熒光光譜的原理及應(yīng)用

1、馮蕊福州大學(xué)測(cè)試中心熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理熒光光譜的基本原理熒光定義熒光是磁飪迂的一種，是物質(zhì)從裁發(fā)惑 失活到運(yùn)住相同的低能狀態(tài)時(shí)所釋放的 輻射?；鶓B(tài)和激發(fā)態(tài)當(dāng)一個(gè)分子中的所有電子的排布都遵從磁極時(shí)，此分子被稱為處于基態(tài)。激發(fā)態(tài)：當(dāng)一個(gè)分子中的電子排布不完全遵從赦適瀕理 時(shí)，此分子被稱為處于激發(fā)態(tài)。構(gòu)造原理：電子在原子或分子中排布所遵循的規(guī)則。能量最低原理”泡利不相容原理-洪特規(guī)則5電子激發(fā)態(tài)的多重度M = 2S+1s為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和（0或1）；基態(tài)U號(hào)態(tài)峨發(fā)單審態(tài)厭發(fā)三審態(tài)T根據(jù)洪特規(guī)則（平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定）.三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí) 任；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單更

2、態(tài);內(nèi)轉(zhuǎn)換雅布隆斯基分子能級(jí)圖&卜轉(zhuǎn)分子能級(jí)與躍遷分子能級(jí)比原子能級(jí)復(fù)雜；在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí);激發(fā)：基態(tài)JSjf激發(fā)態(tài)IS、Q激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí)）：吸收 特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位；失活： 激發(fā)態(tài)f基態(tài):多種途徑和方式（見能級(jí)圖）；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì);第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài)S、Q； 第一、第二、電子激發(fā)三靈態(tài)T、T2 ；發(fā)射磷振動(dòng)她像躍遷規(guī)則Franck-Condon 原理：在電子躍遷完成的瞬間，分子中據(jù)寧細(xì)能型是來不及改 變的。躍遷前后似尹疣軸迦有發(fā)生改變、躍遷過程中電子口旋&為 改變、躍遷前后購(gòu)子的軌道桎空間有較大的重樟和軌道的對(duì)映性 發(fā)生了

3、改變的躍遷是允許的；躍遷過程中電子自磁生了改變、躍遷前后電子的軌道在空間不 重疊或軌道的對(duì)映性升發(fā)生改變的躍遷是禁阻的.失活的途徑子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài).容易返回基態(tài)，在這個(gè)過程中通過 磁獗迂（發(fā)光）和龍?zhí)N豹溉迂等方式失去能最,這個(gè)過程就稱為失活.失活途徑輻射躍遷I系間竄越內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛係10液鬆停留時(shí)間短.返回速度腆途毀.發(fā)生的幾率大.無輻射躍遷失活的途徑動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振 動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí) 間一般為10nSo內(nèi)轉(zhuǎn)換：多重度相同的電子能級(jí)中等能級(jí)間的無輻射能級(jí)躍遷。通過內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動(dòng)弛豫,高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一 激發(fā)單重態(tài)的最

4、低振動(dòng)能級(jí)。11外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn) 移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換或磷光嗣或猝滅”。系間竄越：不同多重態(tài)，有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。改變電子口旋,禁阻躍遷,通過口4 軌道耦合進(jìn)行。12輻射躍遷失活的途徑熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)f基態(tài)（多為 S f 躍遷），發(fā)射波長(zhǎng)為2的熒光；10-710T S .由圖可見.發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小P波長(zhǎng)長(zhǎng); 2 2 久 2 久 I ；磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)基態(tài)（多為 珀f 4躍遷）；發(fā)射波長(zhǎng)為 弘的磷光；10-4100 s 電子由 氏進(jìn)入7；的可能過程：（7；禁阻躍遷） 氏一

5、激發(fā)一振動(dòng)弛豫f內(nèi)轉(zhuǎn)換系間竄越振動(dòng)弛豫一7； 發(fā)光速度很慢,光照停止后可持續(xù)一段時(shí)間.13主要光譜參量化合物的吸收光強(qiáng)與入射光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線O激發(fā)譜聞定紐滋長(zhǎng)（一般將其固定于發(fā)射波段中感興趣的峰位），掃描 出的化合物的總購(gòu)細(xì)熒光/磷光）與入銚級(jí)長(zhǎng)的關(guān)系曲線。發(fā)射譜圖融發(fā)玆長(zhǎng)（一般將其固定于激發(fā)波段中感興趣的峰位）,掃描出 的化合物的羞的寵資熒光/磷光）與人冊(cè)淤長(zhǎng)的關(guān)系曲線。14主要光譜參量磁進(jìn)反映出的足物質(zhì)的基態(tài)能級(jí)與激發(fā)態(tài)能級(jí)Z間所有的允許躍遷。 通常狀態(tài)下的物質(zhì)的葩泌大部分時(shí)候取決于其磁證住.滋發(fā)諸則反映的是基態(tài)與所有與該熒光發(fā)射有關(guān)的能級(jí)之間的躍遷.其所 呈現(xiàn)的關(guān)系比吸收譜要有選擇性.但

6、有時(shí)候又不如吸收譜來的宜接.蔥在溶液中的吸收（虛線） 和發(fā)射（實(shí)線）光詛電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí) 時(shí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量（如 能級(jí)圖人，人），產(chǎn)生不同吸 收帶，但均回到第一激發(fā)單 重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷 回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的 熒光（如穢2 ）因此，題15f斯托克位移-個(gè)化合物的發(fā)射光譜常常與其吸收光譜很類似，但總是較相應(yīng)的吸收光譜紅移，送稱為斯托克位移（Stokeshifts .16斯托克位移產(chǎn)生斯托克位移的主要原因:1躍遷到激發(fā)態(tài)高振動(dòng)能級(jí)的激發(fā)態(tài)分子，首先以更快的速 率發(fā)生振動(dòng)弛豫（其速率在10】3/s數(shù)量級(jí)），散失部分能量， 達(dá)到零振動(dòng)能級(jí)，一般從零振動(dòng)能級(jí)發(fā)射熒光；2激發(fā)態(tài)形成后

7、，其分子的構(gòu)型將很快進(jìn)一步調(diào)播，以達(dá)到 激發(fā)態(tài)的穩(wěn)定構(gòu)型，這又損失了部分能就；”3.發(fā)射熒光的激發(fā)態(tài)多為（7T, 7T*）態(tài)，這種激發(fā)態(tài)較基態(tài) 時(shí)有更大的極性，因此將在更大程度上為極性溶劑所穩(wěn)定，使 激發(fā)態(tài)的能量進(jìn)一步降低。17反斯托克位移不過，有時(shí)在高溫下也可觀察到磁狂啟痙現(xiàn)象，即熒光光譜移向 吸收光譜的短波方向。這是由于髙溫使更多的激發(fā)態(tài)分子處于高振動(dòng) 能級(jí)，熒光主要從激發(fā)態(tài)的高振動(dòng)能級(jí)發(fā)出所致18既沒發(fā)生斯托克位移也沒發(fā)生反斯托克位移的熒光稱去磁龍。鏡像規(guī)則熒光發(fā)射是光吸收的逆過程。熒光發(fā)射光譜與吸收光譜有類似鏡影 的關(guān)系。但當(dāng)激發(fā)態(tài)的構(gòu)型與基態(tài)的構(gòu)型相差很大時(shí)，熒光發(fā)射光 譜將明顯不同

8、于該化合物的吸收光譜。250330400500蕙的乙醇溶液的熒光光謂（右）和眠收光譜（左）圖A/nm19熒光光譜與磷光光譜熒光光譜固定澈發(fā)光波長(zhǎng)物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度與發(fā) 射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線，如右圖中曲線口。熒光本身則是由電子在兩能級(jí)間不發(fā)生自 旋反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光。磷光光譜荼的澈發(fā)光W（I）.熒光 （II）和確光（111）光譜圖固定激發(fā)光波長(zhǎng)物質(zhì)發(fā)射的磷光強(qiáng)度與 發(fā)射光波長(zhǎng)關(guān)系曲線，如右圖中曲線 磷光本身則是由電子在炳能級(jí)間發(fā)生自旋 反轉(zhuǎn)的輻射躍遷過程中所產(chǎn)生的光.光譜圖21內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒 光，如色胺酸中的重鉆酸鉀；自吸收現(xiàn)象

9、：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)端與其吸收光譜的長(zhǎng)波長(zhǎng)端重疊，產(chǎn)生自吸收；如恿化合物。22熒光壽命熒光壽命 是熒光強(qiáng)度衰減為初始時(shí)的1/e所需要的時(shí)間, 常用I表示。如熒光強(qiáng)度的衰減符合指數(shù)衰減的規(guī)律：T T p-kt 丄t 一丄0。其中I。是激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度，g是時(shí)間t時(shí)的熒光強(qiáng)度，k是衰滅常 數(shù)。假定在時(shí)間i時(shí)測(cè)得的匚為I。的1/e，則i是我們定義的炎龍厠。23inaxShort pulse壽命T是衰減常數(shù)k的倒數(shù)。事實(shí)上.在瞬間激發(fā)后的某個(gè)時(shí)間，熒光強(qiáng)度 達(dá)到最大值，然后熒光強(qiáng)度將按指數(shù)規(guī)律下降。從最大熒光強(qiáng)度值后任一 強(qiáng)度值下降到其1/e所需的時(shí)間都應(yīng)等于“24如果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒

10、光的方式丟失能量，則熒光壽命與熒光發(fā)射速率的衰減常數(shù)成反比。因此有= 1/Kps叢示熒光分子的固有熒光壽命,&浪示熒光發(fā)射速率的衰減常數(shù)。莢吻潑射速華即為單位時(shí)間中發(fā)射的光子數(shù)。25熒光壽命處于激發(fā)態(tài)的分子，除了通過發(fā)射熒光回到基態(tài)以外，還會(huì)通過一 些其它過程（如淬滅和能最轉(zhuǎn)移）回到基態(tài)，其結(jié)果是加快了激發(fā)態(tài) 分子回到基態(tài)的過程（或稱失活過程），結(jié)果是熒光壽命降低菱塾和這些過程的速率常數(shù)有關(guān)，總的失活過程的速率常數(shù)k可以 用各種失活過程的速率常數(shù)之和來表示：k=kF+Ski&表示各種非輻射過程的衰減速率常數(shù)。則總的壽於Z為：t =l/k=l/ (kp+kj)熒光壽命由于吸收幾率與發(fā)射幾率有關(guān)，

11、T占最大吸收位置的摩爾消光系數(shù) x （單位為cmmol.或（mol-dm 3） cm *）也密切相關(guān)。從下式可以得到的粗略估計(jì)值（單位為秒幾1/工嚴(yán)104 8max注意：在討論壽命時(shí)，不要把壽命與尿遷時(shí)聞混淆起來躍遷時(shí)間是躍遷 頻率的倒數(shù)，而壽命是指分子在某種特定狀態(tài)下存在的時(shí)間。27延遲熒光通過測(cè)量壽命，可以得到有關(guān)分子結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)方面的信息。一般熒光壽命為10-8s,最長(zhǎng)可達(dá)10-6so但有時(shí)卻可能 觀察到長(zhǎng)達(dá)10一。這種長(zhǎng)壽命的延時(shí)發(fā)射的熒光，被稱為産舷龍或緩發(fā)熒光。延遲熒光與普通熒光的區(qū)別主要在于磁麥虛還甸.這種長(zhǎng)壽命 的延遲熒光來源于從第一激發(fā)三重態(tài)（TJ直新生成的S1態(tài)的輻射躍 遷

12、。即延遲熒光產(chǎn)生的過程為：SjT1SjS（）+hvf28延遲熒光當(dāng)?shù)谝患ぐl(fā)單重態(tài)Si與第一激發(fā)三重態(tài)T|能差較小時(shí)，T】態(tài)有時(shí)可從 環(huán)境獲取一定的熱能后又達(dá)到能量更高的Si態(tài)。即TiSi這種現(xiàn)象首先從四澳熒光素(eosin)觀察到，故礙名E型延遲熒光。P型延遲熒光：當(dāng)單重態(tài)(SJ與三重態(tài)(TJ能差較大時(shí)，Ti不可能靠從環(huán)境取 得熱能而到達(dá)S】態(tài)。這時(shí)有可能在兩個(gè)三重態(tài)分子靠近時(shí)，通過兩 個(gè)三畫態(tài)分子的湮滅過程畫新生成S】態(tài).即S j+S| T1 1 T1) S(|+S | So+Sy+hVp這種現(xiàn)象首-先從花(pyrene)和菲(phenanthrence)觀察到，故得名29熒光童齊產(chǎn)爭(zhēng)是物質(zhì)

13、熒光特性中最基本的參數(shù)之一，它表示物質(zhì)發(fā)30射熒光的效率。熒光雖子產(chǎn)率通常用4來表示，定義為熒光發(fā)射量子數(shù)與被物質(zhì)吸收 的光子數(shù)公J也可表云為熒光發(fā)射強(qiáng)度與被吸收的光強(qiáng)N比.或表 云為熒光發(fā)射速率烏吸收光速率常數(shù)N比 RP：4 =熒光發(fā)射量子數(shù)/吸收的光子數(shù)=kjSj/吸光速率=If/Ia量子產(chǎn)率一般情況下，熒光量子產(chǎn)率（）不隨激發(fā)光波長(zhǎng)而改變，這被稱為 Kasha VavilovfllJ.但如果形成的激發(fā)態(tài)會(huì)導(dǎo)致化學(xué)反應(yīng)或系間竄越 與內(nèi)轉(zhuǎn)換的競(jìng)爭(zhēng)，則可能使e受到影響。例如，在低壓氣相以254 nm 的光激發(fā)苯，4 = 0.4,而當(dāng)以小于240 nm的光激發(fā)苯時(shí)，則未檢測(cè) 到熒光.這是由于苯的

14、高振動(dòng)能級(jí)的S,態(tài)會(huì)使其轉(zhuǎn)變?yōu)槎磐弑?不同 化合物的差別可以很大另外，e還會(huì)受環(huán)境（如溫度、溶劑尊）的影響，例如，降低溫度 可導(dǎo)致一個(gè)化合物的e增大，提高溫度可導(dǎo)致一個(gè)化合物的e降低。31由于熒光的非單色性、各向的不均勻性和二級(jí)發(fā)射等原因，熒光量 子產(chǎn)率的直接測(cè)定的重復(fù)性往往較差。因此，實(shí)際測(cè)量中大多采用的 是相對(duì)法,即用一已知其熒光量子產(chǎn)率的參比化合物在相同條件下對(duì) 照測(cè)定，并可通過公式計(jì)算目標(biāo)化合物的熒光量子產(chǎn)率：4 = sIesc/（Isc）九、C.和.分別足參照物的熒光量子產(chǎn)率（已知）.摩爾消光系數(shù)、溶 液濃度和熒光強(qiáng)度；0、C和I分別是被測(cè)物的熒光量子產(chǎn)率（未知）、賺 爾消光系數(shù).溶

15、液濃度和熒光強(qiáng)度畚照物應(yīng)是d已知.無自吸收、無濃度猝滅.在被測(cè)物所用溶劑中可溶、盪 磁、盛和竝逐越fi?的物質(zhì)。常用的參照物如羅丹明B和睫咻硫酸氫鹽 等。32熒光產(chǎn)生的條件化合物能夠產(chǎn)生熒光的必要條件是:3334它吸收光子發(fā)生多重性不變的躍遷時(shí)所吸收的能最小于斷裂其最弱的化學(xué)鍵所需要的能量。另外，化合物要能發(fā)生熒光，其結(jié)構(gòu)中必須有敘基團(tuán)。 熒光基團(tuán)都是才療不翻7超的基團(tuán)，當(dāng)這些基團(tuán)是分子的 共軌體系的一部分時(shí)，則該化合物可能產(chǎn)生熒光。影響熒光的主要因素1熒光助色團(tuán)與熒光消色團(tuán):可便化合物熒光増強(qiáng)的基團(tuán)被稱為熒光助色團(tuán)。一般為給電子取代基、如-冊(cè)2、-0H等。相反，吸電子基團(tuán) 如-COOH、-C

16、N等將減弱或抑制熒光的產(chǎn)生，被稱為突影響熒光的主要因素增加稠合環(huán)可增強(qiáng)熒光:增加共平面的稠合環(huán)的數(shù)目，特別是當(dāng)稠合環(huán)以線型排列時(shí)，將 有利于體系內(nèi)兀電子的流動(dòng)，從而使體系發(fā)生躍遷所需吸收的能繪 降低，進(jìn)而有利于熒光的產(chǎn)生。3.提高分子的剛性可增強(qiáng)熒光：剛性增強(qiáng)后，將減弱分子的振動(dòng)，從而使分子的激發(fā)能不易因振 動(dòng)而以熱能形式釋放；另外，分子剛性的增加常有利于增加分子 的共平面，從而有利于増大分子內(nèi)兀電子的流動(dòng)性，也就有利于熒 光的產(chǎn)生.35影響熒光的主要因素激發(fā)態(tài)電子組態(tài)的影響：根據(jù)電子躍遷規(guī)則，S|態(tài)的電子組態(tài)是（兀，分）態(tài)時(shí)，有利于熒 光的產(chǎn)生，當(dāng)S態(tài)的電子組態(tài)是（n, x*）態(tài)時(shí)，不利于熒

17、光的產(chǎn) 生.5. 重原子將導(dǎo)致熒光量子產(chǎn)率的降低：重原子具有增強(qiáng)系間審越的作用，將増大從S態(tài)向T|態(tài)的系間審越的速率常數(shù)和量子產(chǎn)率，從而導(dǎo)致降低熒光量子產(chǎn)率。36彩響熒光的主要因素溶劑極性的影響:增加溶劑的極性，一般有利于熒光的產(chǎn)生。7.5l度的影響:降低體系溫度可以提高熒光量子產(chǎn)率。&其它影響因素如氫鍵.吸附.溶劑粘度增加等均可提高熒光的量子產(chǎn)率.這都 可用減少了分子的熱振動(dòng)和增加了分子的剛性來解釋。373.C.H,CH270 310270- 3201017M墓*27” 32017M代*C.H,F270- 32010W代QHC1275- 3457演代*3 SO5離代CJHJ0C.HQH25

18、36518酚離子CH.0-3】0 40010萃甲C.H,OCH.285- 34520胺310 40520苯胺離子C 已 NHf0琴甲C3,COOH310 3如3蘋矗c6h5cn20 3602003839熒光光譜儀的基本原理在實(shí)驗(yàn)樣品受到激發(fā)的 情況下，通過選擇合適 的探測(cè)器和工作模式， 記錄下發(fā)射光強(qiáng)與激發(fā) 源特性、樣品特性以及 溫度、時(shí)間、空間、能 量等相關(guān)特性之間的關(guān) 系，以此來更好的研究 或利用發(fā)光過程.40熒光光譜儀的原理、操作及數(shù)據(jù)處理樣品準(zhǔn)備塊狀體1. 為了獲取盡可能理想的光譜，減小內(nèi)外表面因素的干擾，最好切2. 如果要做系列樣品特性的對(duì)比，應(yīng)盡還:在尺寸和光潔度上將其制為4. 對(duì)

19、于與各項(xiàng)異性有關(guān)的測(cè)試，務(wù)必要注意龍沁込上5. 對(duì)于有舷農(nóng)特性的樣品要注意其對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響。41樣品準(zhǔn)備粉體和微晶1. 避免混入諸如濾紙纖維、膠水等雜質(zhì),以免其發(fā)光對(duì)測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生 影響。2. 樣品應(yīng)盡量保存在不會(huì)刃人殺赦紡沁比的樣品管（盒）中.3. 對(duì)于強(qiáng)光下不穩(wěn)定的化合物，測(cè)試時(shí)應(yīng)特別注意血仏她血磁, 避免破壞樣品。4. 粉體和微晶樣品一般夾在適速趣屋進(jìn)行測(cè)試。42樣品準(zhǔn)備液體1. 溶液樣品盡最便用透明的玻璃化溶液避免在這種匯聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均導(dǎo)致的光譜失真問題。2. 為安全起見，對(duì)于使用揮茨性超翩茄的測(cè)試，一定要有合適的 防護(hù).3. 易揮發(fā)、易變質(zhì)的溶液最好現(xiàn)配現(xiàn)測(cè)

20、。4. 液體樣品一般放在帶蓋石英比色皿（與紫外測(cè)試所用比色皿不同, 為側(cè)面全透明型）中進(jìn)行測(cè)試。43由于物質(zhì)的發(fā)射特性和吸收特性是緊密相關(guān)的.所以提前做 好吸收譜可以有效縮短熒光測(cè)試的摸索時(shí)間。對(duì)于不知道相關(guān)特性的樣品，吸收譜的測(cè)試比熒光光譜的測(cè) 試要容易很多。所以，蠱議卞：彖先測(cè)一下樣品的吸收譜,并從中找出感興44趣的吸收峰和特性、在熒光測(cè)試時(shí)以便參考。光譜測(cè)試1 開機(jī)電源燈源2.發(fā)射譜根據(jù)吸收譜中感興趣的峰確定激發(fā)波長(zhǎng)，選擇合適的發(fā)射譜波長(zhǎng) 范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行發(fā)射譜的掃描。3 激發(fā)譜Hi1=根據(jù)發(fā)射譜中感興趣的峰確定發(fā)射波長(zhǎng)，選擇合適的激發(fā)譜波長(zhǎng) 范圍、濾光片、光路狹縫、掃描速度等進(jìn)行激發(fā)譜的