血紅蛋白的提取和分離學(xué)案

1、血紅蛋白的提取和分離 學(xué)案 課題目標(biāo) 1、嘗試從血液中提取和分離血紅蛋白2、了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理 課題重點(diǎn) 凝膠色譜法的原理和方法 課題難點(diǎn) 1、樣品的預(yù)處理2、色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填 基礎(chǔ)知識(shí) 1凝膠色譜法凝膠色譜法也稱做 ，是根據(jù) 分離蛋白質(zhì)的有效方法。凝 膠實(shí)際上是一些由 構(gòu)成的多孔球體， 在小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道， 相對(duì)分子 質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子通過凝膠時(shí)速度不同，相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì) 進(jìn)入凝膠內(nèi)部 的通道，路程 ，移動(dòng)速度 ；而相對(duì)分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠內(nèi) 部的通道，只能在 移動(dòng)，路程 ，移動(dòng)速度 。相對(duì)分子質(zhì)量不同的 蛋白質(zhì)分子因此得

2、以分離。2緩沖溶液緩沖溶液的作用是 。緩沖溶液通常由 溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進(jìn)行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的 pH 下進(jìn)行的，例如： 血漿的 pH是，要在實(shí)驗(yàn)條件下準(zhǔn)確模擬生物體內(nèi)的過程， 必須保持體外的 pH 與體內(nèi)的基本一致。3電泳電泳是指 。許多重要的生物大分子， 如多 肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH 下，這些基團(tuán)會(huì)帶上。在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷 的電極移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各分子 以及分子本身的 、的不同， 使帶電分子產(chǎn)生不同的，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。兩種常用的電泳方法是 和 ，在測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí) 通常使用 。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰

3、胺凝膠中的遷移率取決于 以及 等因素。4蛋白質(zhì)的提取和分離 蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步： 、 、 和。5樣品處理血液由 和 組成，其中紅細(xì)胞最多。紅細(xì)胞具有 的特點(diǎn)。紅細(xì)胞中有一種非常重要的蛋白質(zhì) ，其作用是，血紅蛋白有 個(gè)肽鏈組成， 包括 ，其中每條肽鏈環(huán) 繞一個(gè) ，磁基團(tuán)可攜帶 。血紅蛋白因含有 呈現(xiàn)紅色。紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是 ，采集的血樣要 及時(shí)采用 分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的 ，將下層暗紅色 的 倒入燒杯，再加入 ，緩慢攪拌 ，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù) 洗滌三次，直至 ，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放 在 和 作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血

4、紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后， 試管中的溶液分為 4 層。第一層為無色 透明的 ，第 2 層為白色薄層固體，是 ，第 3 層是紅色透明液體，這 是 ，第 4 層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶 性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。透析取 1mL的血紅蛋白溶液裝入中，將透析袋放入盛有 300mL的物質(zhì)的量的濃度為 20mmol/L 的 中，透析 12h。透析可以去除樣品中 的雜質(zhì)，或用于 更換樣品的 。6凝膠色譜操作第一步要制作 ，第二步要 ，因?yàn)?，所以裝 柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計(jì)算所需要的凝膠量。在裝填凝膠柱時(shí)， 不得有 存在。

5、因?yàn)闅馀輹?huì) ， 降低分離效果。第三 步7. 凝膠電泳超作判斷純化的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求， 需要進(jìn)行 。在鑒定的方法中， 使 用最多的是 。其中電泳過程中， SDS的 作 用。 能力提升 1. 凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是（ ）A. 對(duì)其他分子的親和力 B. 溶解度C. 所帶電荷多少 D.相對(duì)分子質(zhì)量的大小2. 凝膠色譜法中所用的凝膠化學(xué)本質(zhì)大多是（ ）A. 糖類化合物 B. 脂質(zhì) C. 蛋白質(zhì) D. 核酸3. 選用紅細(xì)胞作為分離蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)材料，有何好處（ ）A. 血紅蛋白是有色蛋白 B. 紅細(xì)胞無細(xì)胞核C. 紅細(xì)胞蛋白質(zhì)含量高D. 紅細(xì)胞 DNA含量高血紅蛋白水溶液其他雜質(zhì)的沉淀血紅素4. 將

6、攪拌好的混合液離心來分離血紅蛋白溶液時(shí)，第二層是（ ）A. 甲苯 B.C. 脂溶性物質(zhì)的沉淀層 D.5. 血紅蛋白因含有（ ）而呈紅色A. O2B. COC. CO2 D.6. 下列操作正確的是（ ）A. 分離紅細(xì)胞時(shí)采用低速長時(shí)間離心B. 紅細(xì)胞釋放出血紅蛋白只需要加入蒸餾水就可C. 分離血紅蛋白溶液是低速短時(shí)間離心D. 透析時(shí)要用 20mmol/l 的磷酸緩沖液，透析 12h7. 樣品的加入和洗脫的敘述正確的是（ ）A. 先加入 1ml 透析后的樣品B. 加樣前要使緩沖液緩慢下降全部流出C. 如果紅色帶均勻一致的移動(dòng)，說明色譜柱制作成功D. 洗脫時(shí)可以用緩沖液也可以用清水8. 下列有關(guān)提取

7、和分離血紅蛋白的程度敘述錯(cuò)誤的是（ ）A. 樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶液B. 通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C. 可通過凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化D. 可通過 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度9. 凝膠色譜法操作正確的是（ ）A. 將橡皮塞上部用刀切出鍋底狀的凹穴B. 將橡皮塞下部切出凹穴C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D. 將尼龍網(wǎng)剪成與橡皮塞下部一樣大小的圓片10. 樣品的加入和洗脫的操作不正確的是（ ）A. 加樣前，打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B. 加

8、樣后，打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C. 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D. 用吸管小心的將 1ml 透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面11. 用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)（ ）A. 路程較長，移動(dòng)速度較慢B. 路程較長，移動(dòng)速度較快C. 路程較短，移動(dòng)速度較慢D. 路程較短，移動(dòng)速度較快12緩沖液的作用是：在一定范圍內(nèi)，抵制外界的影響來維持（）基本不變。A. 溫度B. pH C. 滲透壓D.氧氣濃度13電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（）的電極移動(dòng)。A. 相同B. 相反C. 相對(duì)D.相向14. 哺乳動(dòng)物和人的成熟的紅細(xì)胞中的（）與氧氣的運(yùn)輸有關(guān)。

9、A. 血紅蛋白 B. 肌紅蛋白C. 肌動(dòng)蛋白 D. 肌球蛋白15血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的含量最多。A. 白細(xì)胞 B. 血小板C. 紅細(xì)胞D. 淋巴細(xì)胞16為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)ǎ?。A. NaCl B. 甲苯 C. 蒸餾水 D. 檸檬酸鈉17將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4 層，其中第33 層是（A. 無色透明的甲苯層B.C. 血紅蛋白的水溶液D.脂溶性物質(zhì)的沉淀層 其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物A與蛋白質(zhì)結(jié)合，使其更利于電泳C使蛋白質(zhì)分解成 20 種氨基酸19、紅細(xì)胞洗滌的方法是（）B 能使蛋白質(zhì)完全變性D 使蛋白質(zhì)更易與

10、丙烯酰胺結(jié)合18、 SDS在電泳中作用是（）A加等體積的 NaCl 溶液（ 0.9%），緩慢攪拌 10min，低速短時(shí)間離心B加五倍體積的 NaCl 溶液（ 0.9%），緩慢攪拌 10min ，低速短時(shí)間離心C加等體積的 NaCl 溶液（ 0.9%），緩慢攪拌 10min，高速短時(shí)間離心D加五倍體積的 NaCl 溶液（ 0.9%），緩慢攪拌 10min ，高速短時(shí)間離心 20、向洗滌好的紅細(xì)胞倒入燒杯中，A苯B 甲苯 C 21、交聯(lián)葡聚糖凝膠（ SephadexABC加蒸餾水到原血液體積， 再加 （）可使血紅蛋白的釋放。乙醇 G 75）D NaCl 溶液中， 75 表示（凝膠的不同種類能通過該

11、糖凝膠的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量 凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍 凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水D22、血紅蛋白溶液透析用的緩沖溶液是（A 20mmol/L 的磷酸緩沖溶液（ pH=7.0）C 20mmol/L 的碳酸緩沖溶液（ pH=7.0） 23、紅細(xì)胞含有大量血紅蛋白， 帶 O2 或 CO2，我們可以選用豬、 請(qǐng)回答下列有關(guān)問題： （1）血紅蛋白的提取和分離一般可分為四步： 和7.5 克)B 20mmol/LD 30mmol/L的磷酸緩沖溶液（ pH=6.0） 的磷酸緩沖溶液（ pH=7.0） 紅細(xì)胞的機(jī)能主要是由血紅蛋白完成， 牛、羊或其他脊椎動(dòng)物的血液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血紅蛋白的主要功能是攜

12、 來提取和分離血紅蛋白。（2）實(shí)驗(yàn)前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進(jìn)行離心， 收集血紅蛋白溶液。 加入檸檬酸鈉的目的是以上所述的過程即是樣品處理， 它包括 、 、分離 血紅蛋白溶液、透析。（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。透析的目的是。透析的原理是。（ 4）然后通過凝膠色譜法將樣品進(jìn)一步純化，最后經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定。樣品純化的目的是 。24. 電泳利用了待分離樣品中各種分子 以及 、 的不同，使帶 電分子產(chǎn)生不同的遷移速率，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。答案： 1. D 2.A 3.A 4.C 5.D 6.D 7.C 8.B 9.A 10.D11 D 12 B