細菌室操作手冊

1、臨床細菌檢驗工作的基本要求和技術一、 對臨床細菌檢驗人員的要求1 負責鑒定及簽發(fā)報告的主管技術人員應通曉診斷細菌學的全面知識。2 一般細菌室工作人員均應具備細菌傳染、消毒、滅菌的知識。3 通曉細菌室守則，并嚴格遵守。4 負責人應不斷更新知識，了解細菌學檢驗的新進展。5 定期或隨時與臨床醫(yī)師聯(lián)系，主動參與臨床病例討論，了解病情及治療情況，達到細菌檢驗與臨床的密切聯(lián)系。6 工作人員應定期進行健康體檢及必要的預防接種，增強自身抵抗能力。二、工作人員守則 在細菌室工作人員應注意，既不要給室內帶來污染，也不要被室內的微生物感染。工作人員必須遵守以下規(guī)則：1 穿專用的工作衣、帽入室；必要時應戴口罩。2 不

2、允許無關人員進入實驗室。3 室內禁止飲食、吸煙、閑談等非專業(yè)活動。4 養(yǎng)成在室內手不觸及口、臉、頭發(fā)及軀體的習慣。5 操作中不可說話，以免口中飛沫污染標本。6 每次完成工作和離開實驗室前，應用肥皂洗手，接觸了致病菌類，須用消毒劑消毒手。7 個人物品不許帶入室內。8 當工作環(huán)境被細菌培養(yǎng)物污染，必須用適當?shù)膹娤疽簼娙龈采w污染物，并報告主管人員采取必要的措施。9 工作人員被細菌培養(yǎng)物污染，應用弱或中等消毒劑清洗，必要時應給予藥物治療，并向主管負責人報告，進一步采用特殊措施?；救旧椒?染色的第一步是制作涂片。菌液涂片時，用接種環(huán)沾取菌液點在載玻片上，標本可直接在玻片上涂布。菌落涂片時，先取生理

3、鹽水 1滴，置玻片上，用接種針挑取菌落，在鹽水中涂布。涂片時必須注意應輕輕操作。猛烈的動作會改變菌細胞原有的排列形式，或造成細菌鞭毛脫落，影響結果的準確性。制備的涂片應自然干燥，并經火焰固定，固定溫度不宜過高，以玻片背面接觸手背不燙為準，否則可能使細胞形態(tài)改變。將固定后的涂片進行染色。一、革蘭染色本染色是最基本的染色法，可用于標本涂片或菌落涂片。染色結果將細菌分為革蘭陽性(紫色)和革蘭陰性(紅色)兩類。試劑1. 結晶紫溶液 a液：結晶紫2g 95乙醇20ml b液：草酸銨 0.8g 蒸餾水 80ml 需在用前24h將a液、b液混合，過濾后裝入試劑瓶內備用。2碘液碘 1g碘化鉀 2g蒸餾水 30

4、0ml碘與碘化鉀混合并研磨，加入幾毫升水，使其逐漸溶解，然后研磨，繼續(xù)加入少量蒸餾水至完全溶解。最后補足水量。也可用少量蒸餾水，先將碘化鉀完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。3脫色液：95乙醇。4復染液 a. 貯存液：沙黃2.5g 95乙醇100ml b. 應用液：a液10ml蒸餾水90ml染色方法：1涂片經火焰固定，加結晶紫液染1 min，清水沖去染液。 2加碘液染l min，水洗。 3加脫色液，不時搖動約1030s，至無紫色脫落為止，水洗。 4加復染液，染30s，水洗。 5干后鏡檢。二、抗酸染色抗酸染色直接用于痰標本時，可以適當增加標本涂片的厚度，以提高檢出率。染厚涂片時

5、，須掌握復染色時間。如果背景過深，影響鏡檢。奴卡菌及放線菌可呈弱抗酸性，取培養(yǎng)菌落涂片染色時，呈現(xiàn)兩種現(xiàn)象，視野中有些菌細胞陽性，另外一些則陰性；有時同一個菌體上，紅色的深淺亦有不同，觀察時應予注意?？顾崛旧袃煞N常用方法： 堿性復紅法又稱萋納(ziehlneelsen)法。 熒光染料金胺o法(也稱金胺o-羅丹明b法)。(一) 堿性復紅染色法試 劑1萋納石炭酸復紅溶液 堿性復紅乙醇飽和溶液10ml 5石炭酸溶液90ml2脫色劑 * 濃鹽酸3ml 95乙醇97ml3復染液(呂弗勒美藍液)美藍乙醇飽和溶液30ml10氫氧化鉀0.1ml蒸餾水100ml染色方法1涂片經火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐

6、加熱至有蒸汽出現(xiàn)，切不可沸騰。染5 min(若染色奴卡菌需要加長時間)，水洗。 2加脫色劑，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗。 3加復染液，染0.5l min，水洗。 4干后鏡檢。分枝桿菌呈紅色，背景為藍色。 *：奴卡菌、放線菌標本染色時，脫色劑改用2硫酸水溶液。 (二)金胺o-羅丹明b染色法 染 劑 1羅丹明b液：羅丹明b 0.1g加蒸餾水100ml； 20.1金胺o液：金胺o 0.1g加蒸餾水95ml，再加入純石炭酸5ml，混勻； 33鹽酸酒精；4稀釋美藍液：呂弗勒美藍液10ml，加蒸餾水90ml，混勻。方 法1 涂片固定后加第1液3090s。2 棄去第1液后加第2液染15min。 3

7、用第3液脫色12min，水洗。4 滴加第4液染30s，水洗，待干，熒光抗酸菌在暗背景中呈現(xiàn)金黃色熒光。 三、鞭毛染色 用于觀察菌體上有無鞭毛、鞭毛在菌體上的位置以及鞭毛的數(shù)量。在細菌鑒定中，特別是非發(fā)酵菌的鑒定中很重要。 鞭毛染色可以直接從平板上挑選菌落，或從斜面上刮菌苔涂片即可，但必須注意動作盡量輕，以免鞭毛從菌體上脫落。菌落應是 生長在營養(yǎng)較好的瓊脂平板(如血平板、營養(yǎng)瓊脂)上的過夜培養(yǎng)物。不可采用有抑制劑的選擇性培養(yǎng)基，如中國藍、麥康凱、ss瓊脂等。觀察鞭毛時，應耐心尋找整個涂片上的菌細胞，因為并不是涂片上每個細菌細胞上的鞭毛特性及數(shù)量都一樣，應以鞭毛數(shù)量最多的菌細胞為準。鞭毛染色(改良

8、ryu法)試劑a液：5石炭酸 10ml 鞣酸 2g飽和硫酸鋁鉀液 10mlb液： 結晶紫酒精飽和液 應用液：a液10份，b液1份，混合，室溫存放。染色方法 1玻片的處理：要求用新的載玻片。用前須在95酒精中浸泡24小時以上。用時從酒精中取出，以干凈紗布擦干后使用。 2在玻片上滴蒸餾水兩滴。一張玻片上可同時制2個涂片。 3用接種環(huán)挑取血平板上菌落少許，將細菌點在玻片上的蒸餾水滴的頂部。一般只需點一下，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。 4玻片置室溫自然干燥。 5滴加染液于玻片上，染色。 6約1015min后，用蒸餾水緩慢沖去染液。沖洗時應避免使染液表面的金屬光澤液膜滯留在玻片上，

9、影響鏡檢。 7玻片自然干燥后，鏡檢時應從涂片的邊緣開始，逐漸移向中心。尋找細菌較少的視野，鞭毛容易觀察。細菌密集的地方，鞭毛被菌體擋住，不易觀察。 四、異染顆粒染色 用于白喉棒狀桿菌染色，異染顆粒可明顯地被顯示出來。標本直接涂片或細菌涂片均可用改良阿伯特(albert)法染色來觀察異染顆粒。試 劑甲液：甲苯胺藍0.15g 孔雀綠0.2g 冰醋酸1ml 95乙醇2ml 蒸餾水 100ml將各染料先溶于乙醇，然后加入水與冰醋酸的混合液中，充分混勻。靜置24h后過濾備用。乙液：碘 2g 碘化鉀 3g 蒸餾水 300ml先將碘化鉀加少許蒸餾水(約2m1)，充分振搖，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后，

10、加蒸餾水至300ml。 染色方法 1. 涂片經火焰固定，加甲液，染3 5 min。水洗。 2滴加乙液，染l min。水洗。3干后鏡檢，菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色。五、墨汁莢膜染色用于觀察菌體有無莢膜結構，借此鑒定某些菌，如新型隱球菌。傳統(tǒng)的方法是用印度墨汁，但目前國內無售。常規(guī)工作可以用墨汁或墨水代替，但應注意顆粒不能太粗，否則影響觀察結果。有人用5黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果較好。試 劑印度墨汁或5黑色素水溶液。染色方法將標本與1滴染色液在載玻片上混合，加上蓋玻片，輕輕壓一下，使標本混合液變薄。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞。找到后，轉換高倍鏡確認。葡萄球菌屬一、常規(guī)鑒定葡萄

11、球菌的鑒定：首先須與其他的革蘭陽性球菌鑒別，然后再作屬內種的鑒定。(一) 與其他革蘭陽性球菌鑒別臨床標本中常見到的革蘭陽性球菌，除葡萄球菌屬外，還有微球菌屬和氣球菌屬等。所以，在菌屬內菌種鑒定之前，首先與這幾屬細菌鑒別(見表)。表 葡萄球菌屬與其他革蘭陽性球菌的鑒別 a菌名特 征 b嚴格需氧四聯(lián)狀排列緊粘瓊脂動力5%nacl瓊脂觸酶c氧化酶d(改良法)厭氧下葡萄糖產酸e耐 藥桿菌肽 f0.04u/片呋喃唑酮 g100ug/片葡萄球菌屬-d- b-+-d+-氣球菌屬-+-+-(+)-動性球菌屬+d-+nd-nd-口腔球菌屬-d+-土-+-微球菌屬+-+-+注：a葡萄球菌屬、動性球菌屬、口腔球菌屬

12、、微球菌屬皆隸于微球菌科。b符號：+，90以上陽性；土，90以上弱陽性；一，90以上陰性；d，1l一89陽性；nd，未試驗；( ) 遲緩反應。c在某些菌種中出現(xiàn)觸酶弱陽性或假陽性反應，是由于在培養(yǎng)中補充血紅素，活化某些菌株觸酶活性。dfaller和schleifer改良氧化酶試驗為檢出細胞色素c。e標準的氧化發(fā)酵試驗。f+，耐藥或無抑菌環(huán)，微球菌、口腔球菌、氣球菌敏感，抑菌環(huán)1025mm。g十，耐藥或抑菌環(huán)9mm；一，敏感，抑菌環(huán)1535mm。h表皮葡萄球菌有些菌株生長時緊固地粘附于瓊脂表面，此種特性與細菌產生濃的粘液相關。1與鏈球菌鑒別：葡萄球菌與鏈球菌的區(qū)別如下：在鏡下，葡萄球菌以單、雙、

13、葡萄狀排列，菌體呈圓形。鏈球菌以成單、雙、鏈狀排列，菌體形態(tài)為圓形或橢圓形。葡萄球菌觸酶試驗陽性，鏈球菌則陰性。2與微球菌的鑒別：實驗室常用的鑒別依據(jù)是形態(tài)和發(fā)酵葡萄糖產酸。在鏡下，葡萄球菌以葡萄狀排列為主，菌體較??；微球菌以四聯(lián)排列為主，且菌體較大。葡萄球菌發(fā)酵葡萄糖產酸試驗陽性，微球菌陰性。此外桿菌肽、呋喃唑酮敏感試驗有利區(qū)別兩屬菌種。(二) 臨床8種常見葡萄球菌的鑒別目前葡萄球菌已被命名有27個種。臨床標本中最常見有意義菌種是金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中間葡萄球菌和豬葡萄球菌。首先用凝固酶試驗將其分為凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌(

14、包括中間和豬葡萄球菌)和凝固酶陰性的其他葡萄球菌，然后用新生霉素敏感試驗。推斷新生霉素耐藥為腐生葡萄球菌。下表列出了關鍵鑒定試驗來區(qū)別上述8個菌。二、試驗方法(一)觸酶試驗(過氧化氫酶試驗)試劑：3h2o2溶液，置棕色瓶內于4陰暗處保存。方法：先挑取固體培養(yǎng)基上的菌落，置于潔凈的玻片上，然后滴加3過氧化氫溶液12滴。靜置之，lmin內產生大量氣泡的為陽性，不產生氣泡的為陰性。 表 有臨床意義的8種葡萄球菌關鍵性鑒定菌 種試 驗菌落色素葡萄球菌凝固酶凝聚因子耐熱dna酶堿性磷酸酶吡咯烷酮酶鳥氨酸脫羧酶脲酶半乳糖苷酶產生v|p新生霉素耐藥多粘菌素b耐藥需氧下產氣d|蕈 糖d|甘露醇d|甘露糖d|松

15、二糖d|木糖d|纖維二糖麥芽糖蔗 糖金黃色葡萄球菌+-d-+-+-+表皮葡萄球菌-+-(d)+-+-+-(+)(d)-+溶血葡萄球菌d-+-+-+d-(d)-+里昂葡萄球菌d-(+)-+d-+-d+-+(d)-+施氏葡萄球菌-+-(+)+-d-+-腐生葡萄球菌d-+-+d-+-+中間型葡萄球-+d+-+-+(d)+d-+豬葡萄球菌菌-d-+-d-+-+-+注意點：1注意過氧化氫為3，應用30濃的h2o2，用時稀釋10倍。2不應在培養(yǎng)基上做試驗。3每次試驗時，應以陽性和陰性菌株做對照。(二) 葡萄球菌凝固酶和凝聚因子試驗葡萄球菌凝固酶試驗被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。試管法凝

16、固酶試驗稱為葡萄球菌凝固酶，玻片法為檢測凝聚因子。1凝聚因子試驗：取1滴蒸餾水于潔凈的玻片上，用接種環(huán)挑取待檢菌一環(huán)置于蒸餾水中，制成濃的菌懸液，無自凝現(xiàn)象。然后加一環(huán)家兔血漿混合，10s內觀察結果，出現(xiàn)明顯細菌凝塊為陽性，否則為陰性。如超過 10s可出現(xiàn)假陽性，有10一15金黃色葡萄球菌呈假陰性，因此必須用試管法驗證凝聚因子試驗。操作過程中的注意點：(1) 10s內觀察結果。(2) 必須制備濃厚的均勻菌懸液。(3) 用edta抗凝的兔血漿為最好。(4) 加血漿后不要再混攪，以免細菌凝塊分散變小。(5) 生長在高鹽培養(yǎng)基上的菌落可出現(xiàn)自凝或假陽性。2葡萄球菌凝固酶試驗：用生理鹽水將血漿4倍稀釋

17、，取0.5ml。然后挑取35個菌落于稀釋血漿中，成濃菌懸液。置37水浴，34h后讀取結果，凝固者為陽性。若陰性，繼續(xù)觀察到24h，不凝固者為陰性。試驗應同時作陽性、陰性對照。試管法葡萄球菌凝固酶試驗陽性者，應見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應判為陰性。中間型葡萄球菌、豬葡萄球菌需要較長時間孵育，才可出現(xiàn)陽性。凝固酶試驗應考慮下述情況： 某些金黃色葡萄球菌產生溶纖維蛋白酶，溶解纖維蛋白凝塊。 所用血漿缺乏纖維蛋白原。 試驗菌株不純。(三)碳水化合物氧化、發(fā)酵試驗 (of試驗)葡萄球菌的of試驗應使用專用配方，不可與非發(fā)酵菌用的of管混用。培養(yǎng)基用的指示劑必須用水配

18、制，因為個別菌株能分解乙醇產酸。培養(yǎng)基： 酵母浸膏 0.1g 胰胨 1g 牛肉浸液 l00ml 0.2溴甲酚紫溶液 lml校正ph7.0，按常規(guī)方法加入1的碳水化合物，分裝，滅菌，備用。溴甲酚紫的配制：溴甲酚紫loomg， 0.01mol的naoh 18.5ml，加水至50ml。方法：挑取待檢菌落，接種于2支o-f培養(yǎng)基管中，發(fā)酵管加滅菌液體石蠟油約 lcm深，氧化管不加。35孵育24h后觀察，培養(yǎng)基變黃即產酸。結果判定如下：代謝型加石蠟不加石蠟發(fā)酵產酸產酸氧化不變色產酸(四)新生霉素耐藥試驗方法：挑取待檢菌菌落數(shù)個，制成相當 0.5號麥氏管(mcfarland)濃度菌液，棉拭子浸透，擠去多余

19、液，均勻涂在mh平板上，貼上含5ug片的新生霉素紙片，35孵育 1620h，抑菌環(huán)直徑16mm為陽性(耐藥)。試驗時應以金黃色葡萄球菌 atcc25923做陰性(敏感)對照，以確認紙片是否有效。(五)氧化酶(改良法)試驗試劑：四甲基對苯二胺 (tmpd) (tetramethylphenylenediamine) 6.0g二甲基亞砜 (dmso) (dimethy sulfoxide) 100.0ml溶解tmpd于dmso中，置于避光玻塞瓶中，可在室溫中保留幾個星期。方法：被檢菌株移種于7羊血瓊脂上，30需氧條件下孵育1518h，刮取菌落涂布于無色濾紙片上，加1滴上述試劑，陽性者在2min內呈

20、深藍色。若被測菌株移種在蛋白胨酵母浸出液瓊脂上，至少孵育3天以上，才可檢測，陽性反應510min出現(xiàn)。鏈球菌屬一、常規(guī)鑒定(一)屬間鑒別臨床標本檢到革蘭陽性球菌、觸酶陰性，除鏈球菌屬外，尚有6個菌屬，是：腸球菌屬 enterococcus乳球菌屬 lactococcus無色藻菌屬 leuconostoc平面球菌屬 pediococcus孿生球菌屬 gemella氣球菌屬 aerococcus在鑒別上述菌屬時，關鍵是：革蘭染色。上述菌屬的革蘭染色特性相似，若從瓊脂平板上涂片染色，無色藻菌屬中某些菌種的形態(tài)呈現(xiàn)球桿形、桿形，容易與乳桿菌屬菌種相混淆，后者觸酶亦陰性。若生長在鹽肉湯涂片，最容易出現(xiàn)不

21、一致性。觸酶試驗。目的是與葡萄球菌屬和口腔球菌屬鑒別。屬間鑒別參見下表。 表 觸酶陰性或弱陽性的革蘭陽性球菌的鑒別特征菌屬試 驗 a形 態(tài)萬古霉素30ug/片葡萄糖產氣pyrlap6.5nacl45生長10生長鏈狀成對四聯(lián)成簇鏈球菌屬+-s- b+-v-腸球菌屬+-s-+ c乳球菌屬+-s- b+v-+氣球菌屬-+s-+-+-孿生球菌屬+s-+v-平面球菌屬-+r-+v+-無色藻菌屬+-r+-v-+注：as，敏感；r，耐藥；+，陽性反應；一，陰性反應；v，反應不定(有些菌株+，另外菌株-)b化膿鏈球菌和l-garviae可陽性。c偶爾例外。(二)屬內鑒別鏈球菌屬內鑒別，首先觀察在血液瓊脂平板上

22、的溶血環(huán)，是溶血型，或非溶血型，參照這二類溶血型菌種的鑒別。1溶血鏈球菌的鑒定：溶血型鏈球菌的鑒定都是檢測特異多糖抗原稱為鏈球菌群多糖抗原來分群，可采用商業(yè)性試劑盒，當前血清學診斷方法尚未普及之前，傳統(tǒng)的對溶血鏈球菌的鑒別仍是需要的。a、b、d、g群細菌，一般可用桿菌肽、camp、膽汁七葉苷及pyr、vp等試驗區(qū)別 (見表)。表 溶血鏈球菌的鑒別特征血清學分群種 名吡咯烷酮酶vpcamp七葉苷桿菌肽敏感蕈糖黃色素山梨醇a化膿鏈球菌+-+-b無乳鏈球菌-+-+-c馬鏈球菌-d-c似馬鏈球菌-+-c獸疫鏈球菌-d-+glancefieedg群-+-a,c,f,g或未分群咽峽炎鏈球菌-+-+-注：a

23、+，陽性；一，陰性；d，不同菌株。 b有人認為咽峽炎鏈球菌與米勒鏈球菌是同義詞。2非溶血鏈球菌鑒別肺炎鏈球菌的鑒定：生長在血瓊脂平板上的菌落細小，圓形，表面光滑、灰白色、邊緣整齊，半透明，開始扁平以后中心塌陷，呈臍窩狀。菌體呈矛頭狀成雙排列。該菌對optochin敏感和膽汁溶菌試驗陽性。3牛鏈球菌的鑒定：具有d群多糖抗原，6.5nacl不生長，pyr陰性，膽汁七葉苷陽性，與其他草綠色鏈球菌鑒別見下表。表 非溶血型鏈球菌的鑒別菌種群試驗optochin敏感膽汁溶菌膽汁七葉苷6.5nacl肉湯吡咯烷酮酶衛(wèi)星現(xiàn)象camp血清群肺炎鏈球菌+-牛鏈球菌-+-d無乳鏈球菌-+b草綠色鏈球菌- b-營養(yǎng)變異

24、鏈球菌-+-注：a. +，陽性反應；-，陰性反應；土，有些菌株陽性，另外菌株陰性。b. 偶見例外。營養(yǎng)變異鏈球菌是草綠色鏈球菌的營養(yǎng)變種，在普通肉湯或瓊脂平板上生長不良(通常發(fā)現(xiàn)在血液培養(yǎng)瓶中)。若培養(yǎng)基中加入吡哆醛或做“衛(wèi)星現(xiàn)象”試驗容易被發(fā)現(xiàn)，有二個種，即缺陷鏈球菌sdefectivus，毗鄰鏈球菌s.adjacens。草綠色鏈球菌的鑒定：革蘭陽性球菌，觸酶陰性，非溶血、膽汁溶菌陰性，optochin陰性，不存在b、d群抗原，6.5nacl肉湯不生長，pyr陰性，10，45不生長，膽汁七葉苷陰性，萬古霉素敏感。該類鏈球菌種較多，目前臨床僅鑒定到群，參見下表。表 草綠色鏈球菌的鑒定種群試 驗

25、 a甘露醇山梨醇vp精氨酸七葉苷脲酶變異鏈球菌群 c+-+-唾液鏈球菌群-+-+土血液鏈球菌群- b-+-緩癥鏈球菌群-咽峽炎鏈球菌群- b- b+ b+-注：a+，陽性反應；一，陰性反應；土，有些菌株陽性而另外菌株陰性。b偶見例外。c變異鏈球菌群包括：倉鼠、道尼、野鼠，獼猴、鼠親緣鏈球菌，唾液鏈球菌群包括：腸、前腔鏈球菌，血液鏈球菌群包括：戈登、hw群鏈球菌，緩癥鏈球菌群包括：溫和、口腔、血鏈球菌生物型鏈球菌，咽峽炎鏈球菌群包括：中間、星座、米勒鏈球菌。咽峽炎鏈球菌是未分群的鏈球菌，被認為是“米勒鏈球菌”的同義詞，有溶血的菌種，屬于a、c、f、g群，也有非溶血菌種，在a、c、g群鏈球菌中有小

26、菌落型菌株。非溶血，帶有相同的lancefield抗原，屬于草綠色鏈球菌(“米勒”群)細菌，有3個種；米勒鏈球菌、中間鏈球菌、星座鏈球菌。(三)與鏈球菌屬相關菌屬的描述1乳球菌屬：原鏈球菌屬中乳鏈球菌現(xiàn)成為乳球菌屬。乳球菌和乳脂乳球菌在制酪和糧食工業(yè)生產中使用。臨床標本中也常見到。該屬菌種與腸球菌相似，唯一不同點是45不生長。2孿生球菌屬：原麻疹鏈球菌現(xiàn)轉入孿生球菌屬，另一種是溶血孿生球菌。該屬菌種曾從臨床標本中檢到，見于臨床感染如心內膜炎。其特點是生長緩慢，可能被誤認為營養(yǎng)缺陷鏈球菌，應用“衛(wèi)星現(xiàn)象”試驗區(qū)別開來。菌種鑒定，參照下表所示。表 孿生球菌屬菌種鑒定菌 種試 驗革蘭染色菌細胞排列吡

27、咯烷酮酶甘露醇山梨醇溶血孿生球菌+-成雙，四聯(lián)，成簇麻疹鏈球菌+成對，短鏈注：+，陽性；一，陰性；+，弱陽性反應。3平面球菌屬：該屬菌種對萬古霉素耐藥，pyr陰性，發(fā)酵葡萄糖不產氣，膽汁七葉苷、精氨酸陽性，含有d群抗原，不發(fā)酵乳糖，在含鹽肉湯中生長緩慢，屬內鑒別參見下表。乳酸平面球菌和戊糖平面球菌曾從臨床標本中分離到。表 平面球菌屬菌種鑒定菌 種試 驗麥芽糖阿拉伯糖淀粉蔗糖6.5naci肉湯乳酸平面球菌-+戊糖平面球菌+-+危害平面球菌+-+-糊精于面球菌+-+-馬尿平面球菌+-+微小平面球菌-+注：+，陽性，一，陰性。 4無色藻菌屬：該屬菌種萬古霉素耐藥，pyr、lap陰性，發(fā)酵葡萄糖(mr

28、s肉湯)產氣，有4個菌種曾從臨床標本中檢到，種間鑒別參照下表。表 無色藻菌屬菌種鑒定菌種試 驗 a水解七葉苷牛乳產酸凝固棉子糖蜜二糖6.5naci肉湯阿拉伯糖蕈糖5蔗糖枸櫞酸無色藻菌+-+乳無色藻菌-+-腸膜無色藻菌+- b+ b+假腸膜無色藻菌+ b+-+類腸膜無色藻菌+？+-乳脂無色藻菌-？-葡聚糖無色藻菌+？+-+-注：a.+，陽性；-，陰性；?，不了解；5蔗糖，菌細胞外產生多糖(粘質物)二、試驗方法(一)溶血性檢查溶血性是鑒定球菌最常用的項目，也是鑒定過程中重要的一步。1919年brown對溶血性進行了描述。溶血：或稱甲型溶血，在血平板上，菌落周圍部分紅細胞被破壞，呈現(xiàn)一個草綠色環(huán)。溶

29、血：或稱乙型溶血，在血平板上，菌落周圍紅細胞完全溶解，呈現(xiàn)一個清楚透明溶血環(huán)。溶血：或稱丙型溶血，血平板上，菌落周圍無紅細胞溶解，因而無溶血環(huán)。溶血性的識別可在血平板表面菌落周圍和穿刺處通過肉眼觀察，也可用顯微鏡觀察。除在分離血平板上觀察菌落周圍的溶血性外，還可用以下方法確認。材料：羊血平板。方法：將標本接種于羊血平板上，用接種針在已接種過的血平板上扎23處，使細菌被接種到瓊脂層深處，35孵育過夜。觀察結果：在接種針穿刺過處，羊紅細胞完全溶解，形成無色透明區(qū)，為溶血。羊紅細胞部分溶解或不溶解呈草綠色的環(huán)，為溶血。不溶解無溶血環(huán)為溶血。(二) optochin敏感試驗材料：optochin (e

30、thylhydrocupreine hci。)紙片(直徑6mm)，每片含5g。血平板。方法：挑取被檢菌落，涂在血平板上，貼 optochin紙片于接種處，35，燭缸孵育18h。觀察結果：抑菌環(huán)直徑14mm為敏感，推斷肺炎鏈球菌。抑菌環(huán)直徑14mm時參照膽汁溶菌，或為其他草綠色鏈球菌。(三) 桿菌肽敏感試驗材料：含0.04u片的桿菌肽紙片，血平板。方法：挑取被檢菌落，密涂于血平板上，接種量應大，以免出假陽性。貼上桿菌肽紙片，35過夜。觀察結果：形成抑菌環(huán)為敏感，則被檢菌推斷為a群鏈球菌。(四) camp試驗材料：血平板，金黃色葡萄球菌 atcc25923。方法：在血平板上，用金黃色葡萄球菌劃種一

31、條直線，再將被檢菌距金黃色葡萄球菌 3mm處垂直接種一短線。用同樣方法接種陰性和陽性對照菌。35孵育過夜。觀察結果：在被檢菌接種線與金葡菌接種線之間有一個矢形(半月形)加強溶血區(qū)，此即camp試驗陽性。陰性無加強溶血區(qū)。(五) 膽汁-七葉苷試驗(平皿法或斜面法)培養(yǎng)基：牛肉膏3g七葉苷1g蛋白胨5g枸櫞酸鐵0.5g膽鹽 40g蒸餾水 1000ml瓊脂 1牛肉膏、蛋白胨和瓊脂溶于400ml蒸餾水中，膽鹽溶于400ml蒸餾水中，枸櫞酸鐵溶于l00ml蒸餾水中，三者混合，加熱充分溶解后，高壓滅菌121 15min。七葉苷溶于l00ml蒸餾水，過濾除菌，以無菌手續(xù)加到培養(yǎng)基中，傾倒平皿或斜面。方法：接

32、種被檢菌13個菌落，涂劃開，置35下，孵育2448h。觀察結果：培養(yǎng)基變黑色或棕褐色為陽性，不變色為陰性。注意事項：接種細菌量不能過大。本試驗是測定細菌在膽鹽中生長情況及同時分解七葉苷的能力，如接種菌量過大，細菌不需要生長而本身固有的酶足以造成七葉苷分解，出現(xiàn)假陽性結果。(六)七葉苷試驗培養(yǎng)基：蛋白胨 5g七葉苷 3gk2hpo4 1g枸櫞酸鐵 0.5g蒸餾水 1000ml將上述成分加熱溶解，分裝試管，高壓滅菌12rclomin。方法：接種被檢菌于培養(yǎng)基中，35過夜。觀察結果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮浴?七) 6.5nacl生長試驗培養(yǎng)基nacl6.5g牛肉粉0.3g葡萄糖0.1g蛋白胨1

33、g瓊脂粉 1.8g蒸餾水 l00ml溴甲酚紫指示劑適量調整ph7.4，121 15min滅菌后制成平皿或斜面。方法：接種被檢菌，35孵育過夜。觀察結果：培養(yǎng)基上生長出菌落并變黃色為陽性，不變色為陰性。注意點：本試驗是測定細菌在高鹽中的生長能力，葡萄糖作為是否生長的指示劑。細菌接種量不能過大，否則細菌并不需要繁殖即可使葡萄糖產酸，培養(yǎng)基變色，導致假陽性結果。(八) 色素試驗色素試驗在鑒定b群鏈球菌的幾個方法中，特異性最好。這是noble改良的islam法。培養(yǎng)基：淀粉10g胨23.0gnah2po41.48gna2hp045.75g瓊脂 l0g水 1000ml調ph7.4，12115min滅菌后

34、，加入 10ml滅活馬血清，傾制平板或高層瓊脂。接種細菌，35過夜培養(yǎng)。觀察結果：細菌菌落及周圍的培養(yǎng)基呈黃色為陽性。腸球菌屬一、常規(guī)鑒定為便于鑒定，將腸球菌分成3個組，主要根據(jù)甘露醇、山梨醇、山梨糖、精氨酸來分群。群菌種分解甘露醇、山梨醇、山梨糖。精氨酸水解酶陰性。群菌種發(fā)酵甘露醇、水解精氨酸。不分解山梨糖，山梨醇不定。群菌種水解精氨酸，既不發(fā)酵甘露醇與山梨醇，亦不分解山梨糖。二、 試驗方法丙酮酸鹽利用試驗酵母浸出粉 5g磷酸氫二鉀 5g氯化鈉 5g丙酮酸鈉 10g麝香草酚藍 104mg蒸餾水 1000ml除指示劑外，上述試劑加熱溶解，調整 ph7.17.4后，再加指示劑，用13mml00m

35、m試管分裝，高壓121 15min。方法：接種被檢菌株于上述培養(yǎng)基中，孵育35 7天以上，培養(yǎng)基由綠色變成明顯黃色為陽性，如仍為綠色或黃綠色判定陰性。嗜血桿菌屬一、常規(guī)鑒定 1與相關菌屬、種的鑒別：嗜血桿菌屬常與放線菌屬、艾肯菌屬、心桿菌屬、金氏菌屬相鑒別，見下表。表 嗜血桿菌屬菌種與相關菌種鑒別試驗菌 種需要x因子需要v因子靛基質鳥氨酸脫羧酶賴氨酸脫羧酶葡萄糖蔗糖乳糖甘露糖硝酸鹽還原觸酶嗜沫嗜血桿菌+- -+-+-副嗜沫嗜血桿菌-+-+-+-伴放線桿菌-+-d+侵蝕艾肯菌-+-+-人心臟桿菌-+-+-+-產靛基質金氏菌-+-+-嗜血紅素嗜血桿菌+-+-+-+2屬內鑒別可利用分離培養(yǎng)時，對x、

36、 v因子的需要和溶血性可初步區(qū)別不同的嗜血桿菌種。 進一步的鑒別可通過生化試驗來確定到種。流感嗜血桿菌發(fā)酵木糖，與埃及嗜血桿菌木糖不發(fā)酵相區(qū)別。杜克雷嗜血桿菌有特殊臨床來源，所以較易診斷。屬內種的鑒別見下表。表 嗜血桿菌屬中種的特征嗜血桿菌因子溶血發(fā) 酵觸酶co2促進生長onpgbxv葡萄糖蔗糖乳糖甘露糖木糖流感嗜血桿菌 a+- + -d+-溶血嗜血桿菌+-d+-杜克雷嗜血桿菌+-副流感嗜血桿菌-+-+-+-ddd副溶血嗜血桿菌-+-+-遲緩嗜血桿菌-+-ww-d-d副嗜沫嗜血桿菌-+-+d-+嗜沫嗜血桿菌-+-+注：a包括埃及嗜血桿菌；d不同結果；w弱發(fā)酵反應 bonpg，o-硝基酚-d半乳

37、糖吡喃苷。 (1) 流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌的鑒定。 用金黃色葡萄球菌作“衛(wèi)星”試驗陽性。但應注意“副流感”只需v因子即生長?？赏瑫r用mh平板作衛(wèi)星試驗，能在mh平板呈衛(wèi)星生長的菌可否定流感嗜血桿菌。二者也可用糖發(fā)酵試驗加以鑒別。 (2) 作為院內感染病源追蹤的流行病學的需要，對流感、副流感嗜血桿菌須鑒定到型?？捎眠胚帷⒛蛩?、鳥氨酸3個試驗將“流感嗜血桿菌”分為8個生物型(詳見表)，或用血清學進行分型。表 流感嗜血桿菌及副流感嗜血桿菌生物型鑒別靛基質尿 素鳥氨酸脫羧靛基質尿 素鳥氨酸脫羧流感嗜血桿菌副流感嗜血桿菌+-+-+ a-+-+-+-+-+-+-+-+- 注：a埃及嗜血桿菌與流感嗜血

38、桿菌生物型主要生化特性相似，二者區(qū)別參考有關資料。 二、試驗方法1 衛(wèi)星試驗：挑取可疑菌落密涂劃種于血平板上或mh平板上，再將金黃色葡萄球菌點種或劃種其上，3524h孵育。如葡萄球菌菌落鄰近處被檢菌的菌落較大，遠離葡萄球菌菌落處的菌落小或不生長，即“衛(wèi)星”試驗陽性。在血平皿上劃上葡萄球菌時，x，v因子都具備，在m-p,平板上接種葡萄球菌、只具備v因子。2 糖發(fā)酵試驗 培養(yǎng)基：1糖的酚紅肉湯，并補充所需生長因子，方法參考奈瑟菌鑒定。3 吲哚(快速法)試驗：在ph 6.8的磷酸緩沖液(0.05mol)中，加0.1的l-色氨酸。大量接種被檢菌，孵育4h后，加kovacs試劑。4 尿素酶試驗 培養(yǎng)基：

39、 kh2po40.1gk2hpo40.1nacl0.5g0.2酚紅水溶液 0.5ml蒸餾水 100mlph 7.0高壓后加20的尿素溶液 10.4ml。方法：與其他菌相同。注意接種量要大，4小時觀察結果。腸桿菌科一、常規(guī)鑒定腸桿菌科雖然有100多個種，在臨床常見的不過是其中的一部分，約20余種。從臨床標本中分離的頻率較高的是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇異變形桿菌。對3個菌種的鑒別鑒定，實驗室可用常規(guī)的方法，一般不困難。其他菌種應按規(guī)程的操作從屬到種的步驟進行。 (一)與其他科屬細菌的鑒別 革蘭陰性桿菌除了腸桿菌科外，還有弧菌科和非發(fā)酵菌。所以，腸桿菌科的鑒定首先應注意與這些菌的鑒別?？捎眯螒B(tài)、

40、葡萄糖氧化或發(fā)酵、氧化酶、鞭毛等特性加以區(qū)別，見表。表 腸桿菌科與其他科菌的區(qū)別 試 驗腸桿菌科弧菌科非發(fā)酵菌葡萄糖ff0-氧化酶-+ *形態(tài)桿狀弧形桿狀鞭毛周毛或無單毛單、叢毛、周毛、無注：*，不動桿菌、嗜麥芽黃單胞菌除外。(二)腸桿菌科的初步分群 可用兩個試驗將腸桿菌科初步分為二大類，即苯丙氨酸脫氨酶試驗和葡萄糖酸鹽試驗(也可用v-p試驗)，見表:表 腸桿菌科初步分類菌 屬 名苯丙氨酸葡萄糖酸鹽菌 屬 名苯丙氨酸葡萄糖酸鹽變形桿菌屬+-埃希菌屬-普羅威登斯菌屬+-志賀菌屬-摩根菌屬+-沙門菌屬-克雷伯菌屬-+枸櫞酸桿菌屬-腸桿菌屬- *+ *愛德華菌屬-沙雷氏菌屬-+耶爾森菌屬-哈夫尼亞菌

41、屬-+注：有例外。(三)苯丙氨酸陽性菌屬及種的鑒別苯丙氨酸陽性、葡萄糖酸鹽陰性的有變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬、摩根菌屬。1各屬的鑒別：變形桿菌屬、普羅威登斯菌屬、摩根菌屬的區(qū)別可用h2s、鳥氨酸、枸椽酸鹽三個試驗，其鑒別見表:表 苯丙氨酸陽性的各屬鑒別試 驗變形桿菌屬普羅威登斯菌屬摩根菌屬h2s+-鳥氨酸+/-+枸椽酸鹽+/-+- 2變形桿菌屬種的鑒別：變形桿菌屬常見有三個種即普通變形桿菌、奇異變形桿菌、潘尼變形桿菌。產粘液變形桿菌僅從活的或死的吉普賽蛾幼蟲中發(fā)現(xiàn)，與人類的關系未見報道。鑒別見表。表 變形桿菌屬內種的鑒別試 驗普通變形桿菌奇異變形桿菌潘尼變形桿菌靛基質+-鳥氨酸-+-麥芽糖+-

42、+ 3普羅威登斯菌屬種的鑒別：該屬臨床常見有3個菌種，即產堿普羅威登斯菌、斯圖普羅威登斯菌、雷極普羅威登斯菌，其鑒別見表: 表 普羅威登斯菌屬內種的鑒別試 驗產堿普羅威登斯菌斯圖普羅威登斯菌雷極普羅威登斯菌尿素-/+蕈糖-+-側金盞花醇+-+ 4摩根菌屬的鑒定：摩根菌屬常見1個種，即摩根摩根菌，其鑒定見”苯丙氨酸陽性的各屬鑒別表”。(四)苯丙氨酸陰性、葡萄糖酸鹽陽性各屬及種鑒別 1葡萄糖酸鹽陽性各屬的鑒別：這類細菌有克雷伯菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬、哈夫尼亞菌屬。可用動力、山梨醇、dnase、棉子糖等試驗將其區(qū)別(見表)。表5-3-28 葡萄糖酸鹽陽性的各屬的鑒別試 驗克雷伯菌屬腸桿菌屬沙雷菌屬

43、哈夫尼亞菌屬動力-+山梨醇+/-+-dnase-+-棉子糖+/-枸櫞酸鹽利用+a+-鳥氨酸脫羧酶-d+b+c+注：a鼻硬結亞種、臭鼻亞種的某些菌株陰性。 b聚團腸桿菌陰性。 c芳香沙雷菌生物2群、普城沙雷菌、深紅沙雷菌陰性。 d解嗎氨酸克雷伯菌陽性。2克雷伯菌屬種的鑒別：克雷伯菌屬有肺炎克雷伯菌(亞種)、臭鼻亞種、鼻硬結亞種、產酸克雷伯菌。肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌是臨床中分離較多的，二者的區(qū)別在靛基質。另外，兩個亞種雖然臨床不多見，但已從臭鼻患者、呼吸道慢性病患者以及鼻硬結患者中分離到，因此，鑒別它們也是有一定的臨床意義?？捎眉谆t、賴氨酸、丙二酸鹽鑒別(見表5329)。表5-3-29 克雷伯菌屬種的鑒別試 驗產酸克雷伯菌肺炎克雷伯菌肺炎亞種臭鼻亞種鼻硬結亞種靛基質+-甲基紅-+枸椽酸鹽+-/+-賴氨酸+-/+-丙二酸鹽+-+ 3腸桿菌屬種的鑒別：腸