細(xì)胞周期同步化

1、細(xì)胞周期同步化在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞多處于不同的細(xì)胞周期時(shí)相中，其中有少數(shù)細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂 活動(dòng)，其余細(xì)胞分別處于 G1、S 和 G2各期。不同時(shí)相的細(xì)胞對(duì)藥物干預(yù)存在不同反應(yīng)，會(huì) 影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，因此，需要獲得周期一致性的細(xì)胞。利用細(xì)胞同步化技術(shù)可使細(xì)胞大 量的處于同一細(xì)胞時(shí)期，并可獲得該時(shí)期大量的物質(zhì)，如細(xì)胞中期時(shí)的染色體。 細(xì)胞周 期同步化 （synchronization） 是指為了研究某一時(shí)相細(xì)胞的代謝、增殖、基因表達(dá)或凋 亡，借助某種自然或人為的實(shí)驗(yàn)手段 , 使細(xì)胞群體中處于細(xì)胞周期不同時(shí)相的細(xì)胞停留在同 一時(shí)相 （ 除了 G0期的細(xì)胞 ） 的現(xiàn)象。細(xì)胞同步化本質(zhì)上包括用一定的

2、方法 獲得一定數(shù)量的 同步化細(xì)胞群 和 使細(xì)胞進(jìn)入同步化生長(zhǎng) 的兩層含義。DNA 合成抑制法 是通過(guò)抑制 DNA合成將細(xì)胞同步于同一時(shí)期的方法。 高濃度 TdR（胸腺嘧 啶核苷）雙阻斷法 是目前常用的抑制 DNA 合成的同步化方法。它 可逆地抑制 DNA 合成，而 不影響其他時(shí)期細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)，最終可將細(xì)胞群 阻斷在 S 期或 G1 /S 交界處 。其原理是 : Td 是細(xì)胞 DNA 合成不可缺少的前體，但向培養(yǎng)基中加入過(guò)量Td，可形成 過(guò)量 的三磷酸腺苷，后者能 反饋抑制 其他核苷酸的磷酸化，從而抑制 DNA 合成。它將細(xì)胞同步于 G1 /S 期 交界處， 同步化程度高 ，適用于 任何培養(yǎng)體系

3、，可將幾乎所有的細(xì)胞同步化，但是 容易產(chǎn) 生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大 。 Td 雙阻斷法因?yàn)楹?jiǎn)單易行且可逆，在腫瘤藥理方面 對(duì)細(xì)胞周期同步化的實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛的應(yīng)用。羥基脲 、5- 氟脫氧尿嘧啶 、阿糖胞苷 、氨甲蝶呤 和 高濃度 ADR、 GDR也屬于 DNA合成抑制劑，它們與 TdR作用相似，均可通過(guò)抑制 DNA合成達(dá)到同步化的目的。中期阻斷法 是利用 破壞微管 的藥物將細(xì)胞阻斷在 M期 從而得到同一時(shí)期細(xì)胞的方法，常 用的藥物有 秋水仙素 等。秋水仙素通過(guò)抑制微管的聚合，進(jìn)而抑制有絲分裂裝置的形成， 將細(xì)胞阻斷于有絲分裂中期然后再釋放使細(xì)胞達(dá)到同步化。中期阻斷法 非平衡生長(zhǎng)問(wèn)題不 明

4、顯 ，但可逆性比較差 ，當(dāng) 阻斷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，許多細(xì)胞產(chǎn)生異常分裂 。過(guò)去研究中也發(fā) 現(xiàn)，同步后的細(xì)胞的生長(zhǎng)能力明顯不如撤去阻斷劑后得到的 S 期細(xì)胞旺盛。 秋水仙胺 、 Nocodazole 也是目前常用的中期阻斷劑。經(jīng)過(guò)同步化之后的細(xì)胞可以通過(guò) 流式細(xì)胞術(shù) 對(duì)其周期進(jìn)行分析 。將細(xì)胞用 PI （碘化丙 啶）染液進(jìn)行染色，使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比。由于細(xì)胞的 DNA含量在不同時(shí)期有顯著的差異，因此可以將細(xì)胞分成G1/G0期( 1倍) ，S期( 1-2倍)和G2/M期( 2倍) 。流式細(xì)胞儀可以 根據(jù) DNA含量在不 同時(shí)間內(nèi)的變化 , 從而確

5、定細(xì)胞周期的長(zhǎng)短 , 也可以直接 標(biāo)記 DNA復(fù)制(放射性同位素標(biāo) 記) , 統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量與標(biāo)記細(xì)胞的百分比 , 對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行綜合分析 .連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)過(guò)程為細(xì)胞周 期(cell cyc1e) 。細(xì)胞周期包含四個(gè)階段： G1期 (first gap),又稱(chēng)合成前期，指前一次有絲分裂完成到 DNA復(fù)制前的一段時(shí)期； S期(synthesis phase),即 DNA合成期，為真核細(xì)胞分裂 (cell pision) 間期中進(jìn)行 DNA合成的階段； G2期 (second gap), 為 DNA合成 后期，指 DNA合成結(jié)束至有絲分裂開(kāi)始之間的

6、一個(gè)階段；M期 (mitosis or pision) ,又稱(chēng) D 期，是染色體真正開(kāi)始分離時(shí)期。細(xì)胞周期又可分為有絲分裂期(M期)和分裂間期(即 G1SG2)兩個(gè)時(shí)期。盡管細(xì)胞周期中各期的持續(xù)時(shí)間因不同細(xì)胞類(lèi)型而異，但相 對(duì)而言 M期最短， S期較長(zhǎng) 。流式細(xì)胞儀( flow cytometer ； FCM)的工作原理是在樣品管 中放入待測(cè)細(xì)胞，在氣體的壓力下使待測(cè)細(xì)胞進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在細(xì)胞流動(dòng)室里單 細(xì)胞懸液被鞘流液包繞通過(guò)流動(dòng)室內(nèi)一定孔徑的孔，形成細(xì)胞柱。然后通過(guò)對(duì)流動(dòng)液體中 單列的細(xì)胞進(jìn)行逐一檢測(cè)，得到單個(gè)細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，在功能水平上定量分析出 其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、 DNA

7、、 RNA、蛋白質(zhì)、抗原等的物理、化學(xué)特征等多個(gè)參數(shù)。流式細(xì)胞 儀不僅可以根據(jù)不同時(shí)間內(nèi) DNA含量的變化來(lái)確定細(xì)胞周期的長(zhǎng)短，還可以直接用放射性 同位素標(biāo)記 DNA復(fù)制，通過(guò)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)目與比較各時(shí)相細(xì)胞的百分比來(lái)檢測(cè)是否達(dá)到預(yù)期 目的，從而對(duì)細(xì)胞周期各時(shí)相進(jìn)行綜合分析。流式細(xì)胞分析法與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比， 具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。Hela細(xì)胞周期時(shí)間為 21 h，其中 G1期為10 h，S期為7 h，G2期為3 h，M期為 1 h。一、 S期同步化方法 (胸腺嘧啶核苷雙阻斷法，兩次可讓細(xì)胞同步化到 G1/S期) 胸腺嘧啶核苷 (TdR) 雙阻

8、斷法：在處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的培養(yǎng)基中首次加入過(guò)量的DNA合成抑制劑 TdR，能可逆地抑制 S 期細(xì)胞的 DNA生成，而不作用其他細(xì)胞階段的運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致大 多數(shù)細(xì)胞群被同步化于 G1/S 期交界處，但仍有部分細(xì)胞處于 S期范圍；移去胸腺嘧啶核 苷，細(xì)胞再培養(yǎng)一段 比 S 期較長(zhǎng)而短于 G2、M、G1三期總和的時(shí)間 ，讓它們完全越過(guò) S 期，但又不使按周期發(fā)展最快的細(xì)胞進(jìn)入下一個(gè)S 期。第二次胸腺嘧啶核苷處理，當(dāng)細(xì)胞繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)至 G1/S 交界處時(shí)，被過(guò)量的胸腺嘧啶核苷抑制而停止。細(xì)胞則于 G1/S 期邊界匯 集，再次撤掉胸腺嘧啶核苷，加入完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，則細(xì)胞同時(shí)啟動(dòng)于 S 期。 5-氟

9、脫氧尿嘧啶、羥基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高濃度AdR和 GdR等 DNA合成抑制 劑均可抑制 DNA合成使細(xì)胞同步化，由于 高濃度胸腺嘧啶核苷對(duì) S 期細(xì)胞的毒性較小 ，因 此常用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法誘導(dǎo)細(xì)胞同步化。其優(yōu)點(diǎn)是同步化程度高，適用于任何培養(yǎng) 體系。幾乎可將 所有的細(xì)胞 同步化，缺點(diǎn)是造成 非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大 。二、 M期 同步化方法（ 振蕩收集法 ）該法利用 M期細(xì)胞變圓易脫落 的特點(diǎn)。在處于對(duì)數(shù)增殖期的單層貼壁細(xì)胞（分裂活躍， M 期多）中加入 Nocodazole 。一段時(shí)間后，多數(shù)細(xì)胞被阻滯與 M期，輕輕振蕩或拍擊培養(yǎng) 瓶， M期細(xì)胞則與瓶壁脫離，懸浮在培養(yǎng)液中，收

10、集培養(yǎng)液，之后再加入新鮮培養(yǎng)液，按 照此法繼續(xù)收集，可得到一定數(shù)目的M期細(xì)胞。振蕩收集法操作簡(jiǎn)單，同步化程度高并且細(xì)胞不受藥物傷害，能夠真實(shí)反映細(xì)胞周期狀況，缺點(diǎn)是由于M期較短，被分離出的 細(xì)胞很少 ，只能應(yīng)用于貼壁細(xì)胞 。收集到的有絲分裂期的細(xì)胞可以 貯存在冰上 ，然后處理其余 的培養(yǎng)瓶。三 . 實(shí)驗(yàn)用品1. 材料： Hela 細(xì)胞。2. 試劑： %胰蛋白酶液、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液、 DAPI試劑、 Hanks 液、 2mmol/L TdR 、70 乙醇（保存于 4）、 RNase-A（ 10mg/ml,-20 保存）、 PI （ 650 g/ml ，避光保存于 - 20）、 PBS （pH 保

11、存于 4） 、秋水仙胺、秋水仙素。3. 器材：培養(yǎng)瓶、移液器、槍頭、 5ml 注射器、試管、離心管、封口膜、微量移液器、 Tips 、燒杯、廢液缸、細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備、倒置顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、水浴、4冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、 N2 罐、流式細(xì)胞儀、超凈工作臺(tái)。四. 實(shí)驗(yàn)步驟（ 一 ）S 期同步化方法（ TdR 雙阻斷法）（1）取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。（2）第一次阻斷：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的培養(yǎng)基換成含 2mmol/L 的新鮮 TdR 培養(yǎng)液。（3）37 、 5%CO二 氧化碳培養(yǎng)箱 中培養(yǎng) 12h（4）第一次 釋放 ：棄去含有胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基，用Hanks 液對(duì)貼壁細(xì)胞漂洗 23次，并更換不含 TdR的新鮮

12、培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 16h。（5）第二次阻斷：棄去培養(yǎng)液，再加入濃度為 2mmol/LTdR 的新鮮培養(yǎng)基， 37 、 5%CO培 養(yǎng) 12h 。(6) 第二次釋放：重復(fù)第( 4)步驟，此時(shí)的細(xì)胞大部分出去 G1/S 期邊界，同步化細(xì) 胞隨時(shí)間推移逐漸進(jìn)入 S 期。二) M期同步化方法(振蕩收集法)(1) 取生長(zhǎng)于占瓶底面積 60% 80%的細(xì)胞一瓶，輕輕搖晃或拍擊培養(yǎng)瓶，使松動(dòng)細(xì)胞 脫落而懸浮在培養(yǎng)液中，并用離心管收集。(2) 用 Hank 洗滌 2次，漂洗液收集到離心管。(3) 600rpm 離心 5分鐘，并用培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為105 個(gè)/ml 接種于培養(yǎng)瓶。( 三 ) 利用流式細(xì)胞術(shù)分

13、析細(xì)胞周期時(shí)相(1) 將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)上清，用 Hanks 液洗滌細(xì)胞一次， 胰酶消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基終止，收集細(xì)胞。 1200rmp 5min 離心，棄去上清。(2) 4 預(yù)冷的 PBS漂洗細(xì)胞沉淀 2次， 1500rmp離心 5分鐘，收集細(xì)胞。(3) 快速將細(xì)胞懸液注入預(yù)冷的 70%乙醇中，封口膜封口。 4固定過(guò)夜(可長(zhǎng)至 2 周)。(4) 1500rmp 離心 5 分鐘去固定液，收集固定細(xì)胞，用PBS使細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)至試管中吹打均勻(防止細(xì)胞破碎)。 PBS漂洗 2 次。(5) 細(xì)胞染色液配制： 40加碘化丙啶( PI )母液( 2 mg/ml )： 100RNA酶

14、 A母液 (10 mg/ml )： 1PBS =25： 10： 1000。(6) 細(xì)胞染色：根據(jù)細(xì)胞量，加入一定體積的細(xì)胞染色液(1)重懸，使上機(jī)時(shí)細(xì)胞通過(guò)率為 200 350 Cell/s 。(7) 用 300 目(孔徑 4050 m)的篩網(wǎng)過(guò)濾于流式上機(jī)管中，上機(jī)檢測(cè)。(8) 樣品分析測(cè)定及打印。( 四 ) 秋水仙素阻抑法(1) 將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。(2) 加入秋水仙素，使培養(yǎng)基最終濃度為g/mL，作用 67 小時(shí)。(3) 收集細(xì)胞， 800rpm離心 510 分鐘，棄去上清，沉于管底的細(xì)胞即為M期細(xì)胞。( 五 )N2 阻斷法(1) 將細(xì)胞傳代培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期。(2) 將培養(yǎng)瓶置于 N

15、2罐中并通入適量 CO2(約相當(dāng)于罐中體積的 5) 。(3) 關(guān)閉 N2罐，連接 N2管子和壓力表，慢慢向罐中充入氮?dú)庵钡綁毫?090 磅英寸 為止。(4) 將 N2裝置放在 37培養(yǎng)箱中 1016 小時(shí)。次日取出，然后緩緩放出N2(最好放出窗外)。(5) 取出細(xì)胞觀察同步化效果，并用振蕩法收集細(xì)胞于離心管中。(6) 800rpm 離心 10 分鐘，收集細(xì)胞。六) G1 期和 G2期細(xì)胞的獲得1G2期細(xì)胞的獲得根據(jù)細(xì)胞周期測(cè)定的數(shù)值，使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法使細(xì)胞同步化于 G1/S 期交界處 后，使細(xì)胞釋放胸腺嘧啶核苷后繼續(xù)培養(yǎng)。其培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)大于 S 期時(shí)間并小于 S期與 G2期總和的時(shí)間。

16、然后先用振蕩收集法使已進(jìn)入M期的細(xì)胞脫落瓶壁，棄去上清培養(yǎng)基；再用胰酶消化，加入新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，即為G2期細(xì)胞。2G1期細(xì)胞的獲得(1) 向用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法獲得的細(xì)胞中加入一定量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)大于S+G2+M期小于一個(gè)周期的時(shí)間即可獲得 G1期細(xì)胞。(2) 向細(xì)胞中加入 缺乏異亮氨酸 的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間 超過(guò)一個(gè)細(xì)胞周期 ，即可 獲得 G1 期細(xì)胞。Common methods for mammalian cell cycle synchronization.MethodSynchrony inducing agent or treatmentmecha

17、nism of actionCell cycle stage blockedChemical/pharmacolLovastatinInhibition of HMG-CoAEarly G1ogical inhibitionreductase (cholesterolof DNAsynthesis) and thereplication/syntheproteasomesis or mitoticMimosineInhibitionLate G1;spindle formationof thymidine,G1/SMitogen or growth factor withdrawalDensi

18、ty arrestbiosynthesis, inhibition ofCtf4/chromatin bindingThymidineTdRExcess thymidine- induced feedback inhibition of DNA replicationG1/SAphidicolinInhibition of DNA polymerase- and DNA polymerase- G1/SHydroxyureaInhibition of ribonucleotide reductaseG1/SColchicineColcemideInhibition of microtubule polymerizati