時(shí)間分辨熒光免疫分析

1、5-2 時(shí)間分辨熒光免疫分析時(shí)間分辨熒光免疫分析 鄭鵠志鄭鵠志 西南大學(xué)西南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 發(fā)展歷程發(fā)展歷程 19791979年，可標(biāo)記抗體的年，可標(biāo)記抗體的EuEu3+ 3+- - - -二酮體二酮體-EDTA-EDTA 19831983年，建立時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)，用于測(cè)年，建立時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)，用于測(cè) 定定HCGHCG和磷酸酯酶和磷酸酯酶A A “鑭系元素時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)及儀器的配鑭系元素時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)及儀器的配 套研究套研究”獲獲20032003年度國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)年度國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng) 一、時(shí)間分辨熒光免疫分析特點(diǎn)一、時(shí)間分辨熒光免疫分析特點(diǎn) 1.1.

2、熒光衰減時(shí)間長熒光衰減時(shí)間長 鑭系元素?zé)晒馑プ儠r(shí)間 常見熒光物質(zhì)熒光壽命常見熒光物質(zhì)熒光壽命 熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)熒光壽命熒光壽命 Eu3+714 s 非特異性熒光背景非特異性熒光背景1-10 ns 人血清白蛋白人血清白蛋白4.1 ns 人球蛋白、血紅蛋白人球蛋白、血紅蛋白3.0 ns 細(xì)胞色素細(xì)胞色素C3.5 ns FITC4.5 ns 丹磺酰氯丹磺酰氯14 ns 苯胺萘磺酸苯胺萘磺酸16 ns 稀土螯合物稀土螯合物104 -106 ns 2. Stokes位移大位移大 熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)激發(fā)波長激發(fā)波長發(fā)射波長發(fā)射波長Stokes位移位移 Eu-(-NTA)3340 nm613 nm273 nm

3、 Sm-(-NTA)3340 nm600 nm260 nm Tb-(PTA)3295 nm490/543 nm195/248 nm Dy-(PTA)3295 nm573 nm278 nm 鑭系元素發(fā)射峰窄 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高（靈敏度高（1010-18 -18mol/ mol/孔）孔） 原子標(biāo)記原子標(biāo)記 多標(biāo)記技術(shù)多標(biāo)記技術(shù) 二、時(shí)間分辨熒光免疫分析體系二、時(shí)間分辨熒光免疫分析體系 非均相時(shí)間分辨熒光免疫分析非均相時(shí)間分辨熒光免疫分析 均相時(shí)間分辨熒光免疫分析均相時(shí)間分辨熒光免疫分析 （一）非均相時(shí)間分辨熒光免疫分析（一）非均相時(shí)間分辨熒光免疫分析 時(shí)間分辨固相免疫分析時(shí)間分辨固相免疫分析 解離

4、增強(qiáng)熒光免疫分析解離增強(qiáng)熒光免疫分析 酶放大免疫分析酶放大免疫分析 1.1.時(shí)間分辨固相免疫分析時(shí)間分辨固相免疫分析 靈敏度一般不高靈敏度一般不高 實(shí)例實(shí)例 加拿大加拿大Cyber Fluor的的FIAgen系統(tǒng)系統(tǒng) Eu3+-BCPDA為標(biāo)記物為標(biāo)記物 2.2.解離增強(qiáng)分析解離增強(qiáng)分析 原理示意圖原理示意圖 （1 1）雙功能螯合劑）雙功能螯合劑 EDTA衍生物、衍生物、DTTA衍生物、衍生物、DTPA衍生物衍生物 一端與鑭系離子螯合，一端與抗原一端與鑭系離子螯合，一端與抗原/抗體連接抗體連接 近中性時(shí)，螯合物足夠穩(wěn)定近中性時(shí)，螯合物足夠穩(wěn)定 酸性條件下，鑭系離子迅速、徹底釋放酸性條件下，鑭系

5、離子迅速、徹底釋放 Eu-DTTA應(yīng)用最廣泛應(yīng)用最廣泛 （2 2）增強(qiáng)液）增強(qiáng)液 增強(qiáng)原理圖增強(qiáng)原理圖 一般增強(qiáng)百萬倍一般增強(qiáng)百萬倍 -NTA：Eu(-NTA)3(TOPO)2復(fù)合物復(fù)合物 TOPO：熒光增強(qiáng)協(xié)同劑：熒光增強(qiáng)協(xié)同劑 Triton X-100：表面活性劑，形成膠束：表面活性劑，形成膠束 醋酸：酸性介質(zhì)醋酸：酸性介質(zhì) （3 3）酶放大）酶放大 酶催化底物，生成的產(chǎn)物與溶液中鑭系離酶催化底物，生成的產(chǎn)物與溶液中鑭系離 子、螯合劑生成熒光強(qiáng)、壽命長的三元復(fù)子、螯合劑生成熒光強(qiáng)、壽命長的三元復(fù) 合物合物 ALP 酶放大免疫分析示意圖酶放大免疫分析示意圖 雙標(biāo)記測(cè)定雙標(biāo)記測(cè)定AFP和和-h

6、CG -NTA作為螯合劑作為螯合劑 340 nm 激發(fā)，激發(fā)，Eu:615 nm, 820 s；Sm:643 nm, 88 s （二）均相免疫分析（二）均相免疫分析 基于時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移基于時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移 無需洗滌、分離、加增強(qiáng)液無需洗滌、分離、加增強(qiáng)液 TBP-Eu：Eu3+-二吡啶二胺，最大發(fā)射二吡啶二胺，最大發(fā)射 615nm，供體，供體 APC：別藻藍(lán)蛋白，最大發(fā)射：別藻藍(lán)蛋白，最大發(fā)射665nm，受，受 體體 能量轉(zhuǎn)移效率最高的供體能量轉(zhuǎn)移效率最高的供體/受體對(duì)受體對(duì) 時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析示意圖時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析示意圖 三、時(shí)間分辨免疫分析方

7、法三、時(shí)間分辨免疫分析方法 夾心法夾心法 競(jìng)爭法競(jìng)爭法 間接法 捕獲法 生物素-親和素放大法 1. 夾心法夾心法 雙抗體夾心法雙抗體夾心法 雙抗原夾心法雙抗原夾心法 2. 競(jìng)爭法競(jìng)爭法 3. 間接法間接法 間接法測(cè)定間接法測(cè)定HCV抗體抗體 4. 捕獲法捕獲法 捕獲法測(cè)定抗捕獲法測(cè)定抗-CMV IgM 5. 生物素生物素-親和素法親和素法 生物素生物素-親和素檢測(cè)親和素檢測(cè)PAPP-A 四、應(yīng)用四、應(yīng)用 1. 1. 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè) 2. 2. 傳染病檢測(cè)傳染病檢測(cè) 3. 3. 糖尿病檢測(cè)糖尿病檢測(cè) 4. 4. 激素檢測(cè)激素檢測(cè) 5. 5. 細(xì)胞活性檢測(cè)細(xì)胞活性檢測(cè) 1.腫瘤標(biāo)志物

8、 AFP測(cè)定：雙抗體夾心法 固相包被抗體 加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 加入Eu標(biāo)記抗體 加入增強(qiáng)液 測(cè)定熒光 靈敏度：0.17 U/ml 2. 傳染病檢測(cè) 梅毒螺旋體抗體檢測(cè)：雙抗原夾心法 強(qiáng)陽性血清和正常人血清分別作為陰陽對(duì)照 陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和樣品加入板上，孵育 加入銪標(biāo)記抗原，孵育 加入增強(qiáng)液，檢測(cè)熒光 符合中國藥品生物制品鑒定所結(jié)果 3.糖尿病檢測(cè) C-肽檢測(cè)：雙抗體夾心法 抗體包被微孔板 加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品 加入銪標(biāo)記抗體 增強(qiáng)液，檢測(cè)熒光 靈敏度：0.08ng/ml 4.激素檢測(cè) 三碘甲狀腺原氨酸（T3）：競(jìng)爭法 微孔板中加入抗體 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品、銪標(biāo)記T3 加入增強(qiáng)液，測(cè)定熒光 靈敏度：0.21ng/ml 5.細(xì)胞活性檢測(cè) 測(cè)定細(xì)胞活性原理圖 T T：靶細(xì)胞：靶細(xì)胞