食物中氨基酸的測(cè)定方法

1、食物中氨基酸的測(cè)定方法測(cè)定食物中的胱氨酸使用過(guò)甲酸氧化 -氨基酸自動(dòng)分析儀法，測(cè)定色氨酸使用熒光分 光光度法，測(cè)定其它氨基酸使用氨基酸自動(dòng)分析儀法。一、氨基酸自動(dòng)分析儀法1. 原理 食物蛋白質(zhì)經(jīng)鹽酸水解成為游離氨基酸，經(jīng)氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，與茚三 酮溶液產(chǎn)生顏色反應(yīng)，再通過(guò)分光光度計(jì)比色測(cè)定氨基酸含量。一份水解液可同時(shí)測(cè)定 天冬，蘇，絲，谷，脯，甘，丙，纈，蛋，異亮，亮，酪，苯丙，組，賴和精氨酸等 16 種氨基酸，其最低檢出限為 10pmol。2. 適用范圍 GB/T14965-1994 食物中氨基酸的測(cè)定方法。本法適用于食物中的 16 種氨基酸的測(cè)定。其最低檢出限為 10pmol

2、。本方法不適用于蛋 白質(zhì)含量低的水果、蔬菜、飲料和淀粉類食物的測(cè)定3. 儀器和設(shè)備3.1 真空泵3.2 恒溫干燥箱3.3 水解管：耐壓螺蓋玻璃管或硬質(zhì)玻璃管，體積 2030ml。用去離子水沖洗干凈并烘 干。3.4 真空干燥器（溫度可調(diào)節(jié)）3.5 氨基酸自動(dòng)分析儀。4. 試劑 全部試劑除注明外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。4.1 濃鹽酸：優(yōu)級(jí)純4.26mol/L 鹽酸：濃鹽酸與水 1：1 混合而成。4.3 苯酚：需重蒸餾。4.4 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液（儀器制造公司出售） ：0.0025mol/L4.5 緩沖液：4.5.1 pH2.2 的檸檬酸鈉緩沖液：稱取 19.6g 檸檬酸鈉（ Na3C6H5O

3、7.2H2O）和 16.5ml 濃 鹽酸加水稀釋到 1000ml，用濃鹽酸或 50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 2.24.5.2 pH3.3 的檸檬酸鈉緩沖液：稱取 19.6g 檸檬酸鈉和 12ml 濃鹽酸加水稀釋到 1000ml，用濃鹽酸或 50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至 pH 至 3.3。4.5.3 pH4.0 的檸檬酸鈉緩沖液：稱取 19.6g 檸檬酸鈉和 9ml 濃鹽酸加水稀釋到 1000ml， 用濃鹽酸或 50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 4.0。4.5.4 pH6.4的檸檬酸鈉緩沖液：稱取 19.6g檸檬酸鈉和 46.8g 氯化鈉（優(yōu)級(jí)純）加水稀釋 到 1000ml ，用濃鹽酸或

4、50%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 至 6.4。4.6 茚三酮溶液4.6.1 pH5.2的乙酸鋰溶液：稱取氫氧化鋰（LiOH.H2O ）168g，加入冰乙酸（優(yōu)級(jí)純）279ml， 加水稀釋到 1000ml，用濃鹽酸或 50%的氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH 至 5.2。4.6.2茚三酮溶液：取 150ml二甲基亞砜（ C2H6OS）和乙酸鋰溶液（ 2.6.1）50ml加入4g 水合茚三酮（ C9H4O3.H2O）和 0.12g還原茚三酮（ C18H10O6.2H2O）攪拌至完全溶解。4.7 高純氮?dú)猓杭兌?99.99%。4.8 冷凍劑：市售食鹽與冰按 1：3 混合5. 操作步驟5.1 樣品處理：樣品采集后用勻

5、漿機(jī)打成勻漿（或者將樣品盡量粉碎）于低溫冰箱中冷凍 保存，分析用時(shí)將其解凍后使用。5.2 稱樣：準(zhǔn)確稱取一定量樣品，精確到 0.0001g。均勻性好的樣品如奶粉等，使樣品蛋 白質(zhì)含量在 1020mg 范圍內(nèi)；均勻性差的樣品如鮮肉等，為減少誤差可適當(dāng)增大稱樣 量，測(cè)定前再稀釋。將稱好的樣品防于水解管中。5.3水解：在水解管內(nèi)加 6mol/L鹽酸 1015ml（視樣品蛋白質(zhì)含量而定） ，含水量高的樣 品（如牛奶）可加入等體積的濃鹽酸，加入新蒸餾的苯酚 34 滴，再將水解管放入冷凍 劑中，冷凍 3 5min，再接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近 0psi），然后充入高純氮 氣；再抽真空充氮?dú)?，重?fù)三

6、次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口或擰緊螺絲蓋將已封口的水解 管放在 1101的恒溫干燥箱內(nèi)，水解 22h 后，取出冷卻。 打開(kāi)水解管，將水解液過(guò)濾后，用去離子水多次沖洗水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移到 50ml 容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水定容。吸取濾液 1ml 于 5ml 容量瓶?jī)?nèi)，用真空干燥器在 4050 干燥，殘留物用 12ml 水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行兩次，最后蒸干，用 1mlpH2.2 的緩 沖液溶解，供儀器測(cè)定用。5.4測(cè)定：準(zhǔn)確吸取 0.200ml 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用 pH2.2的緩沖液稀釋到 5ml，此標(biāo)準(zhǔn)稀 釋濃度為 5.00nmol/50L，作為上機(jī)測(cè)定用的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)，用氨基酸自動(dòng)分析儀以外標(biāo)

7、法測(cè)定樣品測(cè)定液的氨基酸含量。6. 計(jì)算 上機(jī)樣品液（ 50mL）中氨基酸量（ nmol） = 上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)液（ 50mL）中氨基酸量（ nmol）樣品峰面積 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)峰面積所以， 100g樣品中氨基酸的 mg 數(shù)= 上機(jī)樣品液中氨基酸量（ nmol） f Mr 100 mV106式中f-樣品的稀釋倍數(shù)Mr-氨基酸的相對(duì)分子量m-樣品質(zhì)量（ g）V-上機(jī)時(shí)的進(jìn)樣量（此處為 50mL）7. 其他7.1 測(cè)定條件（以 Beckman-6300型氨基酸自動(dòng)分析儀為例） 緩沖液流量： 20mL/h；茚三酮流量： 10mL/h； 柱溫： 50、60和 70； 色譜柱： 20cm； 分析時(shí)間： 42min

8、。7.2 標(biāo)準(zhǔn)出峰順序和保留時(shí)間序號(hào) 出峰順序 保留時(shí)間 /min 序號(hào) 出峰順序 保留時(shí)間 /min1 天冬氨酸 5.55 9 蛋氨酸 19.632 蘇氨酸 6.60 10 異亮氨酸 21.243 絲氨酸 7.09 11 亮氨酸 22.064 谷氨酸 8.72 12 酪氨酸 24.525 脯氨酸 9.63 13 苯丙氨酸 25.766 甘氨酸 12.24 14 組氨酸 30.417 丙氨酸 13.10 15 賴氨酸 32.578 纈氨茇 16.65 16 精氨酸 40.757.3 允許差： 同實(shí)驗(yàn)室平行測(cè)定或連續(xù)兩次測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差絕對(duì)值 12%二、食物中胱氨酸的測(cè)定方法 -氨基酸自動(dòng)分析儀

9、法（過(guò)甲酸氧化）1. 原理 在用鹽酸水解蛋白質(zhì)的過(guò)程中，胱氨酸易被破壞，現(xiàn)多采用過(guò)甲酸氧化法將蛋白質(zhì)中的 胱氨酸及半胱氨酸氧化成半胱磺酸，其反應(yīng)如下：SH NH2 O SO3H NH2 OCH2 CH COOH+3H C OOH CH2 CH COOH+3H C OH 半胱氨酸 過(guò)甲酸 半胱磺酸 甲酸 生成的半胱磺酸可在氨基酸自動(dòng)分析儀上進(jìn)行測(cè)定，與標(biāo)準(zhǔn)半胱磺酸比較，計(jì)算其含量。2. 適用范圍 參照中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所編寫(xiě)的食物營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定法第三版。適 用于食物中胱氨酸的測(cè)定。3. 儀器水解瓶：耐壓螺蓋玻璃管或硬質(zhì)試管，體積 20 30mL，用去離子水沖凈并烘干，電熱減 壓蒸

10、發(fā)器。4. 試劑過(guò)甲酸：取 9mL 分析純甲酸加入 1mL30%過(guò)氧化氫混合，在室溫放置 2 小時(shí)以上。5. 操作步驟5.1 過(guò)甲酸氧化：稱取一定量的食物樣品置于水解瓶中，使樣品含蛋白質(zhì)在510mg，加入 1mL 過(guò)甲酸試劑，在室溫放置 3 小時(shí)。加 1mL 乙醇終止氧化。將樣品瓶置于電熱減 壓器中，于 45減壓蒸干，用 1mL 去離子水淋洗瓶壁，再蒸干，反復(fù) 3 次，以除去過(guò)甲 酸。5.2 鹽酸水解：同食物中氨基酸（ 16 種）測(cè)定方法5.3在 Bekman6300氨基酸自動(dòng)分析儀上，在注文 50時(shí)用 pH3.25檸檬酸緩沖液洗脫， 半胱磺酸的出峰時(shí)間約在 1.78 分鐘。6. 計(jì)算 上機(jī)樣

11、品液（ 50l ）中半胱磺酸量 = 上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)液中半胱磺酸量（ nmol）樣品峰面積 半胱磺酸標(biāo)準(zhǔn)峰面積100g樣品中胱氨酸 mg 數(shù)= 上機(jī)樣品中半胱磺酸量（ nmol） DM100 WE1062式中D：樣品稀釋倍數(shù)M ：胱氨酸分子量（ ng）W ：稱樣量（ g）E：上機(jī)時(shí)的進(jìn)樣量（此處為 50l ）三、食物中色氨酸的測(cè)定 -熒光分光光度法1. 原理 食物中蛋白質(zhì)在酸水解過(guò)程中，其色氨酸極易被分解，本法用堿水解蛋白質(zhì)，直接測(cè)定 色氨酸的天然熒光。 在蛋白質(zhì)水解液中， 只有色氨酸和酪氨酸可以檢測(cè)到熒光。 在 pH 為 11時(shí)，色氨酸的熒光強(qiáng)度比酪氨酸大 100倍，且兩種氨基酸的熒光峰相差 40多

12、 nm，利 用此特點(diǎn)，可在有大量酪氨酸的存在下，檢測(cè)色氨酸的含量。2. 適用范圍 參照中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所編寫(xiě)的食物營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定法第三版。適 用于食物中色氨酸的測(cè)定。3. 儀器3.1 熒光分光光度計(jì)3.2 減壓蒸發(fā)器3.3 螺旋蓋大口瓶（瓶蓋要有橡皮墊）3.4 聚四氟乙烯管3.5 小玻璃球3.6 烘箱4. 試劑（1）5mol/L NaOH ：內(nèi)含 0.5%可溶性淀粉，臨用前配制。（2）4mol/L 尿素（ pH=11）（3）6mol/L 鹽酸（4）溴百里酚藍(lán)指示劑： 稱取 0.1g溴百里酚藍(lán)加 0.1mol/L 氫氧化鈉 1.6ml，配成 0.05%水溶液5） 高純氮（含量

13、99.999%）（6） 辛醇甲苯溶液：內(nèi)含 1%辛醇（7） 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)液：（1mg/ml）：稱取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)， 用 0.005mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解， 貯存于冰箱保存。5. 操作步驟5.1稱取含粗蛋白質(zhì)約 5mg的食物樣品，置于聚四氟乙烯管中， 加含可溶性淀粉的 5mol/L 氫氧化鈉 1ml，加入 1 滴辛醇。5.2 將各管分別蓋上小玻璃球，放入 1 只帶螺旋蓋的大口玻璃瓶中，將瓶置于減壓蒸發(fā)裝 置中，加冰和鹽降溫，減壓至真空度 1.3Kpa10mmHg 以下，繼續(xù)保持 15min，充氮?dú)庠?減壓，如此反復(fù) 3 次，迅速旋緊大口瓶的螺旋蓋。5.3 將充氮?dú)獾拇罂谄恐糜诳鞠鋬?nèi)，在 110水解樣品 22小時(shí)。5.4冷卻大口瓶，用重蒸餾水將樣品分別洗至 25ml容量瓶中，（內(nèi)含 6N Hcl 0.7ml ）用溴 百里酚藍(lán)為指示劑調(diào) pH 至中性，用重蒸水定容至刻度。5.5 吸取樣品液 1ml，于 10ml 帶蓋試管內(nèi)，用 pH11 的 4mol/L 尿素溶液稀釋至刻度，在 激發(fā)波長(zhǎng)為 280nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 360mm下測(cè)定熒光強(qiáng)度， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)色氨酸的熒光強(qiáng)度曲 線，