相比,具有很多優(yōu)勢(shì)。 iPS細(xì)胞的來源更方便、更豐富，可以通過有限的幾個(gè)轉(zhuǎn) 錄因子基因轉(zhuǎn)染直接誘導(dǎo)各種不同動(dòng)物的體細(xì)胞來獲取 多能性干細(xì)胞，而不需要通過ES細(xì)胞途徑，克服了許多 動(dòng)物至今未分離出E

31、S細(xì)胞的問題。 iPS細(xì)胞的產(chǎn)生不需要早期胚胎或者其他配子的參與，克 服了使用人胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的倫理問題，可見iPS細(xì)胞必然 成為未來相當(dāng)長一段時(shí)間內(nèi)的研究熱點(diǎn)。 目前, 科學(xué)家們已經(jīng)成功地從小鼠、大鼠、獼猴、豬和 人的體細(xì)胞中誘導(dǎo)并獲得iPS 細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)56 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)57 將外源基因?qū)氲脚咛?nèi)主要有以下幾種方法：將外源基因?qū)氲脚咛?nèi)主要有以下幾種方法： 一、直接導(dǎo)入受精卵或早期胚胎內(nèi)一、直接導(dǎo)入受精卵或早期胚胎內(nèi) 顯微注射法：顯微注射法： 在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源在顯微鏡下利用玻璃顯微注射針將外源DNADNA直接注入到受體的受精卵直接注入到受體的受精

32、卵 雄性原核內(nèi)。雄性原核內(nèi)。 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法： 將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染受體細(xì)胞時(shí)，外源基因可將外源基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，感染受體細(xì)胞時(shí)，外源基因可 整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)。用于轉(zhuǎn)基因和基因治療。整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)。用于轉(zhuǎn)基因和基因治療。 精子載體法：精子載體法： 將外源將外源DNADNA與動(dòng)物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源與動(dòng)物精子一起孵育，在體外受精過程中由精子將外源 DNADNA帶入卵內(nèi)。帶入卵內(nèi)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)58 二、將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為供體二、將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

33、作為供體 核移植到去核卵母細(xì)胞，發(fā)育成胚胎。核移植到去核卵母細(xì)胞，發(fā)育成胚胎。 1.1.將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞：將外源基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞： 電穿孔法：電穿孔法：細(xì)胞暴露于高電壓時(shí)，細(xì)胞膜為高電壓瞬時(shí)擊穿，從細(xì)胞暴露于高電壓時(shí)，細(xì)胞膜為高電壓瞬時(shí)擊穿，從 而使外源而使外源DNADNA被攝入細(xì)胞中。被攝入細(xì)胞中。 脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體是一種人造膜，將外源脂質(zhì)體是一種人造膜，將外源DNADNA裝入脂質(zhì)體，與培裝入脂質(zhì)體，與培 養(yǎng)細(xì)胞一起溫育，即可將外源養(yǎng)細(xì)胞一起溫育，即可將外源DNADNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。導(dǎo)入受體細(xì)胞。 基因槍法：基因槍法： DEAE-DEAE-葡聚糖介導(dǎo)法：葡

34、聚糖介導(dǎo)法： 磷酸鈣介導(dǎo)法：磷酸鈣介導(dǎo)法： 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)59 2.帶有外源基因的ES細(xì)胞通過崁合體技術(shù)進(jìn)入囊胚 胚胎嵌合是指將遺傳上不同的兩類胚胎或胚細(xì)胞組合起來 ，由此而發(fā)育形成的動(dòng)物稱為嵌合體動(dòng)物。由于嵌合體動(dòng) 物是兩類遺傳背景不同的胚胎發(fā)育形成的，不同細(xì)胞群體 互相嵌合構(gòu)成了器官和組織，但嵌合體動(dòng)物攜帶的兩種遺 傳特性不能同時(shí)遺傳給下一代的同一個(gè)體。究竟哪一個(gè)親 本的遺傳特性能遺傳取決于該親本的細(xì)胞是否在嵌合體動(dòng) 物體內(nèi)分化成生殖細(xì)胞（精子或卵子）。分化成生殖細(xì)胞 的親本的遺傳特性能傳給后代。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)60 嵌合體動(dòng)物的制備： 1.聚合法 用聚合法制作嵌合體動(dòng)物， 是

35、將遺傳上不同（例如毛色不同）的 兩個(gè)816細(xì)胞胚胎用物理方法聚合起 來。 2.注射法 注射法是將胚胎干細(xì)胞或 其他胚細(xì)胞注入桑椹胚或囊胚腔中來 制作嵌合體動(dòng)物。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)61 3.帶有外源基因的體細(xì)胞通過克隆技術(shù)進(jìn)入胚胎 將帶有外源基因的體細(xì)胞作為供體，通過核移 植技術(shù)克隆到去核卵母細(xì)胞，在體外發(fā)育成囊 胚，再移植到假孕動(dòng)物的子宮中。出生后動(dòng)物 的基因型與供體的基因型完全一致。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)62 q 外源基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn) 外源DNA進(jìn)入細(xì)胞后有三種命運(yùn)： 1被胞內(nèi)酶降解。 2以游離狀態(tài)存在。游離的未整合外源DNA只要有真核 細(xì)胞能識(shí)別的啟動(dòng)子、編碼基因以及poly(A)

36、信號(hào)等，一 般都能得到表達(dá)，但隨著細(xì)胞衰老，表達(dá)力下降。這種表 達(dá)不能傳代，稱為暫時(shí)表達(dá)。 3整合到受體細(xì)胞染色體（只有少數(shù)）。整合到受體 細(xì)胞基因組的外源基因，能隨細(xì)胞分裂遺傳到子細(xì)胞，稱 為穩(wěn)定表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)63 顯微注射法顯微注射法 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染逆轉(zhuǎn)錄病毒感染 精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因精子介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因 電穿孔電穿孔 電穿孔電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 磷酸鈣轉(zhuǎn)染磷酸鈣轉(zhuǎn)染 生殖細(xì)胞或生殖細(xì)胞或 早期胚胎早期胚胎 ESES細(xì)胞細(xì)胞 體細(xì)胞體細(xì)胞 隨機(jī)整合隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合或定點(diǎn)整合或 隨機(jī)整合隨機(jī)整合 定點(diǎn)整合或定點(diǎn)整合或 隨機(jī)整合隨機(jī)整合 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)64 外源基因整合到受體

37、細(xì)胞染色體可分為以下兩種情況： 隨機(jī)插入（Random insertion）：外源基因進(jìn)入細(xì)胞 后，隨機(jī)插入到任意的染色體內(nèi)。如果插入到一個(gè)基因內(nèi)， 可能導(dǎo)致該基因的失活。另外，插入外源基因受鄰近調(diào)控序 列的影響，其表達(dá)可能高，也可能低。 定點(diǎn)整合（Targeted integration）：實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合 的前提是外源基因的一端或兩端帶有定點(diǎn)整合部位的同源 DNA序列，即所謂的同源臂（Homologous arm）。當(dāng)外源基 因載體進(jìn)入細(xì)胞后，同源臂序列與宿主染色體上的相同序列 相互靠近，通過同源重組，將外源基因載體置換到染色體相 應(yīng)的位置上，實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)整合。我們把這種技術(shù)形象地稱之 為“基因

38、打靶”。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)65 隨機(jī)整合（Random insertion） 外源基因隨機(jī)插入到染色體的任意部位。 插入到致死基因序列內(nèi)：胚胎死亡 插入到功能基因序列內(nèi)：基因失活 插入到調(diào)控區(qū)下游：外源基因表達(dá)增強(qiáng)/減弱 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)66 q 定點(diǎn)整合（targeted integration） 同義詞：基因打靶（Gene targeting） 是指將基因組的某一基因序列克隆出來并加以 改造，再導(dǎo)入同種細(xì)胞內(nèi)。該基因序列可以與細(xì)胞 基因組內(nèi)的同源序列（靶基因）發(fā)生重組，從而將 改造后的基因置換到基因組內(nèi)，實(shí)現(xiàn)靶基因敲除、 替換或改造。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胚胎工程技術(shù)67 q 同源重組（Homologous recombination