標(biāo)本因素與凝血功能試驗質(zhì)量保證

1、標(biāo)本因素與凝血功能試驗質(zhì)量保證Sampling in Quality Assurance of Coagulation Test李健 1 侯軍華 2解放軍總醫(yī)院海南分院 1 檢驗中心， 2 護(hù)理部，海南三亞， 572013近年來， 凝血分析儀自動化的程度越來越高， 使凝血功能檢驗越來越快、 越 全面、越可靠，但是，這些都是實(shí)驗室內(nèi)部控制的部分。 70%以上的檢驗誤差不 是發(fā)生在分析中或分析后，而是在分析前的人工操作環(huán)節(jié) 1，其影響范圍除了傳 統(tǒng)實(shí)驗室診斷， 還包括常規(guī)的和特殊凝血功能檢驗。 在分析前誤差中， 血標(biāo)本采 集的問題非常普遍， 因此確定、 實(shí)施和監(jiān)測標(biāo)本采集流程對于全面提高檢驗質(zhì)量

2、與減少不良事件具有重要意義。 PT、 APTT 、Fib 和 D-dimer 不僅是臨床診斷和 治療中耳熟能詳?shù)捻椖浚?更是臨床決策中的關(guān)鍵參數(shù)。 雖然靜脈穿刺采血的標(biāo)準(zhǔn) 已經(jīng)普及多年， 但是實(shí)踐中仍然存在著一系列標(biāo)本相關(guān)的問題， 為此，本文對包 括患者準(zhǔn)備、靜脈壓迫過長、溶血、采血量、抗凝劑使用和混勻方式以及采集順 序等環(huán)節(jié)加以綜述討論。關(guān)鍵詞 : 止血 血栓 質(zhì)量保證患者準(zhǔn)備不容忽視首先必須了解患者是否接受肝素、口服抗凝藥和抗血小板藥物治療 2,3，這些 藥物能夠顯著影響凝血檢驗結(jié)果。 比如， 肝素抗凝時， 狼瘡抗凝物陰性及凝血因 子活性減低；口服抗凝治療時蛋白 C 和蛋白 S 出現(xiàn)假“缺

3、乏”。不應(yīng)在血栓發(fā)生后緊接著測定凝血抑制物或凝血因子活性或濃度， 因為血栓 形成過程中的大量消耗或被凝塊包含導(dǎo)致因子水平減低。 劇烈的或消耗性運(yùn)動能 夠引發(fā)一過性促凝狀態(tài)， 凝血因子活性出現(xiàn)顯著變化， 特別是平時缺乏運(yùn)動的個 體，表現(xiàn)為凝血酶生成增加、血小板活化、凝血因子活性和纖溶活性增高，反應(yīng) 迅速而且可逆，凝血功能檢測前 24 小時內(nèi)應(yīng)避免此類活動。個體差異也不容忽 視，PT、APTT和Fib以及 AT都存在個體差異，包括 PAI-1和纖維蛋白肽 A也 存在顯著生物多樣性。 不僅血小板和內(nèi)皮功能隨生理節(jié)律波動， 凝血和纖溶蛋白 的活性也有類似的變化，因此，應(yīng)該在固定時刻采血。采血前還應(yīng)避免

4、吸煙，尤 其是血小板功能研究時，吸煙會促進(jìn)血小板聚集并誘發(fā)血漿促凝狀態(tài)。靜脈采血要素在下達(dá)醫(yī)囑后到檢驗科收檢標(biāo)本之前的所有分析前因素中， 溶血是首要問題 （占 49.3%），其發(fā)生率遠(yuǎn)高于標(biāo)本凝集（ 14.2%）和血量不足（ 13.7%）4。常規(guī)采 血中約有 3%出現(xiàn)溶血，多數(shù)來自于急診或重癥監(jiān)護(hù)室，占不合格標(biāo)本的 70%5， 其原因在于錯誤操作或程序不當(dāng)。 采血時紅細(xì)胞破碎釋放血紅蛋白到血漿中， 除 了干擾臨床化學(xué)檢驗之外，也影響凝血試驗。溶血時紅、白細(xì)胞和血小板受損 6， 膜磷脂、細(xì)胞內(nèi)酶或蛋白以及 ADP 等物質(zhì)的釋放，不同程度地激活或抑制原發(fā) 或繼發(fā)止血過程。 血漿中血紅蛋白的類過氧化

5、物酶的活性不容忽視， 而且血紅蛋 白干擾反應(yīng)體系的光學(xué)變化， 使基于波長檢測的試驗光學(xué)本底增高造成偏差。 鑒 于凝血因子可能被激活而且終點(diǎn)法檢測受到干擾， CLSI 推薦：所有肉眼可見溶 血的標(biāo)本都不應(yīng)用于凝血檢驗。 血漿血紅蛋白達(dá)到 0.5%就足以使 PT 失去可靠性 （比如標(biāo)本的血紅蛋白濃度為 140g/L，血漿中游離血紅蛋白為 0.7g/L），如果達(dá) 到0.9%會進(jìn)一步干擾到 APTT，達(dá)到6.0 g/L時將使因子 VIIa 、V、FX產(chǎn)生偏差， 并干擾到 PFA-100 對血小板功能的檢測。首先建議使用直穿針而非蝶形裝置，針頭以中號（ 19-21G）為佳，最好能與 負(fù)壓試管直接相連。對

6、焦躁或嬰兒、老人、化療等患者，不建議使用低于 23G 的小號針頭，孔徑太細(xì)容易破壞紅細(xì)胞， 導(dǎo)致人為溶血， 白細(xì)胞和血小板也可能 被激活。使用小號針時血紅蛋白濃度明顯增高， PT和APTT 有非顯著性縮短的 趨勢。蝶形針采血時， PT，APTT 和 Fib 的平均偏差為 -2.5%至 3.3%7。即使是溶血標(biāo)本，有時在醫(yī)生的要求下實(shí)驗室也要分析。多年來，粘度（磁場）法凝血分析已經(jīng)證明了其抵抗溶血、黃疸和乳糜干擾的優(yōu)勢（單純從檢測角 度而言）；另一方面，新型的光學(xué)法凝血分析儀通過多種波長檢測透射光，自動 檢出溶血和黃疸并加以標(biāo)識， 也加強(qiáng)了對分析前影響因素的控制。 值得注意的是， 無論使用哪種凝

7、血分析儀， 溶血產(chǎn)生的光學(xué)分析偏差都不能忽視， 肉眼可見的溶 血能夠?qū)е?D-dimer 的假陽性。止血帶壓迫靜脈過久容易導(dǎo)致液體溢出， Fib、 vWF 和其他凝血因子等大分 子物質(zhì)被濃縮， 同時內(nèi)皮細(xì)胞活化釋放促凝物質(zhì)， 最終由于凝血因子的濃度增高 使凝集時間縮短。壓迫 1 分鐘就足以使 PT 和 Fib 出現(xiàn)偏差， 3 分鐘后纖維蛋白 原顯著增高、 PT和APTT 縮短。止血帶的最佳綁扎位置應(yīng)該在進(jìn)針處以上 10cm 處，而且要扎緊以限制靜脈血流。直穿針連接試管的靜脈穿刺采血依賴管道內(nèi)部的硬質(zhì)光滑表面， 減少了抽血 壓力可能造成的潛在溶血。 不過監(jiān)護(hù)室或急診室在緊急情況下， 從插管或留置

8、針 等靜脈裝置采血更便捷 （溶血率也更高） ，這時必須注意避免肝素抗凝劑混入標(biāo) 本，注射器必須是新啟封使用以防污染標(biāo)本， 而且事先要標(biāo)記好試管， 注意采血 順序以便區(qū)別使用。標(biāo)本收集與處理要素為了避免不同試管添加劑之間的交叉污染， CLSI 曾專門提出關(guān)于采血順序 的建議：先采血培養(yǎng)瓶，然后就是凝血檢查 （淡藍(lán)），之后是促凝管（紅或金色） 、 肝素鋰管（綠）、 EDTA 管（淡紫）和草酸鹽或氟化物管（淡灰）。用第二管檢驗?zāi)δ芤庠诜乐故軗p血管釋放促凝物質(zhì)進(jìn)入標(biāo)本，實(shí)際上， 多項研究證明常規(guī)凝血檢驗基本不受影響或者可以忽略不計。 特殊凝血檢驗， 如 抗凝血酶、 D-dimer、蛋白 C、蛋白

9、S 和凝血因子等，無論是健康個體還是口服 抗凝治療的患者其第一、 二管之間的偏差也沒有臨床意義。 因此，采血順序的意 義僅限于翼型針或靜脈插管， 這些裝置中的空腔可能使第一管采血量不足。 血小 板功能分析仍然要用第二管， PFA100 血小板功能分析時第一管標(biāo)本的聚集時間 顯著縮短 8，即便是傳統(tǒng)的光學(xué)法血小板聚集率分析也應(yīng)遵循以下原則來避免血 小板的意外激活：室溫下空腹靜息狀態(tài)采血，使用 19-21G 采血針，不能使用前 3-5mL 血， 105-109mM 枸櫞酸鈉緩沖抗凝，不能用氣道傳送系統(tǒng)送檢，從采集 到檢測之前的時間約 30-120min，不應(yīng)超過 4h。玻璃管和塑料試管采血用于凝血

10、檢驗的結(jié)果并不一致， PT、APTT 、Fib、抗 凝血酶，蛋白 C 抗原或活性、蛋白 S活性以及 FXIII 都存在顯著差異 9，但是不 致干擾臨床決策。 無論是健康個體還是口服抗凝劑患者， 總體上塑料試管的結(jié)果 顯著低于玻璃管。 INR水平在 1.5到4.5的范圍內(nèi)偏差由 0.1增至 0.7。因此：實(shí) 驗室更換不同類型的采血管時， 不管其內(nèi)容物和當(dāng)?shù)貤l件如何， 都應(yīng)驗證參考區(qū) 間和診斷閾值。采血量適當(dāng)才能保證最佳抗凝比例（ 1:9），1982年P(guān)eterson 和Gottfried 提 出血量不足產(chǎn)生顯著偏差，特別是 APTT ，而血量多倒影響不大。采血量不足產(chǎn) 生的影響取決于幾個方面：試

11、管材質(zhì)、內(nèi)徑、死腔的體積與表面積之比等。 3mL 試管收集比容正常的標(biāo)本時至少要達(dá)到刻度的 80%，否則凝集時間延長、 Fib 結(jié) 果偏低。 109 mM 抗凝時，健康個體和長效口服抗凝患者的采血量分別達(dá)到要求 的 65%和 90%以上即可準(zhǔn)確檢測 PT，使用中度敏感性凝血活酶試劑( ISI=2.06 ) 時采血量需要高于 80%。根據(jù) CLSI 指南，應(yīng)選用較低濃度枸櫞酸鈉抗凝并據(jù)此 建立參考區(qū)間， 129 mM(3.8%)枸櫞酸鈉抗凝時不僅 PT和 APTT 高于 109 mM 抗 凝10，而且血量不足要求的 80%即降低 PT的可靠性，不足 90%就使 APTT 延長。上述討論的前提是紅

12、細(xì)胞數(shù)目正常， 如果紅細(xì)胞顯著增多， 那么不僅造成血 液與抗凝劑的比例改變，而且會影響檢測結(jié)果，紅細(xì)胞數(shù)目減少的影響不大。 CLSI 在 2008 版指南中明確了當(dāng)紅細(xì)胞比容超過 55%時的校正方法：枸櫞酸鹽濃 度=1.8510Lippi G, Guidi GC, Mattiuzzi C, Plebani M. Preanalytical variability:the dark side of the moon in laboratory testing. Clin Chem Lab Med 2006;44(4):358 365 Lippi G, Favaloro EJ, Salvagno

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15、cause of( 100 Hct)血量。至于混勻方式，采血后立即溫和混勻 4 次 左右，避免劇烈振搖，使血液和枸櫞酸鈉緩沖液之間充分接觸即可。凝血功能檢驗由于受檢成分的活性易于衰減而對標(biāo)本存放有較高要求。 在室 溫條件下隨著時間延長，血漿 PT趨于縮短，但是 24h內(nèi)變化不大； APTT 延長， 不過其偏差不致影響臨床意義，除了肝素抗凝標(biāo)本外，室溫下 8h 以內(nèi)可以重新 測定。與冷藏和室溫條件保存 6h相比，凍存標(biāo)本復(fù)融后 PT和APTT 顯著增高11。 根據(jù) CLSI 指南，常規(guī)凝血檢驗標(biāo)本的處理應(yīng)在采血后 1h 內(nèi) 1500g 離心不超過 15min，離心時的溫度條件不做特殊要求。雖然

16、VII 、VIII 和 vWF 屬于冷激活 因子，但是其變化對 PT、APTT、Fib 和 D-dimer 沒有明顯影響。盡管分析前影響因素在檢驗科的控制范圍以外， 但是我們的職責(zé)仍然是確保 臨床得到患者狀態(tài)的準(zhǔn)確信息， 而不是僅僅提供受檢標(biāo)本的數(shù)據(jù)。 因此，熟悉各 環(huán)節(jié)對凝血功能檢驗的影響因素及其程度， 并積極臨床宣貫， 對于提高凝血檢驗 的質(zhì)量和應(yīng)用具有重要意義。unsuitable specimens in clinical laboratories.Clin Chem Lab Med 2008;46(6):764 7726 Lippi G, Musa R, Avanzini P, Al

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18、 TJ, Williams SA, Salomon DR, et al. Genetics of platelet reactivity in normal, healthy individuals. J Thromb Haemost 2009;7(12):2116 21229 Gosselin RC, Janatpour K, Larkin EC, Lee YP, Owings JT. Comparison of samples obtained from 3.2% sodium citrate glass and two 3.2% sodium citrate plastic blood collection tubes used in coagulation testing. Am J Clin Pathol 2004;122(6):843 84810 Adcock DM, Kressin DC, Marlar RA. Effect of 3.2% vs 3.8% sodium citrate con