電 子 順 磁 共 振ESR-chemstry-1

1、電電 子子 順順 磁磁 共共 振振 (EPR, ESR) 的的 實實 驗驗 方方 法法 揚州大學測試中心揚州大學測試中心 June 22, 2021 一一. 電子順磁共振的基本概念電子順磁共振的基本概念 二二. 電子順磁共振的實驗裝置電子順磁共振的實驗裝置 三三. 電子順磁共振的新技術方法電子順磁共振的新技術方法 四四. 時間分辨電子時間分辨電子順磁順磁共振共振波譜儀波譜儀 目目 錄錄 磁共振技術磁共振技術 核與外磁場核與外磁場 電子與外磁場電子與外磁場 核自旋核自旋 電子自旋電子自旋 NMR波譜波譜 EPR波譜波譜 躍遷躍遷-吸收吸收 躍遷躍遷-吸收吸收 108 Hz, 射頻射頻 1010

2、Hz , 微波微波 I0 S 0 檢測樣品中的核躍遷檢測樣品中的核躍遷 樣品中的未成對電子的躍遷樣品中的未成對電子的躍遷 1H、 13C 、 31P 自由基、Fe3+、 Cu2+、 Mn2+ 核磁共振核磁共振 NMR電子順磁共振電子順磁共振 EPR （自旋和磁矩）（自旋和磁矩） * 軌道運動 和 自旋自旋運動， * 運動產生相應的磁矩磁矩 ， 軌道磁矩和自旋磁矩， 99%為自旋磁矩。 EPR （electron paramagnetic resonance） ESR （electron spin resonance） * 磁矩 0 的物質是的物質是順磁性物質順磁性物質 =0 成對電子成對電子

3、unpaired electrons 不不成對電子成對電子 一一.電子順磁共振電子順磁共振的基本概念的基本概念 1. 電子在原子中的運動電子在原子中的運動 E下 = -1/2 ge .e .H （低能量，下能態(tài)） E上 = +1/2 ge .e .H （高能量，上能態(tài)） ge 是電子的波譜分裂因子=2.0023（無量綱） e 是玻爾磁子， 9.27 x 10-21 爾格/高斯 電子自旋在磁場中的能級分裂稱為電子自旋在磁場中的能級分裂稱為Zeeman分裂。分裂。 二個能級的能量之差： E= ge .e .H 2 電子在直流磁場中的行為電子在直流磁場中的行為 - 能級分裂能級分裂 E= ge .e

4、 .H E下 = -1/2 ge .e .H E上 = +1/2 ge .e .H H0 H N S H=0 電磁輻射能量 h 剛好滿足兩個能級之間的能量差 E 電子從下能級躍遷到上能級 一般情況下 EPR信號十分微弱，被噪聲所淹沒。 經過電子學處理后經過電子學處理后 (用高頻小調場的工作方式用高頻小調場的工作方式 和相敏檢波器）和相敏檢波器）檢測其共振的一次微分信號檢測其共振的一次微分信號。 自由電子在直流 磁場中吸收電磁輻射，從低能級躍遷到上能級的現(xiàn)象 。 3電子順磁共振的共振條件電子順磁共振的共振條件 h g. .H 電子順磁共振的條件為：電子順磁共振的條件為： h = g . .H 什

5、么是電子順磁共振？什么是電子順磁共振？ 在自旋體系中除了電子自旋而外還存在有磁性核時， 除了電子自旋Zeeman分裂分裂項外，還有電子自旋電子自旋-核自旋超精細相互作用核自旋超精細相互作用項。 S 為電子自旋量子數(shù) I 為核自旋量子數(shù)， a 是超精細分裂譜線的間隔，稱為超精細分裂常數(shù)。 例如：一個 | I | =1/2， |S| = 1/2的最簡單的體系 。 能級間允許躍遷的選擇定律：Ms= 1，MI= 0 4. 超精細相互作用（超精細相互作用（Hyperfine interaction） Ms +1/2 1/2 MI +1/2 I V +1/2 I 1/2 III 1/2 II H H =

6、0 H 這時電子順磁共振電子順磁共振: Htotal = HZeeman+Hhfs = ge .e . S . H + a. S . I Hyperfine helps us determine molecular structure Simple hyperfine interaction No hyperfine interaction Multiple hyperfine interactions I=0 I1=1/2, 1 I2=1, 1 I=1/2, 27 溶液自由基波譜溶液自由基波譜, 多數(shù)情況下含有多個磁性核，有復雜的超精細結構。多數(shù)情況下含有多個磁性核，有復雜的超精細結構。 溶

7、液自由基波譜中，溶液自由基波譜中，電子自旋（S=1/2）和核自旋 (I=1/2 核) 相互作用形成波譜的解析可解析可 以用以用二項式系數(shù)表示法。二項式系數(shù)表示法。 核數(shù)核數(shù) 能級分裂能級分裂 允許躍遷允許躍遷 相對強度相對強度 a 0 2 1 1 b 1 4 2 1 1 c 2 8 3 1 2 1 d 3 16 4 1 3 3 1 4 32 5 1 4 6 4 1 5 64 6 1 5 10 10 5 1 6 128 7 1 6 15 20 15 6 1 n 2n+1 n+1或或2nI+1 (1+x)n 二項式系數(shù)二項式系數(shù) 二項式系數(shù)二項式系數(shù) (1+x)n = 1 + nx + n(n -

8、1)/ 2 ! x2 + + xn 譜線強度譜線強度 h - spin concentration, 自旋濃度。 寬度寬度 H - Relaxation, 弛豫，Weak hyperfine interactions and/or anisotropic interactions 。 波譜分裂因子波譜分裂因子 g值-resonance position， 可以用來判斷被檢測的自由基或其它順磁中心， 微環(huán)境結構特點。 超精細分裂常數(shù)超精細分裂常數(shù) a - hyperfine splitting constant，電子自旋與核自旋相互作用。 5 EPR波譜的波譜的 參數(shù)參數(shù) H 對象：對象：*自由

9、基自由基(Free radical) 電子層的最外層具有單電子單電子的原子、分子或離子并且能獨立存在。 例如: 單基：四甲基哌啶 (TEMPO) 雙基(Biradical)或多基（Polyradical） 三重態(tài)分子（Triplet molecule） 氣體分子：O2 , NO, NO2 * 過渡金屬離子和稀士離子：過渡金屬離子和稀士離子： 原子軌道上有未成對電子，在電子層的內層。 Mo5+ 3d 1 S= 1/2 Fe3+ Mn2+ 3d 5 5/2 1/2 Fe2+ 3d 6 2 0 Co2+ 3d 7 3/2 1/2 Cu2+ 3d 9 1/2 Cu+ 3d 10 0 6. EPR技術的

10、研究對象和主要優(yōu)缺點技術的研究對象和主要優(yōu)缺點 O N . R *晶格缺陷晶格缺陷 優(yōu)點：優(yōu)點： 1. 靈敏度高 10-14 mol/L 2. 分辨率高 mGauss 3. 無干擾和破壞。 4. 樣品不需要特殊的分離和制備。 缺點：缺點： 要求樣品有順磁性。 電子順磁共振電子順磁共振是探測和研究是探測和研究自由基、金屬配合物自由基、金屬配合物最權威的手段之一。最權威的手段之一。 只有EPR才能不容置疑的檢測到不成對電子不成對電子。 7. EPR技術的應用技術的應用 EPR具有獨特的識別順磁物質的能力。EPR樣品對局部區(qū)域環(huán)境是非常靈敏的, 因此可以闡明不成對電子附近的分子結構。 闡明分子的運動

11、或流動的動態(tài)過程。在在 化學、物理、生物、地質、考古、材料科學、醫(yī)藥科學和工業(yè)化學、物理、生物、地質、考古、材料科學、醫(yī)藥科學和工業(yè)等等許多領域等方面獲 得廣泛的應 用， 特別是電子順磁共振新技術應用于不具有成對電子的物質， 在生 物學中的應用，已經成為研究細胞膜結構唯一的有效方法。細胞膜結構唯一的有效方法。 - 自由基反應動力學自由基反應動力學, , - 聚合反應聚合反應, , - 自旋捕獲自旋捕獲 - 有機金屬化合物有機金屬化合物, , -氧化、還原過程氧化、還原過程 - 石油研究石油研究 - 光化學光化學反應動力學反應動力學, , - 雙基和三重態(tài)分子雙基和三重態(tài)分子 - 催化催化 -

12、磁化率的測量磁化率的測量, , - 過渡金屬過渡金屬, 鑭和錒離子鑭和錒離子 - 導體和半導體中的傳導電子導體和半導體中的傳導電子, , - 晶體缺陷晶體缺陷(堿鹵化物中色心堿鹵化物中色心) - 磁共振磁共振, 分子受激態(tài)的光檢測分子受激態(tài)的光檢測, , - 單晶中的晶場單晶中的晶場 - 低溫下的再復合低溫下的再復合 化學化學 , , - 物理物理 - 高分子聚合物性質高分子聚合物性質 - 光纖的缺陷光纖的缺陷 - 涂料聚合物的光老化涂料聚合物的光老化 - 有機導體有機導體 - 新型磁體材料的性質新型磁體材料的性質 - 寶石缺陷寶石缺陷 - 高溫超導體高溫超導體 - C60化合物化合物 - 腐

13、蝕中的自由基特性腐蝕中的自由基特性 - 激光材料激光材料 - 考古年代學考古年代學 - 半導體中雜質和缺陷的影響半導體中雜質和缺陷的影響 -電離輻照影響及損傷電離輻照影響及損傷 - 食品輻照的控制食品輻照的控制 - 丙氨酸輻照計量學丙氨酸輻照計量學 - 輻照對生物化合物的影響輻照對生物化合物的影響 - 輻照產生短壽命有機自由基的行為輻照產生短壽命有機自由基的行為 材料研究材料研究 - 自旋標記和自旋探針技術自旋標記和自旋探針技術 - 自旋捕獲自旋捕獲 - 000活體和體液中的自由基活體和體液中的自由基 - 光化學和輻射分解產生自由基光化學和輻射分解產生自由基 - 氧自由基氧自由基 - 生物系統(tǒng)

14、中的一氧化氮生物系統(tǒng)中的一氧化氮 - 抗氧化劑和自由基清除劑抗氧化劑和自由基清除劑 - 分子分子病理和分子藥理的研究病理和分子藥理的研究 - 藥物檢驗藥物檢驗, 代謝和毒性代謝和毒性 - 酶反應，酶反應， - 氧化還原反應氧化還原反應 - 光合成光合成 - 致癌機制致癌機制 生物和醫(yī)學生物和醫(yī)學 工業(yè)應用工業(yè)應用 - 定量定量EPR檢測檢測 -石油化工產品石油化工產品 -香煙香煙 -食品工業(yè)食品工業(yè) Microwave SourceCirculatorDetector Transmission lines Magnet, Cavity/resonator 一臺現(xiàn)代的波譜儀必須包含下列六大部分：

15、一臺現(xiàn)代的波譜儀必須包含下列六大部分： （1）微波系統(tǒng)微波系統(tǒng) （2）磁場系統(tǒng)磁場系統(tǒng) （3）諧振腔系統(tǒng)）諧振腔系統(tǒng) （4）電子線路電子線路( 含信號通道含信號通道 ) （5）電源系統(tǒng)電源系統(tǒng) （6） 計算機計算機 Signal channels 100KHz Oscilator Display, save (Computer) Power Supply Field controller Magnet system Microwave system Cavity 2. EPR波譜儀的主要組成單元和工作過程波譜儀的主要組成單元和工作過程 Microwave source and detector

16、 PC (user interface) Sample probehead (cavity) Electromagnet Spectrometer electronics 典型的一臺典型的一臺電子順磁共振波譜儀電子順磁共振波譜儀 Standard cavity Irra cavity Double cavity 諧振腔諧振腔 (Cavity) Q=26000 3. ESR波譜儀的主要指標波譜儀的主要指標 (1)、靈敏度：、靈敏度： 指能檢測出ESR信號的最低的樣品濃度或自旋粒子數(shù)。 (2)、分辨率、分辨率 用能分辨的兩條線之間的最小間距d或d/H0表示。 (3)、穩(wěn)定性、穩(wěn)定性 儀器長時間運轉

17、基線的漂移和同一樣品反復測量的誤差 。 (4)、多功能性、多功能性 指添加適當?shù)母郊?，使一臺波譜儀具有更多的功能。 液氮變溫系統(tǒng)液氮變溫系統(tǒng) temperature range : 100K to 500K 液氦液氦變溫系統(tǒng)變溫系統(tǒng) temperature range : 3.8K to 300K （ER 4112HV） 自旋標記自旋標記EPR， 自旋捕捉自旋捕捉EPR， 低溫低溫EPR。 自旋標記是將某些穩(wěn)定的自由基按照共價或非共價的方式 加到被研究的體系上，然后借助于這些自由基的ESR波譜來分析 該體系微觀的結構、運動狀態(tài)和理化特性，實現(xiàn)了非順磁性物質 的電子順磁共振研究。 這些穩(wěn)定的自由

18、基就是自旋標記物（Spin label）。 實驗室經常使用的氮氧自由基衍生物。 三三. 電子順磁共振電子順磁共振(EPR)的新技術的新技術 1. 自旋標記電子順磁共振（自旋標記電子順磁共振（Spin labeling-ESR） 自旋標記物代表性商品的結構: (a)TEMPO四甲基哌啶; (b)Maleimide馬來酰亞胺; (c)nDS硬脂酸. Effects from molecular motion Free tumbling Strongly immobilized Moderately immobilized （1 1） 5 5DS自旋標記人紅細胞膜，獲得自旋標記人紅細胞膜，獲得膜分子

19、膜分子的運動信息。的運動信息。 S S 0.568 0.568 ( A( A/ / - A - A ) / ( A) / ( A/ / +2A +2A )/3)/3 S/W (2) 馬來酰亞胺（馬來酰亞胺（ MSL）自旋標記物能研究）自旋標記物能研究蛋白質分子蛋白質分子的平均構象的平均構象 和旋轉相關時間和旋轉相關時間c 。 c 6.5 10-10 H(0) (h(0)/h(-1)1/2 + (h(0)/h(+1)1/2 2 秒 3 四甲基哌啶（四甲基哌啶（TEMPO）自旋標記物用于研究水脂混合體系中）自旋標記物用于研究水脂混合體系中 水相與脂相的分離情況。水相與脂相的分離情況。 分離系數(shù)分離

20、系數(shù)f = H/(H+P) * 捕捉劑捕捉劑 DMPO, POBN tNB.等，不同的捕捉劑所具有的捕捉效率和所等，不同的捕捉劑所具有的捕捉效率和所 提供的信息不完全相同。同一種捕捉劑對不同的自由基的波譜不同。提供的信息不完全相同。同一種捕捉劑對不同的自由基的波譜不同。例如: 自由基（短）自由基（短）+自旋捕捉劑自旋捕捉劑 自旋自旋加合物加合物 （稍長）（稍長） OH DMPO +OH DMPO-OO(H) aN=1.46 mT, aH=1.48 mT g=2.0054 1: 2: 2: 1 四重峰四重峰 加合物半衰期壽命 達30分鐘。 N H OH O 2 . 自旋捕捉（自旋捕捉（Spin

21、trapping）-短壽命自由基短壽命自由基 3. 低溫低溫- EPR 漆酶漆酶Laccase II型型Cu2+ 2+(I=3/2) 酶及配位的組氨酸 酶及配位的組氨酸 咪唑咪唑N引起的超精細分裂引起的超精細分裂: 2N, 4N g = 2.25 , g= 2.05 LN：77K、 140-340K 生物樣品 例如：缺血再灌心肌，77K g = 2.03-2.05, g = 2.005 g(Fe-S) = 1.94 LHe： 4K、 4-300K 過渡金屬離子. 例如：4.2K MgO 基質中 Fe+和Co2+ (59Co,I=7/2) g(Fe) 4.13, g(Co) 4.34, A（Co

22、）=45G 20世紀未期，世紀未期，ESR技術又有較大的發(fā)展。主要歸結為四個方面：技術又有較大的發(fā)展。主要歸結為四個方面： 從頻率域進入時間域，建立了脈沖ESR技術； 從單一頻率進入多頻共振檢測； 從一維波譜進入二維顯示及三維成象； 強大的計算機軟，硬件功能、改進譜儀管理和數(shù)據(jù)處理能力。 電子電子順磁順磁共振共振波譜技術波譜技術 是是探測和研究探測和研究自由基自由基最權威的手段之一，但是最權威的手段之一，但是 用常規(guī)的用常規(guī)的ESR波譜儀不能直接檢測波譜儀不能直接檢測 短壽命自由基和特別低濃度的自由基。短壽命自由基和特別低濃度的自由基。 例如 - OH（壽命 10-9秒）， RO - （壽命 10-6秒） ， NO -（壽命 3-5秒）等。 短壽命自由基的檢測方法短壽命自由基的檢測方法: （1）自旋捕捉法 短壽命自由基 +捕捉劑捕捉劑 自旋加合物 （2） 低溫冷凍法： 延長自由基的存在壽命。 四四. 時間分辨時間分辨電子電子順磁順磁共振