五子衍宗方對環(huán)磷酰胺致小鼠DNA損傷的影響

1、五子衍宗方對環(huán)磷酰胺致小鼠 DNA 損傷的影響摘要：目的 觀察五子衍宗方對環(huán)磷酰胺（ CTX ）致 小鼠 DNA 損傷的影響，并探討其作用機制。 方法 將 BalB/c 小鼠隨機分為正常組、模型組、五子衍宗方低劑量組、五子 衍宗方高劑量組。五子衍宗方低、高劑量組預給藥 1 周后， 除正常組外，其余各組腹腔注射 CTX 100 mg/kg 造模，隔日 1 次，共 3 次，同時五子衍宗方低、高劑量組繼續(xù)給藥，末 次給予 CTX 后 12 h 處死小鼠，分離血清， ELISA 檢測血清 中 8-羥基脫氧鳥苷（ 8-OHdG ）的含量，應用單細胞凝膠電 泳技術檢測骨髓細胞 DNA 損傷。結果 五子衍宗

2、方低、高劑 量組能夠降低血清中 8-OHdG 的含量，使小鼠骨髓細胞彗星 圖像的 Olive 尾矩、尾距、尾長和尾部 DNA 含量降低。 結論 五子衍宗方對 CTX 致小鼠 DNA 損傷具有較好的保護作用。關鍵詞：五子衍宗方；環(huán)磷酰胺； DNA 損傷；小鼠DOI ： 10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.014 中圖分類號： R285.5 文獻標識碼： A 文章編號： 1005-5304（2014）06-0038-03Abstract ： Objective To study protective effects of Wuzi Yanzong Fang on DN

3、A damage induced by cyclophosphamide （CTX） in mice ， and explore its mechanism. Methods BalB/c mice were randomly divided into normal group ， model group ， Wuzi Yanzong Fang low dose group and Wuzi Yanzong Fang high dose group. Mice in Wuzi Yanzong Fang groups were pretreated with Wuzi Yanzong Fang

4、for 7 days ， then the mice in Wuzi Yanzong Fang groups and model group were intraperitoneally injected with CTX ( 100 mg/kg ) every other day for three times ， and mice in Wuzi Yanzong Fang groups were continued administered with Wuzi Yanzong Fang. Animals were sacrificed in twelve hours after the f

5、inal treatment of CTX. ELISA was used to detect 8-OHdG content in serum ， and single cell gel electrophoresis to detect DNA damage in bone marrow cells. Results Wuzi Yanzong Fang low dose group and high dose group reduced the level of 8-OHdG in serum. Wuzi Yanzong Fang significantly decreased Olive

6、tail moment ， tail moment， tail length and tail DNA% in mouse bone marrow cells. Conclusion Wuzi Yanzong Fang has good protective effects on DNA damage caused by CTX.Key words ：Wuzi Yanzong Fang ；cyclophosphamide ；DNA damage；mice環(huán)磷酰胺( CTX )是目前臨床上常用的烷化劑類抗腫瘤 藥，也是一種免疫抑制劑，常用于治療白血病、淋巴瘤和乳 腺癌等多種惡性腫瘤。 然而， C

7、TX 在抑制腫瘤細胞增殖的同 時，對正常細胞具有細胞毒性， CTX 代謝產(chǎn)物能夠和大分子 如蛋白質、 RNA 、DNA 結合，導致 DNA 損傷，從而引起骨 髓抑制、 生殖毒性等不良反應。 CTX 的臨床療效也因此而被 限制，故減少 CTX 在臨床應用中的不良反應非常重要。本 實驗觀察五子衍宗方對 CTX 致小鼠 DNA 損傷的影響， 探討 其作用機制。1 實驗材料1.1 動物40只89周齡SPF級BalB/c種小鼠，體質量2225 g, 湖北省實驗動物中心提供，動物許可證號： SCXK （鄂） 2008-0005。分籠飼養(yǎng)，濕度55%65%，環(huán)境溫度（20 2） C, 12 h 光照，嚙齒類

8、動物飼料喂養(yǎng)，自由飲水。1.2 藥物 五子衍宗方由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味 子組成，原藥材經(jīng)三峽大學汪均植教授鑒定為正品。按照傳 統(tǒng)方法煎取，濃縮至粉末，提取率為 18.8%，臨用前配成相 應濃度的溶液。 CTX 購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司， 批號 13030425。1.3 主要試劑與儀器正常熔點瓊脂糖（ NMA ），低熔點瓊脂糖（ LMA ），肌 氨酸鈉， TritionX-100 ，溴化乙錠（ EB ） ，二甲亞砜（ DMSO ） ， 三羥甲基氨基甲烷（Tris-base），乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2 ）。穩(wěn)流可調式電泳儀 （北京六一儀器廠） ，BX51 型 Olymp

9、us 熒光顯微鏡（日本） 。2 實驗方法2.1 分組、造模與給藥將小鼠隨機分為正常組、模型組、五子衍宗方低（ 100 mg/kg ）劑量組、五子衍宗方高（ 200 mg/kg ）劑量組，每組 8 只。五子衍宗方低、高劑量組預給藥1 周后，除正常組外，其余各組腹腔注射 CTX 100 mg/kg 造模，隔日 1 次，共 3 次， 同時五子衍宗方低、 高劑量組小鼠按照 0.1 mL/kg 繼續(xù)給藥。 2.2 指標檢測2.2.1 血清中 8-羥基脫氧鳥苷測定 末次給予 CTX 后 12 h 處死小鼠，眼球取血后靜置 30 min ，3500 r/min 離心 10 min ， 分離血清， ELISA

10、 測定血清中 8-羥基脫氧鳥苷（ 8-OHdG ） 的含量。222堿性單細胞凝膠電泳 取出股骨，用PBS沖洗骨髓 腔，收集骨髓細胞，過濾，用 PBS 洗滌 2 次后，懸浮于 PBS 中，用細胞計數(shù)板計數(shù)，將細胞懸液調整至細胞密度為1 X106個/mL。在普通載玻片上用玻璃膠粘上小玻璃條，用PBS配制1%的正常熔點瓊脂糖，煮沸后取100卩L均勻鋪在載玻片上，置于4 C,固化5 min即第1層膠，取100卩L于 37 C水浴中保溫的0.5%的低熔點瓊脂糖，與 100卩L骨髓 細胞懸液充分混勻后加入第 1層膠上，置于4 C,固化5 min即第2層膠。將載玻片浸入新鮮配制的4 C的堿性裂解液，4 C冰

11、箱內避光裂解2h。將載玻片從裂解液中取出，用蒸 餾水輕輕沖去多余的鹽分，將凝膠載玻片放入電泳槽中，加 入4 C冰箱預冷的電泳液至蓋過膠面23 cm，避光靜置4 C解旋20 min。調節(jié)電泳儀至電壓 25 V、電流300 mA ,4 C 避光電泳20 min。電泳結束后，將凝膠載玻片從電泳槽中取 出，浸入 pH 7.0 Tris-HCl 中和液中，每 5 min 換液 1次，中 和20 min。在凝膠上滴加溴化乙錠（10卩g/L） 100卩L , 2 min 后用蒸餾水洗滌 2 次，稍微晾干，盡快在熒光顯微鏡下 進行觀察。將染色好的載玻片放在熒光顯微鏡的 40 倍鏡下 觀察拍照，采用 Casp1

12、 .2.3彗星分析軟件對彗星圖像進行分 析。選取彗星圖像的 Olive 尾矩、 尾距、 尾長和尾部 DNA 含 量進行分析。3 統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)均以一 x s 表示，多組間差異比較采用方差分析，以Dunnet-t 檢驗比較2組間均數(shù)的差異。PV0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。4 結果4.1 五子衍宗方對小鼠血清中8-羥基脫氧鳥苷的影響5 討論CTX 是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物和免疫抑制劑。 CTX 和 p-450C 單加氧酶催化，經(jīng)過一系列變化生成磷酰胺氮芥 和丙烯醛。磷酰胺氮芥能與細胞內的大分子如蛋白質、 DNA 、 RNA 發(fā)生烷化作用，形成 DNA

13、鏈內和鏈間的交叉聯(lián)結，從 而干擾體內細胞的分裂增殖 1 。另一方面， CTX 代謝過程中 會產(chǎn)生大量活性氧自由基，自由基中有極為活潑的單電子， 與親核性的 DNA 結合，產(chǎn)生 DNA-DNA 或 DNA- 蛋白質的 交聯(lián)，還會與 DNA 堿基和脫氧核糖發(fā)生化學變化，引起脫 氧核糖分解、磷酸二脂鍵斷裂、堿基降解、氫鍵破壞、引起 單雙鏈的斷裂 2 。機體 DNA 一旦發(fā)生損傷，會通過阻滯細 胞周期修復受損的 DNA ，不能修復的 DNA 則走向程序性死 亡，從而有效識別和清除 DNA 損傷。 DNA 損傷如果沒有即 時得到修復，損傷的積累將會導致機體神經(jīng)退行性病變、衰 老等疾病的發(fā)生，嚴重威脅人類

14、的健康 3 。在體外無活性，進入體內后可以通過肝臟細胞色素p-450B8-OHdG 是 DNA 氧化損傷的產(chǎn)物， 常用來作為 DNA 的 氧化損傷和突變的標志物。體內活性氧自由基如超氧陰離 子、羥自由基等會攻擊 DNA 的鳥嘌呤堿基的第 8 位碳原子， 生成氧化性的加合物 8-OHdG ，生成的 8-OHdG 與腺嘌呤 A 配對，使 DNA 鏈的空間結構和堿基配對發(fā)生改變，從而引 起 DNA 的突變 4 。單細胞凝膠電泳技術是目前廣泛應用的檢測 DNA 損傷 技術，可用于各種細胞及組織的單細胞水平的 DNA 鏈斷裂 的研究。當外界因素造成 DNA 損傷時，細胞膜和核膜在裂 解液的作用下被去除，

15、 蛋白質、 RNA 及其他成分在高鹽溶液 的作用下擴散到裂解液中，只有核 DNA 由于分子量太大留 在原位。在堿性電泳液中電泳， DNA 未損傷則無拖尾現(xiàn)象， 經(jīng)熒光染色后呈圓形；若細胞 DNA 損傷， DNA 雙鏈解旋變 成單鏈，損傷的 DNA 的單鏈及其碎片會向陽極遷移，形成 拖尾，經(jīng)熒光染色后形成形似彗星的圖像。 DNA 損傷越嚴重， 產(chǎn)生的片段越小，碎片越多，彗星尾部越長，亮度越亮。通 過定量分析可判斷 DNA 是否損傷及損傷程度 5-6 。本實驗結果表明， 當給予 CTX 后，小鼠血清中 8-OHdG 含量顯著增加，五子衍宗方組能顯著降低模型小鼠 8-OHdG 含量， 表明五子衍宗方

16、能夠減輕 CTX 引起的小鼠 DNA 的氧 化損傷。同時我們通過單細胞凝膠電泳實驗發(fā)現(xiàn)，與正常組 比較，模型組 DNA 含量、尾距、尾長幾個指標均顯著增加， 而五子衍宗方各組都對 DNA 有保護作用，表明五子衍宗方 能夠顯著保護骨髓細胞的 DNA 免受 CTX 損傷。綜上所述，五子衍宗方能夠抑制 CTX 引起的 DNA 損傷， 促進損傷的 DNA 修復。其機制可能與五子衍宗方提高機體 的抗氧化能力、清除 CTX 代謝過程中產(chǎn)生的自由基及增強 損傷 DNA 修復的能力有關。參考文獻：1 Zhang QH ，Wu CF ， Duan L，et al. Protective effectsof to

17、tal saponins from stem and leaf of Panax ginseng against cyclophosphamide-induced genotoxicity and apoptosis in mouse bone marrow cells and peripheral lymphocyte cellsJ. Food and Chemical Toxicology ， 2008， 46（ 1）：293-302.2 楊明建，孑L福全，展永，等各種自由基清除劑在 Y 射線輻照 DNA 損傷中的作用 J. 核技術， 2007， 30( 4)： 255-258.3 宋宜，孫志賢 .DNA 雙鏈斷裂損傷反應及它的醫(yī)學意義J.生