大學(xué)土壤微生物分離實驗報告

1、從土壤中分離純培養(yǎng)微生物并作初步觀察鑒定實驗報告生物科學(xué)與技術(shù)系09食品（2）班姓名：xxx學(xué)號：xxx從土壤中分離純培養(yǎng)微生物并作初步觀察鑒定【摘要】利用分離純化微生物的基本操作技術(shù)對土壤中的微生物進行分離與純化，根據(jù)菌落形態(tài)觀察及一系列的生理生化試驗的結(jié)果，對照種屬特征初步鑒定分離純化的微生物所屬的類群?！娟P(guān)鍵詞】細菌 放線菌 霉菌 劃線分離 培養(yǎng)基的配制 高壓蒸汽滅菌前言： 在自然條件下，微生物常常在各種生態(tài)系統(tǒng)中群居雜聚。群落是不同種類微物的混和體。為了生產(chǎn)和科研的需要，人們往往需要從自然界混雜的微生物群體中分離出具有特殊功能的純種微生物；或重新分離被其他微生物污染或因自發(fā)突變而喪失原

2、有優(yōu)良性狀的菌株；或通過誘變及遺傳改造后選出優(yōu)良性狀的突變株及重組株。這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離純化技術(shù)。純培養(yǎng)是指一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細胞或孢子都是由一個細胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。分離純化技術(shù)主要由采集樣品、富集培養(yǎng)、純種分離和性能測定等幾個基本環(huán)節(jié)組成。實驗?zāi)康模?1、學(xué)習(xí)從土壤中分離、純化微生物的原理與方法。 2、學(xué)習(xí)、掌握微生物的鑒定方法。 3、對提取的土樣進行微生物分離、純化培養(yǎng)，根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷未知菌的類別。實驗原理：從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。通過如下幾種方法可以分離純化微生物：稀釋倒平板法(p

3、our plate method)、涂布平板法(spread plate method)、稀釋搖管法(dilution shake culture method)、平板劃線分離法 （stesak plate method）。此次實驗采取的是平板分離法，該方法操作簡便，普遍用于微生物的分離與純化，其基本原理主要包括兩個方面：（一）選擇適合于待分離微生物的生長條件或加入某種抑制劑造成只利于待分離微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單菌落的方法可通

4、過稀釋涂布平板法或平板劃線法等技術(shù)來完成。微生物的觀察可以用顯微鏡觀察其細胞形態(tài)，也可以用肉眼觀察其菌落形態(tài)。前者是微生物的顯微鏡觀察技術(shù)，后者是微生物的肉眼觀察技術(shù)。1. 實驗器材、試劑與實驗方法：1.1器材：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布、培養(yǎng)皿、自動立式壓力蒸汽滅菌器、烘箱、玻璃珠、移液槍、槍頭、稱量紙、藥匙、試管架、接種環(huán)、酒精燈、超凈工作臺。1.2試劑：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO

5、47H2O、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇、75%酒精。1.3土樣：取自漳州師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系植物園，地下10cm-15cm左右。1.4 實驗方法1.4.1配制培養(yǎng)基：(一）配制牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基200ml(用2個100ml三角瓶和2支試管分裝） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普遍的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。 配方如下：牛肉膏 0.6g 蛋白胨 2g NaCl 1g 瓊脂 34g 水 200ml pH 7.4-7.61、稱藥品 按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏和蛋白胨可分別放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。2、

6、加熱溶解 在燒杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻璃棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，在此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補充所失水分。3、調(diào)pH 用pH試紙或酸堿度計檢測培養(yǎng)基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/L NaoH，邊加邊攪拌，并隨時檢測，直至達到所需pH范圍。若偏堿，則用mol/l HCL進行調(diào)節(jié)。pH調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4、過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。5、分裝

7、 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約試管高度的1/5；分裝入三角瓶內(nèi)的以不超過其容積的一半為宜，半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜。6、加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要適合，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防止棉花脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7、包扎 加塞后，將三角瓶的棉花外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防止滅菌時冷凝

8、水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把裝同類培養(yǎng)基的試管扎成捆后，再于棉花塞外一層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8、滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3攝氏度濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。9、擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，使斜面的長度不超過試管總長的1/2；待其凝固，10、無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37攝氏度溫箱中培養(yǎng)24-48h，無菌生長即可使用。或儲存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。(二）配制高氏一號瓊脂培養(yǎng)基200ml(用1個100ml三角瓶和2支試管分裝） 高氏一號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的

9、合成培養(yǎng)基。 配方如下：可溶性淀粉4g，KNO3 0.2g，NaCl 0.1g,K2HPO4.3H2O 0.1g, FeSO4.7H2O 0.002g, 瓊脂34g, 水200mL, pH7.47.6。1、稱量和溶解 先計算后稱量,按用量先稱取可溶性淀粉,放入小燒杯中,并用少量冷水將其調(diào)成糊狀,再加至少于所需水量的沸水中,繼續(xù)加熱,邊加熱邊攪拌,至其完全溶解.對微量成分eSO4.7H2O可先配制成高濃度的儲備液后再加入,方法是先在100 ml 水中加入1g的eSO4.7H2O,配成0.01mg/ml的儲備液,再在200 ml的培養(yǎng)基中加入以上儲備液0.02 ml即可.待所有的藥品完全溶解后,補

10、充水分到所需的總體積.如果要配制固體培養(yǎng)基,其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制.2、pH 調(diào)節(jié)分裝 包扎 滅菌及無菌檢查同上（一）（三）配制馬丁氏培養(yǎng)基200ml(用1個100ml三角瓶和2支試管分裝） 馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。配方如下： K2HPO4 0.2g，MgSO4.7H2O 0.1g, 蛋白胨1g, 葡萄糖2g, 瓊脂34g, 水200mL，自然pH1、稱量和溶解 先計算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需水量的水中。待各成分溶解后，補充水分至所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在200 ml的培養(yǎng)基中加入以上孟加拉紅溶液0.66ml，混勻后，再加入

11、瓊脂加入融化，方法同（一） 2、同（二）23、鏈霉素的加入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培養(yǎng)基融化待其溫度降至45攝氏度左右時才能加入?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液（配好的鏈霉素溶液保存于-20攝氏度），在100ml培養(yǎng)基中加入1%鏈霉素0.3ml,使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30ug。1.4.2 制備土壤稀釋液：1、取土壤 取表層以下510cm處的土壤樣品，放入滅菌的袋中備用，或放在4oC冰箱暫存。2、制備稀釋液（要無菌操作）（1）制備土壤懸液：取土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中（玻璃珠用量以充滿瓶底為最好），振蕩510min，使土樣充分打散，即成10-2的土壤懸液。（2）稀釋：用

12、無菌移液管吸10-2的土壤懸液0.5mL,放入4.5m無菌水中,即為10-3稀釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-310-7的稀釋液。注意：操作時管尖不能接觸液面，每一個稀釋度換一支移液管，每次吸土液，要將移液管插在液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。示意圖如下： 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 0.5ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 稀釋過程示意圖（圖中左側(cè)梯形為三角瓶，其中加入49.5ml無菌水與0.5g土樣，土壤溶液稀釋度為10-2依此類推，右側(cè)三試管中土壤稀釋度分別為： 10-3、10-4、10-5、10-6、10

13、-7 ）1.4.3 混菌測定菌落數(shù)的方法1）細菌 取10-6， 10-7 兩管稀釋液各1ml，分別接入相應(yīng)標號的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。然后取冷卻至50的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中（裝量以鋪滿皿底的2/3為宜），迅速輕輕搖動平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混均，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細菌平板，倒平板時注意無菌操作。2）放線菌 取10-3、10-4兩管稀釋液，在每管中加入10%酚液56滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管吸出1ml加入相應(yīng)標號的平皿中，選用高氏1號培養(yǎng)基，用與細菌相同的方法倒入平皿中，便可制成放線菌平板。3）霉菌 取10-2、10-3兩管稀釋液各1ml，分別接入

14、相應(yīng)的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。在熔好的馬丁氏固體培養(yǎng)基中，每100ml加入滅菌的乳酸1ml，輕輕搖勻，然后用與細菌相同的方法倒入平皿中，便可制成霉菌平板。4）酵母菌 在3）即可能分離到。 1.4.4培養(yǎng) 將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于2830oC恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng)12d，放線菌培養(yǎng)57d，霉菌35d?？捎糜谟^察菌落，用于進一步純化分離或直接轉(zhuǎn)接斜面。1.4.5平板劃線分離微生物 1、倒平板 按無菌操作要求，在潔凈工作臺或在火焰旁操作，取融化并冷卻至不燙手的固體培養(yǎng)基（約50oC），倒入無菌培養(yǎng)皿，倒量以鋪滿皿底為限，平放待其冷卻凝固，備用。 2、劃線分離 使用接

15、種環(huán)，從待純化的菌落或待分離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應(yīng)培養(yǎng)基平板劃線分離（如圖），劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落。 3、培養(yǎng)方法同“土壤稀釋分離”。4、 菌落觀察 從培養(yǎng)好的未知平板中，挑選8個不同的單菌落，逐個編號，根據(jù)菌落識別要點區(qū)分未知菌落類群，并將觀察結(jié)果填入表4-1。1.4.6斜面接種 1、取新鮮固體斜面培養(yǎng)基，分別做好標記（寫上菌名，日期、接種人等），然后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上培養(yǎng)基斜面中。2、接種方法 用接種環(huán)沾取少量待接菌種，然后在新鮮斜面上“之”字形劃（如圖），方向是從下部開始，一直劃至上部。注意劃線要輕，不可把培養(yǎng)基劃破。3、 接種后恒溫培養(yǎng)同1.4.

16、4。2. 試驗結(jié)果與討論從實驗結(jié)果中可以推斷出土壤中分離的微生物的種類，根據(jù)菌落數(shù)判斷土壤中微生物的含量，實驗過程中很多沒注意的事項，可能影響實驗結(jié)果的正確性。2.1實驗的結(jié)果 區(qū)分和識別各大類微生物通常不外乎包括菌落形態(tài)（群體形態(tài)）和細胞形態(tài)（個體形成）等兩方面的觀察。細胞的形態(tài)構(gòu)造是群體形態(tài)的基礎(chǔ)，群體形態(tài)則是無數(shù)細胞形態(tài)的集中反映，故每一大類微生物都有一定的菌落特征，即它們在形態(tài)大小、色澤透明度、致密度和邊緣等特征上都有所差異，一般根據(jù)這些差異就能識別大部分菌落。（一）菌落數(shù)觀察記錄表培養(yǎng)基天數(shù)濃度第一天第二天第三天第四天第五天第六天馬丁氏10-21723 2431 30 37 34 5

17、5 41 64458610-31 2 19 3224434273549573166高氏一號10-43245 48 67638974999816712720810-5146 27 163724483064578183牛肉膏蛋白胨10-6223 32 3547859107111281310-782 35 124829543369407142（二）未知菌落的形態(tài)觀察記錄表菌落號培養(yǎng)基濕干菌落描述判斷結(jié)果厚薄大小松密大小表面邊緣隆起形狀顏色透明度正面反面水溶性色素1牛肉膏蛋白胨薄小光滑濕潤整齊凝膠狀淡黃淡黃無半透明細菌23高氏1號厚大致密小干燥多皺絨狀顆粒狀乳白乳白無不透明放線菌45馬丁氏較厚較大疏松

18、大干燥粗糙地毯狀低凹淺紅粉紅無不透明霉菌6四大類微生物菌落的基本特征菌落形態(tài)細菌菌落表面濕潤，薄而小酵母菌菌落表面濕潤，厚而大放線菌菌落表面干燥，密而小霉菌菌落表面干燥，松而大附加說明：1.三根試管中的菌形態(tài)特征比較明顯，能夠辨認區(qū)分，霉菌菌苔干燥，較松，所以表面粗糙；細菌菌苔濕潤，表面光滑，整體扁平，呈較透明狀態(tài)；放線菌菌苔較干燥，長得較致密。2.倒平板時，時間的掌控至關(guān)重要，操作過慢將導(dǎo)致部分培養(yǎng)基先凝固，平板不平。3.劃線時組員應(yīng)待培養(yǎng)基凝固后劃線，否則部分平板會被劃破；隨著實驗的進行，組員劃線有所進步。4.斜面接種：接種環(huán)較細，力度各方面較難把握。操作時，應(yīng)盡量細心，小心的操作。2.2

19、 討論2.2.1 實驗可靠性分析：由于一些實驗操作細節(jié)處理不當(dāng)，實驗的結(jié)果可能存在一些誤差。但總體上實驗的結(jié)果還是具有一定可靠性的。2.2.2、注意事項：1、稱藥品后應(yīng)做好標志，勿與其它藥品混在一起；稱完藥品應(yīng)及時蓋緊瓶蓋。2、注意pH值不要調(diào)過頭，以免影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。3、使用高壓滅菌鍋應(yīng)嚴格按照操作程序（加水、排冷空氣、降零）進行，避免發(fā)生事故；滅菌時操作者切勿擅自離開。4、應(yīng)用記號筆在相應(yīng)位置注明培養(yǎng)基的名稱、組別、日期。5、干熱滅菌時消毒箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與消毒箱內(nèi)壁的鋼板接觸，以防包裝紙烤焦起火。6、倒平板時時間要掌握好，避免

20、培養(yǎng)基凝固，并且倒完后應(yīng)當(dāng)輕輕搖動平板兩圈，使平板夠平；待培養(yǎng)基凝固后劃線，力度要適當(dāng)，盡量不要將培養(yǎng)基劃破。7、接種時，應(yīng)盡量挑取生長較好，比較純的。8、在接種時候應(yīng)先用酒精燈將接種環(huán)前面的鉑絲燒紅，即對其進行滅菌；待溫度降下來之后再接種。每次接種完后，要進行下一次接種之前，都要采取同樣的方式。9、應(yīng)即時對試管和平板進行觀察，并做相應(yīng)的記錄。10、一般土壤中，細菌最多，放線菌和霉菌次之，而酵母菌主要見于果園和菜園土壤中，故從土壤分離細菌時應(yīng)取較高的稀釋度，否則菌落將連成一片而不能計數(shù)。11、放線菌的生長時間比較長，故制作平板時，培養(yǎng)基的量應(yīng)多加一點。12、觀察菌落特點時應(yīng)選擇分離的較開的很大的菌落，對培養(yǎng)基和試管要編好號碼，不要隨意移動開蓋，以免搞混菌號或受到污染。13、實驗完成后，應(yīng)對實驗數(shù)據(jù)的收集、處理和篩選。認真比對分析并作好記錄，通過老師的指導(dǎo)及查閱相關(guān)文獻對數(shù)據(jù)進行正確的篩選和整理，最終得到實驗結(jié)果。 2.2.3心得體會：（1） 通過實驗我們學(xué)習(xí)了微生物實驗中較基本的操作技能，掌握了配置培養(yǎng)基的一般方法和步驟、從土壤中分離微生物的方法，對無菌操作技術(shù)有了一定的了解，同時使組員的合作更加高效、密切。（2）在做關(guān)于分離實驗時，無菌操作特別重要。因操作不當(dāng)很容易感染，使所做的平板或斜面失敗，故操作前應(yīng)先