抗腫瘤藥物實驗法

1、第第1 1節(jié)節(jié) 腫瘤細胞體外篩選方法腫瘤細胞體外篩選方法 一、抗腫瘤藥體外方法 動物模型在抗腫瘤藥物的評價中起重要的 作用，但動物模型費用高，周期長使其不適 合大規(guī)模的抗腫瘤藥物評價。因此抗腫瘤藥 初步篩選首先應采用腫瘤細胞體外實驗方法， 既節(jié)約成本又節(jié)省時間。 1.MTT法 【基本原理】活細胞線粒體中存在的脫氫酶能夠 代謝還原黃色的溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2） -2，5-二苯基四氮唑（MTT）為藍紫色的甲臜； 而死細胞此酶消失，MTT不被還原。 用DMSO溶解甲臜后，570nm處酶標儀測定其吸光 度（OD值）。 OD值與活細胞數(shù)成正比，因此可 根據(jù)OD值推測出活細胞的數(shù)目，了解藥物抑制

2、 或殺傷腫瘤細胞的能力。 【操作步驟】 （1）0.25%胰酶消化對數(shù)生長期細胞，5%10%NBS的RPMI 1640調細胞濃度50000個/ml。96孔板100ul/孔。設溶劑 對照，每組3-6平行孔。37，5%CO2、95%空氣的培養(yǎng) 箱中預培養(yǎng)24h，棄上清。 （2）加藥物5個10倍稀釋的濃度（溶劑常用的有二甲亞砜 和水)，通常為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L。 （3）細胞連續(xù)培養(yǎng)2472h，每孔加入10l 5mg/ml的 MTT溶液（以無血清培養(yǎng)基配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h。 （4）吸去上清。加入200l DMSO，輕輕振蕩以使甲臜完 全溶解。570nm處用酶標儀測

3、定OD值。 （5）計算抑制率(%)=（對照OD-藥物OD）/對照OD*100% 2.XTT法 【基本原理】XTT 是MTT的衍生物，經(jīng)過 活細胞代謝還原成水溶性的代謝產(chǎn)物， 代謝產(chǎn)物的量與活細胞的數(shù)目成正比， 因此利用酶標儀在檢測波長465nm處測定 代謝物的OD值可以推測活細胞的數(shù)量。 數(shù)據(jù)處理方法同MTT法。 【操作步驟】 （1）細胞接種，藥物處理均同MTT方法。 （2）藥物處理2472h后，每孔加50l X T T 溶液（內含5 0 g X T T ，5 l 10mmol/L的電子偶聯(lián)劑 (PMS)）繼續(xù)培 養(yǎng)4h。 （3）96孔培養(yǎng)板振蕩23min后，直接用 酶標儀在465nm波長處測

4、OD值。 【注意事項】 （1）優(yōu)點：XTT代謝產(chǎn)物溶解于水，不需要吸去 上清就可測OD值，簡單方便，減少誤差。 （2）XTT不易被線粒體酶還原，因此同時加入電 子偶聯(lián)劑 (PMS)。 （3）每孔的XTT量不宜加入太多，高濃度的代謝 產(chǎn)物抑制線粒體酶活性。 （4）XTT和PMS現(xiàn)用現(xiàn)配。 3.3.染料排斥法檢測藥物對腫瘤細胞的生長抑染料排斥法檢測藥物對腫瘤細胞的生長抑 制制 【基本原理】 活細胞有排斥染料（如伊紅、臺盼藍、苯胺黑等 染色的能力，而細胞死亡后由于膜完整性遭到破 壞，細胞即被著色。 【操作步驟】 （1）25ml培養(yǎng)瓶中加入細胞4104個、受試藥40l， 終體積4ml， （2）5%CO

5、2，37培養(yǎng)4896h。 （3）取細胞懸液0.4ml，加0.4%臺盼藍液0.1ml，在室 溫作用5min，在15min內，細胞計數(shù)板計數(shù)約200個細 胞中死細胞（藍色）的個數(shù)。 【結果評定】 （1）活細胞率%=（未染色細胞數(shù)/細胞總數(shù)）100%。 （2）將活細胞率與藥物濃度的對數(shù)作圖，可得到S形劑 量反應曲線，計算半數(shù)殺傷濃度（LC50）。 （3）當LC5010g/ml并能重復時，提示藥物應進一步 實驗。 【注意事項】 藥物殺傷細胞作用可能被低估原因： （1）存活細胞可能繼續(xù)繁殖，使活細胞率增高。 （2）死細胞可能過早地崩解，計數(shù)時已不存在， 使死細胞率下降。 4.集落形成法測定藥物對腫瘤克隆

6、原細胞的生 長抑制作用 【基本原理】克隆原細胞指具有持續(xù)增殖能力 的細胞。當單個細胞能連續(xù)分裂6代或以上時， 其后代所組成的群體（集落）含50個以上細胞。 計數(shù)集落可以對克隆原細胞作定量分析。反映 了單個細胞增殖潛力，能較靈敏地測定抗腫瘤 藥物的活性，目前被認為是一種較理想的檢測 方法。 常用的集落形成方法可分為貼壁法及半固體培 養(yǎng)基法。 【操作步驟】 （1）貼壁集落形成：適用于幾乎所有貼壁生長的細胞。 1）生長期貼壁細胞一瓶，胰蛋白酶消化成單細胞懸液， 活細胞計數(shù)，培養(yǎng)基稀釋成50100個細胞/ml。 2）取直徑3335mm培養(yǎng)皿（或15ml培養(yǎng)瓶）或6孔板， 每組3復孔/皿，受試藥20l，

7、稀釋后細胞懸液2ml， 搖勻，5%CO2、37培養(yǎng)箱培養(yǎng)714天。 3）棄上清，PBS洗2次，2ml/次，無水甲醇固定5min， 靜置干燥，用吉姆薩染色或1%結晶紫染色510min后， 用自來水沖洗，室溫干燥，鏡下計數(shù)75m以上的集落。 （2）軟瓊脂集落形成：適用懸浮和貼壁生長細胞。 1）計數(shù)對數(shù)生長期細胞，15% NBS培養(yǎng)液配成1000個/ml細 胞懸液，37溫育。 2）取3335mm培養(yǎng)皿，3復皿，加受試藥20l。 3）取37新鮮培養(yǎng)液9份，加沸水浴中融化的5%瓊脂液1份， 搖勻，加入平皿，每個1ml，混勻置室溫使瓊脂凝固。 4）取預溫的細胞懸液按每9.4ml加5%瓊脂液0.6ml的比例

8、混 勻，加入已鋪底層瓊脂的平皿中，每個1ml，置室溫使瓊 脂凝固。 5）將平皿置5%CO2，37孵育箱中培養(yǎng)710天。 6）鏡下計數(shù)直徑大于75m（50個細胞以上）的集落。 【結果評定】 （1）劑量反應曲線：以集落抑制百分率與劑量對數(shù)作圖， 可以得到一條S形曲線并求出藥物的半數(shù)抑制濃度 （IC50）。 （2）亦可計算各加藥組集落形成率。 5 5、癌細胞分化誘導實驗、癌細胞分化誘導實驗 【基本原理】癌癥屬于細胞分化異常的疾病。惡性腫 瘤存在著明顯的細胞分化受阻。白血病、黑色素瘤、 肝癌、結腸癌、神經(jīng)母細胞瘤等可在體外被某些化合 物誘導分化為正常細胞或近似正常的細胞。這些發(fā)現(xiàn) 為抗腫瘤藥物研究開辟

9、了一條新的途徑。因此，癌的 分化治療已成為癌癥研究的重要前沿方向之一。 分化指標包括形態(tài)學變化、及生化功能變化 。 人早幼粒細胞白血病人早幼粒細胞白血病HL-60HL-60細胞的分化誘導實驗細胞的分化誘導實驗 HL-60HL-60細胞細胞分化為成熟度不同的粒細胞或巨噬細胞 硝基四氮唑藍（NBT）試驗:NBT還原能力應大于50。 形態(tài)學變化的觀察:成熟粒細胞所占比例越高，說明分 化效果越好。 吞噬功能測定:分化誘導劑的吞噬百分率應在50以上。 肝癌肝癌Bel 7402Bel 7402細胞分化誘導實驗細胞分化誘導實驗 【基本原理】肝癌Bel 7402細胞甲胎蛋白（AFP） 在肝癌中分泌量很高。-G

10、T（半乳糖轉移酶） 在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中活性逐漸上升。白蛋白 （ALB）及TAT（酪氨酸轉氨酶）在分化良好細 胞下降。在體外測定這些蛋白的含量及活性， 用以判斷肝癌細胞的分化程度。 AFP及ALB測定 ：AFP、ALB放免測定試劑盒說明 測定AFP及ALB含量 -GT 、TAT測定：紫外可見分光光度法。 第第2節(jié)節(jié) 腫瘤動物模型體內篩選方法腫瘤動物模型體內篩選方法 1.誘發(fā)腫瘤動物模型實驗法 2.自發(fā)腫瘤動物模型實驗法 3.移植性腫瘤動物模型實驗法 4. 轉基因動物腫瘤實驗法 對誘發(fā)腫瘤的評價對誘發(fā)腫瘤的評價 誘發(fā)性腫瘤的病因與由環(huán)境因素所誘致人癌情況相似。 癌細胞增殖動力學在兩者間亦接近，故

11、動物誘發(fā)腫瘤 類似人體腫瘤。 但人癌原因十分復雜，誘癌劑不清，腫瘤的病理組織 學與動物不同，發(fā)生發(fā)展與動物誘發(fā)腫瘤不完全一致。 誘發(fā)腫瘤不僅誘發(fā)需時較長，成癌率不高。多數(shù)內臟 腫瘤不作解剖，難以判斷是否已發(fā)生腫瘤。發(fā)生時間 先后、發(fā)展速度個體差異大。 加之化學致癌物的來源比較困難，并隨著環(huán)境保護意 識的增強對相關的動物實驗室提出了更高的要求和限 止，所以本法不宜作一般抗癌藥物篩選應用. 對移植性腫瘤有效的藥物，可用本法進一步驗證其抗 癌療效。 對自發(fā)腫瘤總的評價對自發(fā)腫瘤總的評價 其腫瘤發(fā)生率與瘤細胞動力學特點與人癌近似，生長 較移植腫瘤慢，對藥物敏感度不高，療程較長，故便 于進行綜合化療的研

12、究； 理論上用帶有自發(fā)腫瘤模型篩選藥物較理想。然而， 動物自發(fā)腫瘤的病因取決于的遺傳特性，與人癌病因 區(qū)別較大。 很難在限定期間內得到大量生長均勻的帶瘤動物，各 動物腫瘤之間生長速度差異也較大，給評價帶來困難。 此類腫瘤常用于特殊目的試驗或作為“二級篩選”模 型。 對轉基因小鼠腫瘤模型的評價對轉基因小鼠腫瘤模型的評價 該模型較好地再現(xiàn)了人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的完整 變化，包括機體從正常演變?yōu)榘┣安∽冞M而發(fā) 展為惡性腫瘤的全過程，該模型也為相關基因 與腫瘤的關系在整體水平研究和基因藥物的研 發(fā)提供了良好的手段。 但腫瘤的發(fā)生受到一個或多個基因的協(xié)同調控 的，與轉基因小鼠腫瘤模型不同； 該模型同樣存在實

13、驗周期長、腫瘤發(fā)生時間不 齊、繁育能力較低以及成本較高等缺點。 移植性腫瘤實驗法移植性腫瘤實驗法 動物移植性腫瘤實驗法是最通用的抗腫瘤方法， 比自發(fā)性、誘發(fā)性及轉基因動物腫瘤容易造模, 成功率高（100），且能同時獲得大量生長 相對均勻腫瘤。 一般給藥7-10天，第8-11天解剖動物。 觀察指標：一般狀況，體重變化及死亡率，判 斷藥物是否有明顯的抑制腫瘤生長的作用，為 抗癌藥物臨床療效提供有意義的依據(jù)。 動物移植性腫瘤是任何體外試驗不能代替的。 一種藥物未必對各種類型的移植性腫瘤有 效，選擇某一瘤株供篩選都可能漏篩藥物。 動物腫瘤的生物學特點與人類有較大的差 距，動物瘤株惡性程度高，生長迅速，

14、對 藥物的敏感性比人類自發(fā)的癌瘤高得多， 因此，對動物腫瘤生長有抑制的藥物對人 癌不一定有效。本法的命中率低。 篩選藥物時最好采用三種瘤株，即肉瘤、 腹水型腫瘤和白血病株腫瘤。 國內用肉瘤S180、艾氏癌腹水型EAC和 L615白血病，目前L615往往以P388或 L1210小鼠白血病株取代。 我國對新藥在第一輪篩選有效的基礎上， 推薦人癌異種模型進行第二輪篩選，即人 癌進行T細胞免疫缺陷或免疫抑制裸鼠異 種移植模型。 1.1動物選擇動物選擇 常用小鼠、大鼠和地鼠。每批實驗用同一性別（但乳癌、常用小鼠、大鼠和地鼠。每批實驗用同一性別（但乳癌、 卵巢癌、宮頸癌等必須用雌性）。卵巢癌、宮頸癌等必須

15、用雌性）。 1.2腫瘤移植腫瘤移植 (1)一般要求一般要求 無菌、低溫無菌、低溫（消毒不嚴、瘤塊污染常是接種失敗的主消毒不嚴、瘤塊污染常是接種失敗的主 要原因）要原因） 接種部位接種部位: 皮下接種皮下接種(右前肢腋右前肢腋);肌肉接種肌肉接種(大腿肌肉部大腿肌肉部); 腹水型接種腹水型接種(腹腔腹腔)。 (2)瘤塊制備瘤塊制備：取接種7-10天、生長旺盛且無潰 破瘤源。消毒，切開皮膚、瘤生長良好（無壞死 或液化），放入無菌平皿，剪成2-3mm3小塊。平 皿應置于冰上。無菌套管針抽吸或向套管針內塞 進一小瘤塊。一般應在30min內接種完畢。 (3)瘤細胞懸液的制備瘤細胞懸液的制備：數(shù)個瘤塊混合

16、，剪成小 塊，用玻璃組織勻漿器研磨，生理鹽水適量稀釋 成l：3或l：4的瘤細胞懸液。 (4)腹水型腫瘤懸液的制備 1)抽取腹水：選擇接種后7-10天瘤源動物，腹水 應為乳白色濃稠液體(如黃色或有大量紅細胞則棄 去)。 2)細胞計數(shù)：用白細胞計數(shù)法計瘤細胞總數(shù)。 3)接種：腹水用無菌生理鹽水或含葡萄糖的平衡 鹽水(如Hanks液、Gey液等)稀釋至適當?shù)臐舛?（1107 /ml ），ip每鼠0.2ml。 (5)白細胞瘤株的接種：腹水型白細胞瘤如P388及 L1210的接種同腹水型腫瘤接種法。 1.3 移植性動物腫瘤的質量鑒定 (1)每年進行一次實驗動物瘤株的組織學檢查。 (2) 接種前置37培養(yǎng)

17、箱內以檢查細菌，霉菌;在接 種和傳代過程中，必須嚴格無菌操作，防止感染。 (3)腫瘤生長潛力的檢查 1)實體瘤：若對照組中20腫瘤400mg或平均重量 80。陰 性對照組腫瘤為2g左右。 (3)試驗組動物體重不低于原始體重的20，否則 表示試藥劑量過高，需降低劑量重試。 1.10.3肌肉接種大鼠Walker癌肉瘤W256模型 【操作步驟】 (1) Wistar大鼠，55-65g。后腿肌內接種瘤細胞懸液 0.2ml(約2-4106個瘤細胞),每組用6-10只動物. (2)接種分組給藥同前。至第8-11天，處死動物，將 雙側后肢從髓關節(jié)處剪下，分別稱重，荷瘤肢重 減去正常肢重即為瘤重。 【結果計算

18、】按荷瘤宿主瘤重抑制率公式計算。 注意事項注意事項 (1)本法也適用于S180及EAC等腫瘤。 (2)接種用瘤源有兩種：一種取用腹水型瘤源，取 傳代6-8天的瘤源，抽出的腹水應帶有血性；另一 種取用皮下接種的腫瘤以勻漿法制成瘤細胞懸液。 (3)對照組肌肉型平均瘤重為3-5g；皮下型平均瘤 重為3-12g；腹水型平均生存l0-14天。 (4)d7給藥動物存活率65,否則劑量過大。 1.10.4 足趾皮下接種小鼠Lewis肺癌模型 【基本原理】惡性程度較高，受體鼠為C57BL/6， SC、IM接種對藥物的敏感性較低，自發(fā)轉移肺。 接種于后足趾皮下后，待腫瘤生長10d，切除帶瘤 足趾稱重，計算抑制率

19、。 【操作步驟】取皮下接種8-12d的腫瘤，制成 1107/ml 懸液,足趾皮下接種5105/0.02ml，接 種于C57BL/6,18-24g，6-7Wk。 給藥后，次日處死動物，將帶瘤后足趾從足關節(jié) 處剪下，分別稱取荷瘤足趾重，與陰性對照組比 較，計算抑瘤率。 【結果計算】計算腫瘤抑制率. 【注意事項】 (1)Lewis肺癌由于其接種的部位不同，可觀察抑瘤 率、生命延長率、自發(fā)肺轉移。 (2)Lewis肺癌對環(huán)磷酰胺及亞硝脲敏感，對5-Fu及 博來霉素的敏感性稍差。 (3) Lewis肺癌的足趾接種具有兩種意義：一是直 接取荷瘤的足趾測算樣本對原發(fā)灶的抑瘤率；繼 續(xù)給藥又可觀察樣本對自發(fā)肺

20、轉移的效果。 (4)本實驗只適用于宿主為近交系的腫瘤模型，因 接種的細胞量偏少，若應用于非近交系動物，腫 瘤的生長將會出現(xiàn)較大的偏差，結果難以統(tǒng)計。 1.10.5 人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型 【基本原理】裸鼠又稱無胸腺小鼠，具有先天性胸 腺缺失；胸腺依賴性免疫功能缺乏，其T細胞功能 接近于零，但B細胞功能基本正常，體內不具排 斥反應，故是人體腫瘤異種移植的理想宿主。 異種移植于裸鼠體內的人體腫瘤仍保持其原有的 組織形態(tài)及生化功能，以及特有的染色體組型和 對抗腫瘤藥原有的敏感性。 一般認為人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型對抗癌 藥的反應與臨床有較好的相關性，對臨床療效有 重要的參考價值。 【操作步

21、驟】 (1)人體腫瘤異種移植于裸鼠的瘤源： 一是已建株的人體腫瘤異種移植于裸鼠的模型，腹水 型或實體型，與移植性動物腫瘤模型一樣進行操作。 二是培養(yǎng)的各種病理類型人體腫瘤細胞。 (2) 經(jīng)一定的潛伏期，可見腫瘤生長。待腫瘤增殖至可 觸及時(瘤結節(jié)約400mg)，將動物隨機分組，進行治 療。亦可在腫瘤接種后次日即分組治療。 【結果計算】 (1)計算給藥組腫瘤抑制率、生命延長率。 其計算方法同移植性動物腫瘤模型。 (2)裸鼠因皮膚無毛，可便于用卡尺從體外 測量腫瘤的體積，易于動態(tài)觀察腫瘤的生 長狀態(tài)，比較治療組和對照組腫瘤增殖曲 線的變化。每次測量腫瘤的長徑(L)和短徑 (W)根據(jù)下列公式計算腫瘤

22、體積(V)： V=(Lw2)/2。 【注意事項】 (1)裸鼠因T細胞免疫缺陷的特性，故對外界的環(huán) 境非常敏感，因此裸鼠一定要飼養(yǎng)于無特殊病原 體(SPF)的環(huán)境，至少需飼養(yǎng)于層流架內，其飼養(yǎng) 籠需附帶有濾膜的蓋。所接觸和使用的器具、飼 料、飲水、墊料、籠具均預先用高壓滅菌處理過。 所用的試藥也應無菌處理。實驗操作也應在層流 柜內進行。 (2) 價格比較昂貴，實驗所需代價高。一般要在 試藥通過動物移植性腫瘤有效的基礎上再進行本 實驗的試驗。 (3)異種移植于裸鼠體內的人體腫瘤因仍保持其原 有的腫瘤特性，故其生長周期相對較動物腫瘤模 型為長，因此，有關給藥的方案，尤其是給藥的 時間和周期因瘤株而異

23、。 1.10.6小鼠腎囊膜下腫瘤移植法 1.10.7抗轉移模型的舉例 1.10.7.1 Lewis肺癌自發(fā)肺轉移模型 1.10.7.2 B16小鼠黑色素瘤人工肺轉移模型 1.10.7.3小鼠Hep肝癌脾內移植后肝轉移模型 1.10.8癌侵襲的動物模型 1.10.8 .1癌骨侵襲大鼠walker-256模型 1.10.8 .2腎侵襲小鼠宮頸癌U14模型 1.10.9原位移植癌動物模型 1.10.9.1小鼠膠質母細胞瘤G422腦原位瘤試驗法 1.10.9.2大鼠肝癌BERH一2肝原位移植癌試驗法 1.10.9.3人胃癌SGC一7901裸鼠原位接種模型 ， 1.10.10 W256肝內接種介入治療的

24、模型 1.10.11癌分化誘導的動物模型等。 四、四、轉基因動物腫瘤模型轉基因動物腫瘤模型 轉基因動物腫瘤模型（Tumor models of transgenic animal）是指通過重組DNA技術將 外源腫瘤基因或相關基因導入動物染色體基因 組，使之穩(wěn)定表達并能遺傳給后代的一類腫瘤 動物模型。轉基因方法主要有顯微注射法、精 子載體法、電轉移、胚胎干細胞移植法、反轉 錄病毒感染法、人工酵母染色法等多種方法。 用轉基因技術構建的腫瘤模型可為腫瘤研究提 供理想的動物模型，為深入研究其發(fā)病機制以 及基因藥物的等創(chuàng)造了前所未有的條件，為人 類精確地研究基因與疾病的相關關系提供了可 能。但轉基因動物

25、腫瘤模型也存在一定的穩(wěn)定 性，長期繁育傳代過程中會發(fā)生性狀的改變， 甚至丟失。胚胎或精子的冷凍保存技術的應用 可避免這種現(xiàn)象的發(fā)生。并在發(fā)育和研究中加 強對動物腫瘤生長的生物學特性觀察，同時利 用PCR技術檢測外源腫瘤基因在動物體內的表 達，以防外源腫瘤基因的丟失。 （一）（一）乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBVHBV）轉基因動物腫瘤轉基因動物腫瘤 模型模型 （二）（二）乳腺癌轉基因小鼠模型乳腺癌轉基因小鼠模型 三、體外腫瘤細胞遷移、侵襲能力檢測模型三、體外腫瘤細胞遷移、侵襲能力檢測模型 （一）（一）細胞劃痕實驗細胞劃痕實驗（Wound healing assayWound healing a

26、ssay） 【基本原理】上皮細胞，成纖維細胞，腫瘤細胞等，在生理狀態(tài) 下，常形成單層或者復層上皮細胞。在病理狀態(tài)下，細胞遷移的時 候則以側向運動為主。細胞劃痕實驗是將細胞單層培養(yǎng)在培養(yǎng)板上 ，待細胞融合后機械性地使小片細胞脫落，然后繼續(xù)培養(yǎng)細胞，觀 察細胞向無細胞的劃痕區(qū)域遷移情況的實驗，很好的模擬了這種側 向遷移運動，一直被用來檢測細胞的遷移能力。 【操作步驟】 （1） 準備：所有能滅菌的器械都要滅菌， 直尺和Marker筆操作前要在超凈臺內紫外照射 30min。 （2） 用Marker筆在6孔板背后，用直尺 比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.51cm一道， 橫穿過孔。每孔至少穿過5條線 （3

27、） 向孔中加入約106個細胞，因細胞 增殖能力不同而略有不同，37, 5% CO2孵育 過夜，使細胞貼壁，鋪滿板底即可。 （4） 第二天，用200l的槍頭在細胞表 面進行劃痕，槍頭應盡量垂直于孔背后的橫線， 可用直尺比著，槍頭要垂直。 （5） 用PBS洗滌細胞3次，清除劃下的細 胞，然后加入低血清培養(yǎng)液（含1%2%FBS）， 放入孵箱，37, 5% CO2孵育。 （6） 在024h內取不同的時間點拍照， 通過計算劃痕區(qū)域內無細胞區(qū)的面積統(tǒng)計細胞 遷移情況。 【結果判定】比較各組劃痕區(qū)域內的細胞數(shù)目 多少、計算劃痕區(qū)域內無細胞區(qū)的大小或面積。 【注意事項與模型評價】劃痕法的優(yōu)點：價格 低廉，操作

28、簡單，細胞外圍環(huán)境簡單，容易控 制。劃痕法的不足：對細胞的要求高，適用的 細胞系范圍較窄。劃痕實驗要求細胞本身具有 較強的遷移能力，且對無血清的培養(yǎng)環(huán)境有較 強的忍受力，因此只適用于上皮、纖維樣細胞 系和部分腫瘤細胞系。 （二）（二）TranswellTranswell （BoydenBoyden小室）實驗小室）實驗 Transwell準確的說應該是一種實驗技術，這 項技術的主要材料是Transwell小室或Boyden 小室，是一類有通透性的杯狀的裝置，杯子底 層的一張有通透性的膜，這層膜帶有微孔，孔 徑大小有0.112.0m，根據(jù)不同需要可用不 同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜 （polyc

29、arbonate membrane）。應用不同孔徑 和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進行共 培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種 方面的研究。 1.Matrigel侵襲實驗 【基本原理】腫瘤侵襲基底膜被認為是轉移發(fā) 生過程中的一個關鍵環(huán)節(jié)。腫瘤細胞最初穿過 基底膜是它們侵入淋巴系統(tǒng)或血管床的開始， 隨后腫瘤細胞通過血行散播或淋巴轉移進入靶 器官/組織，最終形成轉移灶。 為了體外分析評估腫瘤細胞的侵襲能力，人們 研發(fā)了多個系統(tǒng)來評估細胞侵襲穿過基底膜的 能力。一些實驗利用組織的基底膜提取物，例 如羊膜、雞絨(毛)膜尿囊膜、晶狀體囊膜和膀 胱壁等。然而，由于組織本身的異質性，這些 基質的實驗

30、重復性并不理想。而且，提取這些 基質通常需要很長時間，技術上也很復雜。因 此，人們研制出了同質性更好的細胞外基質來 用于體外侵襲實驗的研究。 其中應用最廣泛的就是Matrigel從一種富含細 胞外基質蛋白的小鼠EngelbrethHolmSwarm 肉瘤中提取的可溶性的基底膜。它主要包含層 黏連蛋白型膠原、硫酸類肝素蛋白多糖等多 種基底膜組分。在實驗室里，Matrigel加工應 用起來相對簡單。 這部分的侵襲實驗檢測的是細胞黏附在基質膠 上，侵襲進入和穿過基質，繼而朝向趨化因子 的方向遷移的能力。這些步驟被證明是腫瘤轉 移的關鍵環(huán)節(jié)。 【操作步驟】 （1） Matrigel膠包被小室的制備 1

31、）解凍未開封的Matrigel溶液，置于冰上放 入冰箱里，至少6h，推薦過夜解凍。遇冷所有 的細胞培養(yǎng)板、Transwell小室或Boyden小室、 無菌吸量管、小管。除非有所提示，否則所有 的步驟都應該在無菌條件下進行。 2）搖動瓶子使Matrigel更好溶解。吸取適量 Matrigel稀釋到所需要濃度。起始濃度可選擇 1.2 mg/ml,0.6 mg/ml,0.3 mg/ml等，溶解于 無血清培養(yǎng)基中。吸出5ml待用，剩余 Matrigel應立即儲存在20。 3）室溫無菌環(huán)境下，小心的吸取Matrigel溶 液于小室膜的上方，輕輕轉動小室，確保膜的 上表面完全被包被住。（6孔板加入300

32、l， 12孔板加入100l，24孔板加入40l）。在 Matrigel上方非常小心的覆蓋適量無菌雙蒸水 （6孔板加入200 l，12孔板加入100l，24 孔板加入50l）。每組應至少做3個復孔。同 時應準備無Matrigel的小室作為對照，以下步 驟相同。 4）將包被好Matrigel的小室置于37細胞培 養(yǎng)箱中，通常30min1h。 5）再水化Matrigel層：加入37無血清細胞 培養(yǎng)基于細胞培養(yǎng)板內（6孔板加入600 l， 12孔板加入200l，24孔板加入75l），孵 育Matrigel使其再水化約2h。對照小室同樣進 行此步驟的孵育。 （2）胰酶消化法從培養(yǎng)瓶中獲取細胞，用含 1%

33、FBS的培養(yǎng)基洗滌三遍，再用含1%FBS的培養(yǎng) 基懸重細胞，使細胞的濃度達到（15）105 個/ml. （3）Matrigel侵襲分析 1）在下室中（濾膜下方）加入含有5%10%胎 牛血清的細胞培養(yǎng)基，可根據(jù)需要在培養(yǎng)基中 下室加入纖維黏連蛋白，濾膜和下室培養(yǎng)基之 間應該不存在氣泡。 2）在對照孔的膜上方或實驗組的Matrigel上 方輕輕加入適量細胞懸液（6孔板加入2ml，12 孔板加入1ml，24孔板加入0.25ml）。 3）在37，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育一定時間（根 據(jù)細胞遷移能力和實驗要求選擇孵育時間，例 如可以選擇12，24，36，72h等）。 （4）結晶紫染色法收集下室細胞，并統(tǒng)

34、計遷 移到下室的細胞數(shù)。 1）用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞 2）從培養(yǎng)板中移去Transwell小室，倒置，風 干。 3）培養(yǎng)板中加入500l 0.1%結晶紫，將小室 置于其中，使膜浸沒在培養(yǎng)基中，37孵育 30min后取出，用PBS清洗。 4）將小室正置于載玻片上，在倒置顯微鏡下 觀察細胞，照相，計細胞數(shù)。 5）在培養(yǎng)板中加入適量33%醋酸，將小室置于 其中，使膜浸沒在液體中，振蕩10min后取出 小室，將培養(yǎng)板置于酶標儀上測570nm的OD值， 間接反應細胞數(shù)。 【注意事項與模型評價】 （1）常用于Transwell侵襲實驗的細胞培養(yǎng)板 有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔板為最 常

35、 用 。 根 據(jù) 實 驗 需 要 選 擇 不 同 孔 徑 的 Transwell小室。 （2）Transwell侵襲實驗應選擇有侵襲力的細 胞。 （ 3 ） 膜 的 下 室 面 可 涂 上 纖 維 黏 連 蛋 白 (fibronectin，F(xiàn)N，Sigma有售)，這樣做的目 的是使穿過膜的細胞更好地附著在膜上，也可 用膠原（collagen）或明膠（gelatin）。 （4）常用的染色方法還包括臺肦藍染色、 Giemsa染色、蘇木精染色、伊紅染色等。若已 將腫瘤細胞用熒光標記，則可收集細胞后用流 式細胞術檢測熒光標記的細胞數(shù)量。 （5）也可不用Matrigel包被濾膜，而是直接 在上室中加入細

36、胞懸液，在下室中加入血清、 某種趨化因子或另一種細胞懸液等，檢測不同 因素對細胞遷移和趨化作用的影響。 （6）上層培養(yǎng)液：采用無血清培養(yǎng)基，為維 持滲透壓，需加入0.05%0.2% BSA；下層培 養(yǎng)液：下層常用含5%10% FBS的培養(yǎng)基，具 體濃度根據(jù)細胞侵襲力而定，侵襲力弱的細胞 可適當提高FBS濃度。 第第1 1節(jié)節(jié) 腫瘤細胞體外篩選方法腫瘤細胞體外篩選方法 一、抗腫瘤藥體外方法 動物模型在抗腫瘤藥物的評價中起重要的 作用，但動物模型費用高，周期長使其不適 合大規(guī)模的抗腫瘤藥物評價。因此抗腫瘤藥 初步篩選首先應采用腫瘤細胞體外實驗方法， 既節(jié)約成本又節(jié)省時間。 2.XTT法 【基本原理

37、】XTT 是MTT的衍生物，經(jīng)過 活細胞代謝還原成水溶性的代謝產(chǎn)物， 代謝產(chǎn)物的量與活細胞的數(shù)目成正比， 因此利用酶標儀在檢測波長465nm處測定 代謝物的OD值可以推測活細胞的數(shù)量。 數(shù)據(jù)處理方法同MTT法。 【操作步驟】 （1）貼壁集落形成：適用于幾乎所有貼壁生長的細胞。 1）生長期貼壁細胞一瓶，胰蛋白酶消化成單細胞懸液， 活細胞計數(shù)，培養(yǎng)基稀釋成50100個細胞/ml。 2）取直徑3335mm培養(yǎng)皿（或15ml培養(yǎng)瓶）或6孔板， 每組3復孔/皿，受試藥20l，稀釋后細胞懸液2ml， 搖勻，5%CO2、37培養(yǎng)箱培養(yǎng)714天。 3）棄上清，PBS洗2次，2ml/次，無水甲醇固定5min， 靜置干燥，用吉姆薩染色或1%結晶紫染色510min后， 用自來水沖洗，室溫干燥，鏡下計數(shù)75m以上的集落。 (4)腹水型腫瘤懸液的制備 1)抽取腹水：選擇接種后7-10天瘤源動物，腹水 應為乳白色濃稠液體(如黃色或